Характеристика экспериментальных животных и биологического материала

Характеристика экспериментальных животных и биологического материала

Для изучения стресс-протекторной активности метаболических средств нами была использована модель 25%-ного иммобилизационного стресса по И.А. Коломейцевой (1988), предложенная В.П. Балашовым и соавт. в 2002 году для оценки безопасности потенциальных противоаритмических средств как наиболее простой, дешевый и адекватный метод. Иммобилизационный стресс воспроизводили ежедневным помещением животных в тесные пеналы объемом 42 см³, ограничивающие подвижность животных. Длительность иммобилизации составляла 6 часов (25%) в течение 30 дней. Исследуемые соединения вводили ежедневно однократно внутрибрюшинно до стресса в объеме 0,2 мл на инъекцию в эффективных дозах.

Животные были разделены на пять групп: 1- интактные мыши (контроль); 2 – животные, подвергнутые хронической иммобилизации; 3 - животные, подвергнутые хронической иммобилизации и получающие мексидол (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю), 4 – те же условия + неотон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю), 5 - те же условия + димефосфон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю). О токсическом эффекте лекарственных препаратов судили по показателю смертности животных.

Электронно-микроскопическое исследование миокарда

Для электронно-микроскопического исследования миокарда левого желудочка проводили проводку и заливку материала по традиционному методу. Кусочки ткани фиксировали в 3% глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) в течение 12 часов при 4⁰ С. После промывки 0,15 М фосфатным буфером (3 смены) проводили постфиксацию 2% растворе осмиевой кислоты в течение 2 часов при 4⁰ С, далее кусочки проводили через батарею спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50⁰, 70⁰, 96⁰, -1 смена по 30 минут при 4⁰ С и 100⁰ – 3 смены по 30 минут при 18⁰ С) и окиси пропилена. Перед заливкой производили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в отношении 1:1 в течение 3 часов, далее кусочки помещали в заливочную смесь эпоксидных смол на 30 минут при 60⁰С. Заливку осуществляли с использованием смеси эпоксидных смол эпон-аралдит (Mollenchauer., 1964) с последующей полимеризацией в течение 2- суток при 60⁰С, ультратонкие срезы получали на микротоме, монтировали их на сетки и бленды, контрастировали уранилацетатом (5% раствор на метиловом спирте), цитратом свинца (Reynolds., 1963, Venable J.; Coggeshal R., 1965), препараты изучали на электронном микроскопе ЭМ-125 при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Проводили иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка по традиционной методике (пероксидазный метод) с использованием первичных антител к индуцибельной и эндотелиальной изоформам NO-синтазы (eNOS, iNOS, Santa Cruz Вiotechnology, США, в концентрации 1: 400). В качестве контроля использовали инкубацию без первичных антител. Животных гильотинировали под легким эфирным наркозом. После извлечения сердце помещали в раствор фиксатора (4% раствор параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере, рН=7,4) на 6-8 часов при 4 ⁰С. После криопротекции (15% и 30 % сахароза) и замораживания, на криостате готовили срезы (15-20 мкм). Далее срезы помещали в 0,3 % раствор перекиси водорода на холодном 70% метаноле на 30 минут. Проводили промывку в 0,1 М фосфатном буфере в течение 15 минут. Далее проводили блокирование в 10 % растворе сыворотки (goat blocking serum). Инкубацию срезов в растворе первичных антител проводили в течение ночи при 4 ⁰С. После отмывки первичных антител в фосфатном буфере в течение 15 минут препараты инкубированы с вторичными антителами, связанными с биотином (1:300) (Santa Cruz Вiotechnology, США) в течение 1 часа и затем с АВС комплексом (ABC Staining System) в течение 1 часа (в концентрации, рекомендуемой производителем (Santa Cruz Вiotechnology, США)). Как хроматоген был использован диаминобензидин – DAB (Santa Cruz Вiotechnology, США). Все инкубированные растворы готовили с использованием 0,2 % Triton X- 100 и 2% сыворотки (goat blocking serum). Все полученные препараты просматривали в световой микроскоп Zeiss, снабженный цифровой фотокамерой. Полученные изображения обрабатывали с помощью Adobe Photoshop 6,0.

Острую токсичность исследуемых соединений изучали на белых мышах при внутрибрюшинном ведении водных растворов изучаемых фармакологических препаратов. Показатель острой токсичности (ЛД₅₀) вычисляли графически по методу Миллера и Тейнтера (Беленький М.Л., 1963; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

Метод предложен Серновым. Л.Н., Гацура В.В.(1989). После окклюзии коронарной артерии животных забивали путем декапитации под эфирным наркозом, извлекали сердце, канюлировали восходящую часть дуги аорты, промывали в течение 1-2 мин физиологическим раствором хлорида натрия при t=37 ⁰С под давлением 135 мм водн. ст., а затем перфузировали на протяжении 5-6 мин 0,025% раствором синьки Эванса на физиологическом растворе под прежним давлением. Перфузия продолжалась до темно-синего окрашивания интактных зон миокарда. Затем поврежденный и неповрежденный участки помещали в 2 отдельных бюкса, куда добавляли предварительно подогретый до 37 ⁰С фосфатный буфер, содержащий трифенил-тетразолия хлорид («Sigma», Германия) (1 мг/мл) в соотношении 1:9 (соответственно веса участков ткани и буфера). Бюксы инкубировали в термостате в течение часа при t 37 ⁰С. Через сутки после окрашивания участки поврежденного и неповрежденного отделов миокарда раздельно гомогенизировали в соответствующем инкубационном буфере. В гомогенатах определяли содержание красного формазана (индикатор зоны некроза) и синьки Эванса (индикатор зоны ишемии).

В качестве подопытных животных использованы белые мыши массой 20-22 г, которым при легком тиопенталовом наркозе (35 мг/кг, внутрибрюшинно) эндотрахеально вводили фторотан в объеме 0,02 мл, после чего в бедренную вену вводили раствор адреналина гидрохлорида в дозе 16,5 мг/кг. У животных регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении, однако основным критерием противоишемической активности являлся показатель выживаемости мышей.

Данный метод был предложенный У. Эшлер и Ф. Лимайко, в модификации Э.Ш. Матлиной в 1967 году (Карпищенко А.И., 2002). Извлеченное сердце омывали холодным 0,9% раствором хлорида натрия, отделяли левый желудочек, образец замораживали и взвешивали, затем тщательно гомогенизировали на холоде (0-4⁰С). Далее надосадосадочную жидкость (1,8 мл) добавляли в стеклянные пробирки с 25 мг ЭДТА с доведением pH до 8,2- 8,5. Надосадочную жидкость с ЭДТА заливали в хроматографическую колонку, для оседания катехоламинов на окиси алюминия. Затем колонку промывали раствором аммиачной воды. Элюирование проводили 0,25 н уксусной кислотой (двумя порциями по 3,5 мл). Полученные специфически флюоресцирующие биогенные амины подвергали фотометрированию на анализаторе биожидкостей «Флюорат – 02 АБЛФ.

Об уровне содержания оксида азота в миокарде судили по содержанию нитрит–иона, для определения которого использовали реактив Грисса, состоящий из N- нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (12,5 мМ) и сульфаниловой кислоты (37,5мМ) в равных соотношениях (Guevara E. et al., 1998). Содержание нитрит–иона определяли спектрофотометрически.

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (t) и критерия χ² при 5% уровне значимости (Закс Л., 1976; Фисенко В.П., 2000). Данные обрабатывали в программе STAT – 2, на базе процессора Intel Pentium 333. Морфометрия проведена с помощью программы Scion Image for Windows (Release Alpha 4.0.3.2).

Исследование острой токсичности неотона мы провели, используя субстанцию креатинфосфата (Реанал, Венгрия). Нам не удалось определить дозу, вызывающую у животных летальный исход даже при введении 1500 мг/кг. Острая токсичность мексидола составила 419+36 мг/кг (423-426). Согласно данным литературы (Арбузов Б.А., 1968) ЛД₅₀ димефосфона находится в диапазоне 2500 мг/кг. Анализ полученных результатов с учетом требований ГОСТа 12.1.007-76 (Березовская И.В., 2003) показал, что мексидол относятся к классу умеренно токсических соединений (ЛД₅₀, в диапазоне 40-1250 мг/кг), тогда как димефосфон и неотон – к классу малотоксичных веществ (ЛД₅₀, более 1250 мг/кг).

Результаты исследования фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении в условиях эксперементального хронического иммобилизационного стресса, моделированного по методу Коломейцевой представлены на рис.1. Результаты исследования показали, что мексидол и неотон не влияют на стресс-опосредованную подопытных животных. При применении димефосфона наблюдается наиболее выраженная тенденция к снижению процента летальности мышей. Важным является тот факт, что смертность животных при длительной терапии препаратами метаболического типа действия не увеличивалась, что является свидетельством отсутствия у них летальногенных свойств и, следовательно, свидетельством их высокой безопасности.

Рис 1 . Динамика летальности животных при длительном введении метаболических препаратов

В кардиомиоцитах обнаруживался умеренный внутриклеточный отек, чаще наблюдающийся в периферических отделах клеток. Отмечалось и нарушение структуры вставочных дисков. В некоторых участках миокарда отмечается их дезорганизация с нарушением чередования специализированных контактов (Рис.2в). Обнаруживались миофибриллярные структуры кардиомиоцитов с признаками значительного пересокращения (контрактуры I-III степени), чаще контрактуры II степени, а также обнаруживались участки разрыхления и разволокнения миофибрилл (Рис2б).

В кардиомиоцитах выявлялись два вида митохондрий: «светлые» - с хорошо выраженными кристами и «темные» - с конденсированным матриксом, причем количество последних преобладает (Рис 2а), что возможно свидетельствует о нарушении энергетических процессов в клетках. В зоне деструкции крист обнаруживались точечные зоны просветления. Кроме того, наблюдался «феномен» скопления митохондрий под сарколеммой, что может свидетельствовать о адаптационно-компенсаторном ответе энергетических структур кардиомиоцитов на длительное стрессорное воздействие. Иногда встречались гиганские митохондрии с разрушенными кристами и просветленным матриксом.

Выявлялся значительный интерстициальный отек, наблюдалось увеличенное содержание коллагеновых волокон и соединительнотканных клеток, что может свидетельствовать о склерозе интерстициальной ткани миокарда, обусловленном, возможно, частичной гибелью кардиомиоцитов. Обнаруживалось большое количество спазмированных сосудов (Рис 2в), что свидетельствует о нарушении метаболического обмена в миокарде.

а
Я

Мх

Мх

КС
бв

Рис. 2. Фрагмент кардиомиоцита мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. а - Атипичное ядро с большим количеством инвагинаций, скопление митохондрии с уплотненным матриксом в саркоплазме. Обозначения: Мх – митохондрии, Я – ядро (х 24000); б - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени). Разволокнение миофибрилл (стрелки). Обозначения: Мх – митохондрии (х 22000); в - Спазмированный сосуд в миокарде мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Выраженный интерстициальный отек. Дезорганизация вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов. Обозначения: КС – кровеносный сосуд, ИО - интерстициальный отек, ВД – вставочный диск (стрелки) (х 26000).

а
Я

Рис. 3. а - Ядро с незначительными инвагинациями ядерной оболочки в кардиомиоците мышей, получавших димефосфон. Обозначения: Я - ядро х 24000; б - Ультраструктура вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов (стрелки) в миокарде мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Вставочный диск (стрелки) х 28000

Протекция димефосфоном и мексидолом умеренно отражалась на структурной целостности сократительного аппарата кардиомиоцитов. Признаки пересокращения миофибрилл выявлялись с умеренной частотой в кардиомиоцитах (контрактуры I степени) (Рис.4а) наряду с нормальными сократительными структурами с хорошо выраженными изотропными участками, Z-линиями. В меньшей степени сократительного аппарата клеток коснулась протекция неотоном. Чаще, чем при применении других препаратов обнаруживались признаки пересокращения миофибрилл (контрактуры I-II степени) (Рис 4б).

а

а
Мх1

Я

Рис.5. а - Преобладание «светлых» митохондрии, с хорошо выраженными кристами в кардиомиоците мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. В кардиомиоците расположены интактные миофибриллы. Обозначения: Мф – миофобриллы, Мх– митохондрии (х 28000); б - Митохондрии 2-х видов: с уплотненным матриксом (Мх1), и с хорошо выраженными кристами (Мх2). Разволокнение и некоторая дезорганизация миофибрилл в кардиомиоците мыши, получающей мексидол в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф – миофобриллы, Я - ядро (х 21000).

а
КС

А

*

*

А - отличия от контроля достоверны при р<0,05;

* - отличия от стресс- контроля достоверны при р<0,05

Рис. 7. Показатели оптической плотности митохондрий при хроническом иммобилизационном стрессе и применении метаболических средств

* - отличия от «стресс» достоверны при р<0,05

Рис.8. Количество измененных митохондрий при хроническом иммобилизационном стрессе и применении метаболических средств
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что иммобилизационный стресс способствует развитию структурных нарушений миокарда. Все изученные препараты оказывают протекторное действие на комплекс морфологических повреждений миокарда при стрессе, а изученные изменения ультраструктуры можно рассматривать как компенсаторно-адаптационные проявления, способствующие эффективному восстановлению его морфофункционального состояния.
3.4. Исследование антиишемических свойств исследуемых соединений

Учитывая выраженный кардиоцитопротекторный эффект мексидола, неотона, димефосфона при хроническом стрессе, представляет интерес оценить протекторные свойства указанных препаратов при экспериментальной ишемии миокарда. С этой целью мы использовали различные методические приемы и в первую очередь дифференциальный индикаторный метод зоны некроза и ишемии в ранние сроки острого инфаркта миокарда у крыс. Результаты опытов представлены в таблице 2.

Таким образом, креатинфосфат, димефосфон и мексидол способны эффективно ограничивать альтеративные процессы в миокарде при моделировании экспериментального инфаркта. Выраженность противоишемического эффекта всех препаратов примерно равнозначна и по своему качественному и количественному выражению соответствует эффекту бета-адреноблокатора – пропранолола.

Другим методическим приемом для оценки противоишемических свойств лекарственных средств, является тестирование эффективности препаратов при катехоламиновых микронекрозах сердца у мелких лабораторных грызунов. Результаты опытов представлены на рис. 9.

* - отличия от контроля достоверны при p<0,05

*

*

*

*

*

*

*

Примечание: *- отличия от соответствующего показателя в контрольной серии опытов достоверны при р<0,05.

В качестве косвенного показателя тяжести ишемического процесса определена интенсивность аритмий при окклюзии и реперфузии коронарной артерии у животных. Применялся метод комплексной сравнительной оценки противоаритмической активности ряда соединений, основанный на вычислении суммарного индекса терапевтической активности (СИТА), предложенный в работах Балашова В.П. и соавт. (2007). Результаты исследований представлены на рис. 10. В контрольной серии величина СИТА равна 6 условным единицам (по числу регистрируемых показателей). В опытных сериях величина СИТА обратно пропорциональна антиаритмической активности вещества. Из представленных расчетов видно, что в целом максимальную эффективность при данной экспериментальной патологии проявили препараты сравнения - пропранолол и верапамил, тогда как эффективность препаратов метаболического типа действия оказалась заметно ниже. Креатинфосфат был менее эффективен как кардиопротектор. Тогда как димефосфон и мексидол проявляли более выраженные противоишемические свойства.

Рис. 10 Величины суммарных терапевтических индексов исследуемых препаратов при острых окклюзионных аритмиях у крыс

Отличия от контроля достоверны при наличии маркировки.

Рис. 11. ИЗМЕНЕНИЕ dP/dTmax В % ПО ОТНОШЕНИЮ К ИСХОДНЫМ ЗНАЧЕНИЯМ В КОНТРОЛЕ И ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ У КОШЕК С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

Отличия от исходных значений достоверны при наличии маркировки

Рис. 12. ВЛИЯНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ДИНАМИКУ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ (В ММ. РТ. СТ.) У КОШЕК С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА
Мексидол оказывал отчетливый протекторный эффект. На фоне его введения, начиная с 20 минуты наблюдения, значения dp/dt достоверно удерживались на более высоком уровне, чем в контрольных экспериментах. В течение 60 минут наблюдения мексидол не влиял на величину артериального давления. Однако следует отметить, что в контрольных опытах угнетение этого показателя достигало достоверного уровня лишь через 1 час наблюдения. В этот период времени препарат проявлял отчетливую тенденцию к поддержанию уровня среднего динамического артериального давления. Наиболее значимым эффектом димефосфона явилась его способность надежно препятствовать депрессии инотропной функции желудочкового миокарда подопытных животных. Так на фоне димефосфона, уже на пятой минуте эксперимента значения dp/dt были статистически достоверно выше, чем в контрольной серии опытов (соответственно 99±1,3% и 80±8,6 %). В дальнейшем этот эффект сохранился на протяжении всего периода наблюдения и через час инотропная функция миокарда под влиянием димефосфона сохранялась на уровне 92±5,2% от исходного уровня, тогда как в контроле она в среднем составила 64±8,0% (p<0,05). В заключительной серии экспериментов мы оценили гемодинамические эффекты неотона у кошек, в той же экспериментальной постановке. Неотон вводили в двух дозах (50,0 и 100,0 мг/кг). При этом режимы введения препарата различались. В дозе 50,0 мг/кг креатинфосфат вводили одномоментно болюсно через 1 минуту после лигирования коронарной артерии. В дозе 100,0 мг/кг препарат вводили дробно в течение всего 1,5 часового периода наблюдения. При первом способе введения (50,0 мг/кг) Креатинфосфат не оказал статистически значимых эффектов на показатель сократимости миокарда левого желудочка кошек и величину артериального давления. При титровании большей дозы (100,0 мг/кг) Креатинфосфат не менее эффективно чем мексидол и димефосфон предупреждает негативное влияние острой коронароокклюзии на регистрируемые гемодинамические характеристики. Как свидетельствуют данные исследования препарат статистически достоверно уменьшает депрессию инотропной функции миокарда по тесту dp/dt начиная с пятой минуты наблюдения. Статистически значимого действия на уровень среднего динамического давления данный препарат не оказал и в этом режиме введения.
3.5. Исследование некоторых механизмов кардиотропного действия мексидола, димефосфона и неотона
Результаты исследования содержания биогенных аминов в миокарде при длительном применении метаболических препаратов в условиях экспериментального хронического иммобилизационного стресса представлены на рис. 13.

А - отличия от контроля достоверны при р<0,05;

* - отличия от стресс-контроля достоверны при р<0,05

Рис.13. Содержание катехоламинов в миокарде животных при длительном введении метаболических препаратов в условиях иммобилизации

В ответ на длительное стрессорное воздействие у животных отмечается статистически достоверное повышение концентрации адреналина в миокарде (11,06±2,51нмоль/г) по сравнению с животными интактного контроля (4,97±0,62 нмоль/г).

При терапии мексидолом и неотоном у животных отмечается статистически достоверное снижение концентрации адреналина в миокарде до 4,02±0,39 нмоль/г и 5,51±0,72 нмоль/г, соответственно по сравнению с животными, подвергнутыми хронической иммобилизации без применения метаболических средств (11,06±2,51 нмоль/г). Димефосфон также проявлял выраженную тенденцию к снижению концентрации адреналина в миокарде (6,40±1,06 нмоль/г), однако она не носила статистически достоверного характера.

Результаты исследования концентрации медиатора симпатической нервной системы - норадреналина свидетельствуют (Рис 13.), что при длительном стрессорном воздействии в миокарде животных не отмечается статистически достоверного изменения концентрации норадреналина (9,4±2,07 нмоль/г) по сравнению с животными интактного контроля (7,06±1,60 нмоль/г). У животных при длительном иммобилизационном стрессе и применении мексидола, неотона и димефосфона не отмечается статистически достоверного изменения концентрации норадреналина в миокарде (8,14±1,69 нмоль/г), (12,28±2,53 нмоль/г) и (11,25±1,88 нмоль/г) соответственно по сравнению с животными группы стресс-контроля.

Таким образом, комплекс полученных данных позволяет с уверенность утверждать, что мексидол и неотон способны влиять на механизмы стрессорного повреждения миокарда на уровне симпатоадреналовой системы, тогда как димефосфон не оказывает подобного эффекта.

Результаты проведенных исследований содержания оксида азота, представленные на Рис.14. свидетельствует о заметном дисбалансе этого важного мессенеджера в условиях стрессорного повреждения. Препараты метаболического типа действия эффективно нормализуют количество NO в ткани сердца подопытных животных.

*

*

А

* - отличия от стресс- контроля достоверны при р<0,05

Рис.14. ВЛИЯНИЕ СТРЕССА И ПРЕПАРАТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ТИПА

НА СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В МИОКАРДЕ МЫШЕЙ

Рис.15. а - Значительная экспрессия iNOS в эндотелии кровеносных сосудов миокарда мышей при хроническом стрессе х 380; б - Слабая экспрессия iNOS в миокарде мышей при хроническом стрессе и применении неотона х 260. Пероксидазный метод.

У животных в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения метаболических средств (неотона, димефосфона и мексидола) выявляется усиление экспрессии конститутивной эндотелиальной изоформы NO-синтазы в эндотелии кровеносных сосудов, по сравнению с животными, подвергнутыми иммобилизационному стрессу без применения данных препаратов.

Экспрессия индуцибельной изоформы в кардиомиоцитах при применении метаболических средств имеет тенденцию к снижению (Рис.15б) по сравнению с животными, подвергнутыми хроническому иммобилизационному стрессу без применения препаратов метаболического типа действия. Это, очевидно, приводит к снижению токсического эффекта на клетки и проявляется повышением активности митохондриальных ферментов, повышению выработки АТФ и улучшению метаболических процессов в миокарде.

Оценка интенсивности экспрессии изоформ NO-синтазы проводилась с помощью стандартной морфометрической сетки Автандилова и представлена в условных единицах от 0 до 3 баллов. Результаты исследования интенсивности экспрессии индуцибельной и эндотелиальной изофоры NO-синтазы представлены на Рис. 16. Можно отметить селективность влияния препаратов на NO-синтазную систему, так мексидол в равной степени проявил влияние как на индуцибельную (1,2+0,13 у.е.), так и на эндотелиальную (1,6+0,16 у.е) изоформу фермента. Неотон проявил большее влияние на эндотелиальную изоформу фермента (1,7+0,21 у.е), тогда как отмечалось незначительное снижение экспрессии индуцибельной изобормы фермента (1,9+0,24 у.е.) по сравнению с животными стресс-контроля. Димефосфон же напротив вмешивался в механизмы экспрессии индуцибельной изоформы NO-синтазы, значительно снижая ее экспрессию (0,9+0,15 у.е.), по сравнению с животными стресс-контроля. Увеличение экспрессии эндотелиальной изоформы NO-синтазы при длительном применении димефосфона в условиях хронического иммобилизационного стресса было незначительным (0,9+0,17 у.е).

*

*

А - отличия от контроля достоверны при р<0,05;

* - отличия от стресс- контроля достоверны при р<0,05

Рис.16. Иммуногистохимическая реакция к еNOS- И iNOS синтазе в миокарде мышей в условиях стресса и терапии метаболическими препаратами

Таким образом, выполненные исследования свидетельствует о наличии у препаратов метаболического типа действия выраженных противоишемических свойств. Это подтверждается их универсальной способностью ограничивать размеры зоны некроза при экспериментальном инфаркте миокарда, снижать летальность при адреналиновой интоксикации подопытных животных и устранять ишемически опосредованные желудочковые нарушения сердечного ритма. Кроме того, исследованные препараты эффективно коррегируют обусловленное ишемией угнетение сократимости миокарда левого желудочка. Результаты выполненных экспериментов показали, что важную роль приобретают стресспротекторные свойства указанных препаратов, которые проявляются в поддержании жизнеспособности животных и предупреждении формирования стресс опосредованной гипертрофии миокарда. Длительное применение препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса не сопровождается негативными изменениями на морфологические характеристики миокарда. Установлено, что применение метаболических препаратов в условиях хронического стресса предупреждает стрессорные изменения ультраструктуры миокарда, уменьшая зоны пересокращения миофибрилл, их деструкцию, участки внутриклеточного и интерстициального отека и количество измененных митохондрий, спазмированных сосудов, что способствует эффективному восстановлению его морфофункционального состояния. Благодаря выполненным экспериментам нам удалось расширить представления о механизмах фармакодинамики указанных средств. Исследуемые препараты эффективно устраняют гиперадреналингистию, вызванную стрессом, что может иметь важное значение в механизме антиишемического действия препаратов. Кроме того, мексидол, неотон, димефосфон способны коррегировать стрессорные морфологические изменения миокарда, влияя на экспрессию индуцибельной и эндотелиальной изоформы NO-синтазы, содержание оксида азота, что приводит к компенсации эндотелиальной дисфункции и снижению токсического эффекта оксида азота в в миокарде. Таким образом, выполненный комплекс исследований обосновывает использование препаратов метаболического типа действия в качестве кардиоцитопротекторных средств.

1. Экспериментальная патология способствует развитию структурных (I) и функциональных (II) нарушений миокарда:

(I) При иммобилизационном стрессе наблюдаются ультраструктурные изменения кардиомиоциов левого желудочка сердца - нарушается ядерный аппарат кардиомиоцитов, наблюдаются контрактурные повреждения I-III степени и разволокнение миофибрилл, повреждение митохондрий с конденсацией матрикса и деструктивными изменениями их мембран, дезорганизация вставочных дисков, экстра- и интрацеллюлярному отеку. Иммобилизационный стресс приводит к изменению ультраструктуры сосудов микроциркуляторного русла, проявляющемуся истончением эндотелиоцитов и снижением содержания в них пиноцитозных пузырьков, просветлением цитозольного матрикса. Иммобилизационный стресс приводит к появлению большого количества спазмированных сосудов. При иммобилизационном стрессе наблюдаются склероз интерстициальной ткани миокарда, сопровождающийся повышением содержания клеток и фибриллярных компонентов соединительной ткани миокарда.

(II) Экспериментальная очаговая ишемия миокарда сопровождается угнетением сократительной функции миокарда левого желудочка, снижением уровня среднединамического артериального давления и развитием желудочковых аритмий.

2. Длительное применение препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса сопровождается уменьшением выраженности негативных морфологических изменений миокарда. Мексидол, неотон, димефосфон обладают стресспротекторной активностью, однако, данная активность препаратов неодинаково проявилась в отношении различных структур кардиомиоцитов и сосудов микроциркуляторного русла:

I. Неотон оказывает выраженное коррегирующее влияние на мембранные структуры клеток, уменьшая степень инвагинации ядерной оболочки и количество измененных митохондрий в кардиомиоцитах. Однако при применении препарата отмечается лишь незначительное положительное действие на сократительный аппарат кардиомиоцитов: контрактурные повреждения миофибрилл сохраняются пересокращения до II степени. Сосуды микроциркуляторного русла желудочкового миокарда характеризуются выраженным полнокровием.

II. Димефосфон предупреждает деструктивные изменения мембранных структур клеток, а также оказывает положительное влияние на сократительный аппарат кардиомиоцитов.

III. Мексидол оказывает умеренное протекторное действие в отношении сократительного аппарата кардиомиоцитов, однако препарат меньшей степени, чем неотон и димефосфон предупреждает деструктивные изменения мембранных структур кардиомиоцитов.

3. Длительная экспериментальная терапия препаратами метаболического типа действия в дозах составляющих 5% от LD_50% не увеличивает летальность животных в условиях хронического стресса, что является свидетельством их безопасного применения.

4. Мексидол, неотон, димефосфон в дозах составляющих 5% от LD_50% проявляют противоишемическое действие, что проявляется способностью эффективно ограничивать альтеративные процессы в миокарде при моделировании экспериментального инфаркта, а также эффективно коррегируют коронарогенные нарушения сердечного ритма, препятствуют ишемически опосредованной депрессии сократительной функции миокарда и эффективно поддерживают уровень среднего динамического артериального давления. В рамках рассматриваемой модели катехоламиновой интоксикации среди исследуемых препаратов лишь мексидол проявляет притивоишемическое действие, снижая летальность животных.

5. Длительное стрессорное воздействие приводит к уменьшению экспрессии эндотелиальной изоформы NO-синтазы и усилению экспрессии индуцибельной изоформы фермента. Содержание оксида азота в миокарде мышей группы стресс-контроля снижается, что косвенно свидетельствует об интенсивном образовании токсических продуктов метаболизма NO.

6. Мексидол, неотон и димефосфон, в изученных дозах, коррегируют стресс-опосредованные изменения экспрессии индуцибельной и эндотелиальной изоформ NO-синтазы, нормализуют содержание оксида азота в миокарде мышей, что отражает компенсацию эндотелиальной дисфункции и снижение токсического эффекта оксида азота в миокарде.

7. Неотон и мексидол не влияя на уровень норадреналина, снижают стресс-опосредованное увеличение адреналина в миокарде подопытных животных. Фармакодинамика димефосфона не опосредована его действием на активности симпатоадреналовой системы.

8. В условиях эксперимента мексидол, неотон и димефосфон оказывают протекторное действие на конечные точки патогенетической цепи стрессорного повреждения миокарда – комплекс повреждений ультраструктур сократительных кардиомиоцитов, что обосновывает использование препаратов метаболического типа действия в качестве средств кардиоцитопротекции при заболеваниях сердца.

1. 
   Полученные данные служат обоснованием использования препаратов метаболического типа действия в качестве средств эффективной и безопасной кардиоцитопротекции.
   
2. 
   В комплекс мероприятий по доклиническому изучению кардиотропных средств следует включать оценку влияния тестируемых препаратов на смертность животных, подвергаемых хроническому стрессу. Интенсивность стрессорного воздействия рекомендуется подбирать таким образом, чтобы в контрольной серии летальность находилась в диапозоне 30 -35%. Исследуемые соединения следует вводить животным ежедневно на протяжении 1 месяца.
   
3. 
   Результаты работы открывают дальнейшую перспективу для проведения научных исследований по изучению механизмов действия препаратов метаболического типа действия и ультраструктурных аспектов их фармакологических эффектов.
   
4. 
   Результаты исследования должны учитываться в учебном процессе кафедр цитологии, гистологии и эмбриологии, фармакологии, патологии и постдипломном образовании практических врачей.
   

1. Иванов Н.М., Герасимова Н.Г., Савина И.В. Развитие нервного аппарата сердца в пренатальном онтогенезе человека // Материалы научной конференции МГУ им. Н.П. Огарева «Актуальные проблемы современного здравоохранения и медицины». – Саранск, 2001. – С.15-17.

2. Герасимова Н.Г. Исследование нервного аппарата сердца в пренатальном онтогенезе человека // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Экология, здоровье и природопользование". - Саратов, 2000. - С. 61-62.

3. Герасимова Н.Г., Иванов Н.М. Нервный аппарат сердца в пренатальном онтогенезе человека и при некоторых врожденных пороках // «Морфологические ведомости». - Москва - Минск, 2002. - № 1-2. - С. 13-15.

4. Герасимова Н.Г., Ледяйкина Л.В., Кемаева Н.Н.Особенности иннервации сердца при врожденных пороках // Тезисы III международного конгресса молодых ученых «Науки о человеке». - Томск, 2002. - С. 54.

5. Герасимова Н.Г., Ледяйкина Л.В., Верещагина В.С., Ермолаева Т.В. Вегетативная иннервация сердца в пренатальном онтогенезе человека и при некоторых врожденных пороках // Межвузовский сборник научных трудов «Естественно-технические исследования: теория, методы, практика». - Саранск, 2002. - С. 142-145.

6. Герасимова Н.Г., Ледяйкина Л.В. Особенности вегетативной иннервации сердца при некоторых врожденных пороках у детей // Материалы I Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - Москва, 2002. - С. 94.

7. Герасимова Н.Г., Иванов Н.М., Кругляков П.П. Характеристика нервного аппарата сердца в пренатальном онтогенезе человека и некоторых животных // Ученые записки Ульяновского государственного университета. – Ульяновск, 2002. - Серия биологическая, выпуск 1 (6). - С. 15-21.

8. Герасимова Н.Г. Изменения вегетативной иннервации сердечно-сосудистой системы при врожденных пороках сердца // Материалы II Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - Москва, 2003. - С. 99-100.

9. Герасимова Н.Г., Иванов Н.М. Вегетативная иннервация сердечно-сосудистой системы в пренатальном онтогенезе человека и ее морфо-функциональные изменения при врожденных пороках сердца // Морфологические ведомости. - Москва- Минск, 2003. - № 3-4. - С. 7-10.

10. Герасимова Н.Г., Ледяйкина Л.В., Алексаткина Л.В. Функциональные изменения вегетативной иннервации сердечно-сосудистой системы при врожденных пороках сердца // Материалы научной конференции «ХХХI Огаревские чтения». - Саранск, 2004. - Часть 2, «Естественные науки». - С. 54-55.

11. Герасимова Н.Г. Изменение вегетативной иннервации при врожденных пороках сердца // Вестник аритмологии. Материалы VI Международного славянского конгресса по электростимуляции и клинической электрофизиологии сердца. - Санкт-Петербург, 2004. - №35, приложение А. - С. 180.

12. Герасимова Н.Г., Иванов Н.М. Морфофункциональные изменения вегетативной иннервации сердечно-сосудистой системы при врожденных пороках сердца // Ученые записки Ульяновского государственного университета. – Ульяновск, 2004 .- Серия «Биология», выпуск 1 (8). - С. 52-53.

13. Герасимова Н.Г. Роль оксида азота в регуляции функций физиологических систем организма // Материалы научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте». - Саранск, 2005. - Выпуск 3, экспериментальная медицина. - С. 54.

14. Герасимова Н.Г., Маркелова И.А., Таланова Е.В., Балашов В.П., Кругляков П.П., Ховряков А.В. Ферменты семейства NО–синтаз в миокарде мышей в условиях хронического стресса // Материалы 4-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле». – Орел. - 2005.- «Ретиноиды». – Альманах. - Выпуск 21. - С.59-60.

15. Герасимова Н.Г., Кругляков П.П., Балашов В.П., Маркелова И.А., Ховряков А.В. Влияние хронического стресса и мексидола на экспрессию изоформ NO-синтаз в миокарде мышей // Морфо­логические ведо­мости. - Москва-Берлин, 2005. -№ 1-2. - С. 8-10.

16. Герасимова Н.Г., Кругляков П.П., Балашов В.П., Маркелова И.А., Ховряков А.В. Исследование NO -синтазы в миокарде мышей при хрониче­ском стрессе на фоне применения препара­тов метаболического типа действия // Морфо­логические ведо­мости. - Мо­сква-Минск, 2005. - № 3-4. - С. 16-17.

17. Герасимова Н.Г., Липатова Н.А., Балашов В.П., Кругляков П.П.Влияние стресса и метаболических средств на концен­трацию катехоламинов в миокарде мы­шей // Материалы Все­российской науч­но-практической конференции, по­священной памяти Я.В.Костина «Об­щество, здоровье, лекарство». - Са­ранск, 2005. - С.40-41.