Национальной академии наук республики казахстан

1 Козлов Р.С., Стецюк О.У., Андреева И.В. Современные тенденции антибиотикорезистентности возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ России: что нас ждет дальше? // Журнал интенсивной терапии. – 2007. – № 4. – С. 23-29.

9 Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. – М., 1975. – 295 с.

1 Kozlov R.S., Stecjuk O.U., Andreeva I.V. Sovremennye tendencii antibiotikorezistentnosti vozbuditelej nozokomial'nyh infekcij v ORIT Rossii: chto nas zhdet dal'she? Zhurnal intensivnoj terapii, 2007, № 4, 23-29 (in Russ.).

3 Sidorenko S. V. Issledovanie rasprostranenija antibiotikorezistentnosti: prakticheskoe znachenie dlja mediciny, Infekcii i antimikrobnaja terapija, 2002, 4, № 2, 38-41 (in Russ.).

8 Egorov N.S. Osnovy uchenija ob antibiotikah. - M.: Nauka, 2004, 528 (in Russ.).

9 Urbah V.Ju. Statisticheskij analiz v biologicheskih i medicinskih issledovanijah. – M., 1975. – 295 (in Russ.).

Резюме

¹Л. П. Треножникова ¹, М. А. Ақылова², Г. М. Пичхадзе³,

А. Х. Хасенова¹, Г. Д. Ултанбекова

(¹ЕМК «Микробиология және вирусология институты» ҒК БҒМ ҚР, Алматы

қоздырғыштарына қарсы жаңа табиғи антибиотиқтың

әрекетінің антимикробтык спектрі
26 жаңа табиғи антибиотиқтер препараттарынын Klebsiella, Escherichia, Pseudomonas, Acineto-bacter, Morganella, Stenotrophomonas клиникалық штаммдарына қарсы белсенділігі зерттелген. Антибиотиктер препараттарынын антибиотикалық белсенділігінің деңгейі клиникалық псевдомонадтарға қарсы 50-0 мм, клебсиелларға қарсы – 45-0 мм ацинетобактерлерге қарсы – 40-0 мм, эшерихияларға қарсы – 30-0 мм, морганелларға қарсы – 20-0 мм, стенотрофомонастарға қарсы – 40-0 мм шамасында өзгерілді.

KА049A антибиотиғының препараты барлық зерттелген клиникалық грамтеріс тест-микро-организдер штаммдарына қарсы белсенділігің айқындалды, белсенділіктің деңгейі 45-10 мм шама-сында өзгерілді.

УДК 613.2+615.874.2

(Институт физиологии человека и животных КН МОН РК, Алматы,Казахстан)

(Institute of human and animal physiology of the MES of the RK. Almaty. Kazakhstan)

Биологическое старение связано с увеличением клеточного уровня активных форм кислорода, а также образованием и накоплением окисленных биомолекул [1]. Свободным радикалам кислорода и свободнорадикальным окислительным реакциям отводят существенную роль в повреждении белков и липидов, образовании богатых продуктами ПОЛ "пигментов старения", атерогенезе, в патологии старения различных органов [2,3]. Свободные радикалы кислорода рассматриваются как важные фак­торы, включающиеся в феномен биологического старения. Они могут повредить внутриклеточные компоненты такие, как ДНК, белки, и мембранные липиды которые могут привести к мутагенезу, ингибированию роста и клеточной смерти, и далее вовлечены в старение [4]. Для сохранения здоровья населения в разные возрастные периоды немаловажное значение имеет повышение резистентности организма с помощью природных би­ологически активных соединений. Используемые геропротекторы вещества антиоксидантной природы, ингибиторы биосинтеза белка, гормоны роста, пептидные биорегуляторы и т.д. могут применяться в различные возрастные периоды. К эффективным геропротекторным средствам можно отнести препараты, снижающие риск развития хрони-ческих заболевании, повышающие продолжительность жизни, замедляющих процессы старения [5]. Известно, что при распространенных терапевтических заболеваниях процессы старения связаны с нарушением баланса показателей про- и антиоксидантной системы организма [6]. Мембраны являются одной из важных составляющих живой клетки, обеспечи-вающей нормальное функционирование остальных ее компонентов и при исследовании биологических мембран часто используют эритроциты как модель, отражающую состояние мембран всего организма [7]. В настоящее время обращает на себя внимание факт недоста-точного использования профилактических и оздоровительных свойств растительных лекарст-венных средств. В этом направлении в лаборатории проведены исследования препаратов, выделенных из растений, произрастающих на территории нашей республики, обладающих антиоксидантными, мембранопротективными свойствами, которые и могут быть средством для улучшения активного долголетия.

Целью работы было изучение влияние фитопрепарата на изменение резистентности мембран эритроцитов крыс разного возрастного периода.

Материалы и методы исследования

Животные были разделены на 3 группы: 1 – молодые (1 мес.), 2 – взрослые (6 мес.) и 3 – старые (24 мес.). Эксперименты проведены в условиях in vivo на 30 крысах месячного, 20 крысах 6-ти месячного и 10-ти крысах 24-месячного возраста. Эритроциты получали, центрифугируя кровь 10 мин при 1000g. Плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали средой, содержащей 150 мМ NaCl, 5 мМ Nа₂НРО₄ (рН-7,4). Перекисную резистентность эритроцитов определяли по методу [8] . Проницаемость эритроцитарных мембран определяли по методу [9].

Результаты статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel и GraphPad Prism 5,01. С учетом критерия Фишера-Стьюдента зарегистрированные изменения показателей считали достоверными при р 0,05.

Результаты и их обсуждение

Исследованы возрастные изменения резистентности мембран эритроцитов крыс разного возраста при применении фитопрепарата по выявлению мембранопротекторного воздействия.

Биологическая мембрана – уникальна по своей структуре и свойствам. Благодаря способности избирательной проницаемости мембраны к различным веществам сохраняется постоянство внутренней и внешней среды клетки и клеточных компартментов. Изменения проницаемости влекут за собой нарушения в жизнедеятельности клеток и как конечный результат повреждение ткани и органа в целом.

По оси абсцисс: концентрации растворов мочевины/NaCl; по оси ординат: величина гемолиза, % (р0,001).

Рисунок 1 – Исследование проницаемости эритроцитарных мембран при приеме

фитопрепарата у крыс инфантильного возраста

Данные экспериментов исследования проницаемости эритроцитарных мембран животных получавших фитопрепарат представлены на рисунках 1–3. Из рисунков видно, что при увеличении соотношения мочевины в растворе хлорида натрия увеличивается степень гемолиза эритроцитов во всех исследованных группах. Как приведено на рисунке 1, у месячных крыс контрольной группы уровень гемолиза составляет 63% при соотношении растворов мочевина/ NaCl равному 65/35, 51% при60/40,19% при 55/45, 13% при 50/50, 10%, 9% и 8% при соотношениях 45/55, 40/60, 35/65 соответственно. При анализе показателей уровня гемолиза эритроцитов опытной группы выявлено, что степень гемолитического повреждения клеток, вследствие нарушение проницаемости мембраны снизился в 1,3-3,3 раза. Аналогично, у половозрелых и старых крыс, получавших фитопрепарат степень гемолиза ниже практически на 70% при соотношениях 35/65- 50/50, на 43% при 55/45, на 20% при 60/40 и 65/35 по сравнению с контролем (рисунок 2 и 3).

Известно, что перекись водорода – слабый окислитель, она относительно стабильна и может мигрировать в клетке и ткани. Однако, Н₂О₂ содержит в своей молекуле кислород и при наличии в среде металлов переменной валентности или других форм АФК может стать дополнительным источником агрессивных форм кислорода, которые приводят к повреждению биомолекул клетки и мембран в частности.

По оси абсцисс: концентрации растворов мочевины/NaCl; по оси ординат: величина гемолиза, % (р0,001).

фитопрепарата у крыс половозрелого возраста

По оси абсцисс: концентрации растворов мочевины/NaCl; по оси ординат: величина гемолиза, % (р0,001).

при приеме фитопрепарата у старых крыс

По оси абсцисс: возрастные группы животных: 1,6,24 - месяца; по оси ординат: величина гемолиза, % (р0,001).

Рисунок 4 – Исследование влияния фитопрепарата на перекисный гемолиз эритроцитов

Как видно из рисунка, у животных получавших фитопрепарат в течение двух недель отме-чается повышение устойчивости мембран эритроцитов внешнему воздействию перекиси водорода. Уровень гемолиза у крысят одномесячного возраста достоверно снизился до 70%, у половозрелых крыс на 40% и у старых на 17% относительно контрольных значений.

Таким образом, можно предположить, что в основе мембраностабилизирующего эффекта фитопрепарата лежит его способность снижать уровень образования продуктов окислительного стресса. Как показали исследования, применение растительного препарата повышает устойчивость эритроцитов к гемолизу, снижает проницаемость мембран для негативных агентов, стабилизирует мембраны клеток организма и повышает потенциал антиоксидантной системы во всех возрастных группах животных.

ЛИТЕРАТУРА

1 Kuka S., Tatarkovahttp://www.degruyter.com/view/j/acm.2012.12.issue-1/v10201-011-0027-3/v10201-011-0027-3.xml – A1 Z., Kaplan P. Оxidative damage to proteins and lipids during ageing.//Acta Medica Martiniana. – 2013. – V. 12, N 1. P.-11.

2 Poljsak B., Suput D., Milisav I. Achieving the Balance between ROS and Antioxidants: When to Use the Synthetic Antioxidants // J. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. – 2013. – V.46, Article ID 956792, 11 p.

3 Goncharova N.D., Marenin V.Y., Bogatyrenko T.N. Stress, aging and reliability of antioxidant enzyme defense // Curr Aging Sci. – 2008. – V.1, N 1. P.22-29.

4 Singh K., Kaur S., Kumari K., Singh G.and Kaur A. Alterations in Lipid Peroxidation and Certain Antioxidant Enzymes in Different Age Groups under Physiological Conditions // J. Hum. Ecol, 2009. – V.27, N 2. – P.143-147.

5 Синявский Ю.А. Научные основы создания функциональных геропротекторных продуктов с использованием нетрадиционного сырья для повышения качества жизни // Известия НАН РК. Серия биол. и медицинская. – 2013. – № 4. – С.79-81.

6 Маншарипова А.Т. Изучение антиоксидантного состава фитопрепарата для замедления процессов старения организма / / Вестник КазНМУ. – 2010. – № 5.– С.228-229.

7 Леднева И.Т. Мембраны эритроцитов – возможная модель для исследования // Физ.-хим. биол. и биотехн. – 1989. – № 10. – С. 17-25.

8 Покровский А.А., Абрарова А.А. К вопросу перекисной резистентности эритроцитов  // Вопр. Питания. – 1964. № 16. – С.44-49.

9 Колмаков В.Н., Радченко В.Г. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени // Терапевтический архив. – 1982. – Т.54, № 2. – С.59-62.

2 Poljsak B., Suput D., Milisav I. Achieving the Balance between ROS and Antioxidants: When to Use the Synthetic Antioxidants // J. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. – 2013. – V.46, Article ID 956792, 11 p.

3 Goncharova N.D., Marenin V.Y., Bogatyrenko T.N. Stress, aging and reliability of antioxidant enzyme defense // Curr Aging Sci. – 2008. – V.1, N 1. P.22-29.

4 Singh K., Kaur S., Kumari K., Singh G.and Kaur A. Alterations in Lipid Peroxidation and Certain Antioxidant Enzymes in Different Age Groups under Physiological Conditions // J. Hum. Ecol, 2009. – V.27, N 2. – P.143-147.

5 Sinjavskij Ju.A. Nauchnye osnovy sozdanija funkcional'nyh geroprotektornyh produktov s ispol'zo-vaniem netradicionnogo syr'ja dlja povyshenija kachestva zhizni // Izvestija NAN RK. Serija biol. i medicinskaja. – 2013. – № 4. – S.79-81.

6 Mansharipova A.T. Izuchenie antioksidantnogo sostava fitopreparata dlja zamedlenija processov starenija organizma / / Vestnik KazNMU. – 2010. – № 5. – S.228-229.

7 Ledneva I.T. Membrany jeritrocitov – vozmozhnaja model' dlja issledovanija // Fiz.-him. biol. i biotehn. – 1989. – № 10. – S. 17-25.

8 Pokrovskij A.A., Abrarova A.A. K voprosu perekisnoj rezistentnosti jeritrocitov // Vopr. Pitanija. – 1964. № 16. – S.44-49.

9 Kolmakov V.N., Radchenko V.G. Znachenie opredelenija pronicaemosti jeritrocitarnyh membran (PJeM) v diagnostike hronicheskih zabolevanij pecheni // Terapevticheskij arhiv. – 1982. – T.54, № 2. – S.59-62.

Резюме

Р. С. Утегалиева, А. Н. Аралбаева, В. К. Турмухамбетова,

А. К. Кайынбаева, Ж. Ж. Турумбетова, Ж. С. Жанабаева

(ҚР БҒМ ҒК «Адам және жануарлар физиологиясы институты Алматы, Қазақстан)

ЖАНУАРЛАРДЫҢ ЖАС ЕРЕКШЕЛІГІНЕ БАЙЛАНЫСТЫ ЭРИТРОЦИТ МЕМБРАНАСЫНЫҢ ТӨЗІМДІЛІГІНЕ ФИТОПРЕПАРАТТЫҢ ӘСЕРІ
Егеуқұйрықтардың жас ерекшелігіне байланысты фитопрепараттың эритроцит мембранасына әсері зерттелді. Өсімдік препараттарын қабылдау, эритроциттердің асқын тотығу гемолизіне төзімділігін арттырып, мембрана өткізгіштігін азайтып және клетка мембраналарын тұрақтандырды.

Поступила

УДК 547.9:581.19

(РГП «Институт молекулярной биологии и биохимии

им. М.А.Айтхожина» КН МОН РК, г. Алматы)

ИНГИБИРОВАНИЕα-АМИЛАЗЫ ИЗ ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ

ФИТАТОМ НАТРИЯ
A. A. Khakimzhanov, B. Tilegen, N. S. Mamytova, V. A. Kuzovlev, O. V. Fursov

(“M.A.Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemisrtry” CS MES RK, Almaty)

Установлены существенные различия в действии фитата натрия наактивность двух групп изоферментов α-амилазы зерна пшеницы. Фитатв большей степени ингибировал α-амилазу прорастания (группа Ами1). Напротив, изоферменты Ами2 слабоподавлялисьэтим соединением. Ингибиторное действие фитата на актив-ность α-амилазы сопоставимо с действием другого хелаторадвувалентных металлов – ЭДТА-Na₂.

В семенах злаковых α-амилаза выполняет важную роль при прорастании и развитии проростка, осуществляя гидролиз крахмала до легкоусвояемых сахаров. Пшеничная α-амилаза представлена двумя основными группами – α-Ами1, или α-амилаза «прорастания» и α-Ами2 (α-амилаза «созревания»), различающимися по своим свойствам и функционированию в зерновке [1].

Важными регуляторами α-амилазы, как и любого другого ферментного белка, являются активаторы и ингибиторы различной природы. К числу первых, прежде всего, относится Ca²⁺, который входит в состав молекулы фермента и необходим для проявления каталитической активности. Поскольку α-амилаза – металлсодержащий фермент, ее активность может регулироваться invitroтакимисинтетическими хелатами, как ЭДТА, ЭГТА, БАПТА [2].В качестве агентов с подобными свойствамимогут выступать и некоторые природные органические кислоты, среди которых фитиновая кислота и ее соли – фитаты, являющиеся важнейшим в зерне резервом магния, кальция и неорганического фосфата [3,4].

В зернеу большинства злаковых (рожь, ячмень, пшеница, рис) фитин в виде глобоидов встречается в алейроновом слое, тогда как, например, у кукурузы – в зародышевой части[5,6]. На долю фитина может приходиться до 80% этих веществ от их общего содержания в зерновке. Химически фитин представляет собой конгломерат кальциевых и магниевых солей фитиновой кислоты – миоинозитгексафосфат, трудно растворимый в воде. Именно из-за свойства фитиновой кислоты образовывать комплексы с катионами двувалентных металлов, в том числе сFe²⁺ и Zn²⁺, часто дефицитных для организма, данное вещество принято относить к антинутриентам [6]. С другой стороны, компоненты фитата (минералы, фосфор, мезоинозит) представляют собой очевидную биологическую ценность.

В связи с принципиальной ролью α-амилазы во многих технологических процессах, например, в хлебопечении и пивоварении, выявление и изучение регуляторов активности этого фермента имеетнесомненную практическуюзначимость. В период прорастания оба процесса – синтез α-амилазы и дезагрегация фитина с высвобождением растворимого фитата происходят одновременно и локализованы в алейроне. В связи с этим возможное взаимодействие фитата и α-амилазы в самом зерне представляетопределенный научный интерес. В нашей работе исследовано действие фитата натрия на активность пшеничной α-амилазы и ее изоферментных групп.

Материалы и методы

В работе использовали зерно пшеницы (TriticumaestivumL.) сорта Казахстанская 10. α-Амилазу из проросшего (4 суток) зерна пшеницы получали методом гликогеновой преципитации в 40% этаноле по методу, описанному в руководстве [8].

Разделение на группы Ами 1 и Ами 2 проводили ионообменной хроматографией на СМ-сефарозе (размер колонки 1,2?6 см), уравновешенной 0,02 М Na-ацетатным буфером рН-5,2. Элюирование α-амилазывели ступенчатым градиентом – сначала стартовым буфером, а затем 0,08 и 0,2 М буфером. По данным нативного электрофореза фракции с 0,08 М буфером содержалитолько изоферменты Ами 2, а фракции с 0,2М буфером – изоферменты Ами 1. Изолированные группы α-амилазыдиализовали против 1 мМ раствора CaCl₂,концентрировали на ячейке Amicon (Millipor, США), фильтр РМ-10 и хранили при +4^оС для дальнейшего использования.

Определение активности α-амилазы проводили с помощью колориметрического крахмал-йодного метода, описанного в руководстве [8].

В предварительных экспериментах было выяснено, что коммерческий препарат фитина из рисовых отрубей (Sigma, США) не растворим в воде даже при нагревании и не действует на α-амилазу. В отличие от самого фитина, фитат натрия обладает хорошей растворимостью, поэтому в дальнейшей работе использовался только он.

Для исследования временной кинетики действия фитата на активность отдельных изоферментных групп α-амилазы Ами1 и Ами2, смеси инкубировали в 0,05М фосфатном буфере рН 8,0 в течении 90 мин. Из диаграммы (рисунок1) отчетливо видно значительное падение ферментной активности к 1,5 часам инкубации в варианте с Ами1, при этом Ами2 практически не подвергалась ингибированию хелатором. Представленныеданные свидетельствуют об избирательном характере действия фитата на изоферменты пшеничной α-амилазы.

Концентрация фитата – 3мМ

Рисунок 1 – Влияние фитата на активность Ами1 и Ами2
Известено множество соединений с хелатными свойствами естественного (природного) и искусственного происхождения. Наиболее важным свойством любого хелата является его способность и предпочтение связывать те или иные металлы. Одним из самых известных синтетических хелатов является этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), образующий комплексы с двувалентными катионами металлов. В научной практике этот хелатор часто используется для идентификации и исследования металл-зависимых ферментов, в том числе и α-амилазы.

В нашей работе проведено сравнительное изучение влияния фитата и ЭДТА на пшеничную α-амилазу. При действии на тотальный фермент оба хелатора подавляли активность, но в разной степени. Несколько разный характер влияния фитата и ЭДТА наблюдался и при действии на две отдельные группы α-амилазы. Оба агента сильно подавляли группу Ами1 и, напротив, слабо изменяли активность Ами2.

На диаграммах рисунков 2 и 3 хорошо видны различия в картине и степени ингибирования двух групп фермента. Сделанный выше вывод о преимущественном подавлении Ами1 обоими хелатами в целом подтвердился. Кроме того, фитат проявлял заметно большую избирательность по сравнению с ЭДТА в отношенииотдельных групп изоферментов α-ами-лазы. Иными словами, фитат способен специфически ингибировать группу Ами1, при этом мало затрагивая активность Ами2.

Рисунок 2 – Действие разных концентраций фитата и ЭДТА на активность α-амилазы Ами1

Рисунок 3 – Действие разных концентраций фитата и ЭДТА на активность α-амилазы Ами1

Рисунок 3 – Влияние разных концентраций фитата и ЭДТА на активность α-амилазы Ами2

Хорошо известен факт относительно высокой термоустойчивости α-амилазы (выдерживает 70^оС 15 мин), что во многом обуславливается наличием в структуре белка атома кальция. Исходя из этого, представляло интерес изучение действия повышенной температуры на ингибирование α-амилазы фитатом. Для этого смеси фермента Ами1 с хелатором (10мМ) прогревали при разных значениях температуры от 30 до 60^оС в течение 5мин, затем резко охлаждали и определяли амилазную активность. Параллельно ставился контроль (без добавления фитата).

Данные эксперимента представлены на рисунке 4, из которого видно, что ингибирование слабо происходило до температуры 50^оС. Однако, прогрев при 60^оС приводил к резкому, почти полному подавлению активности фермента фитатом. Вероятно, подъем температуры влечет за собой повышение доступности кальция в молекуле белка, что облегчает его захват хелатором.

Рисунок 4 – Действие повышенной температуры на ингибирование α-амилазы Ами1 фитатом

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что фитат натрия является довольно эффективным природным ингибитором пшеничной α-амилазы, причем избирательно подавляющим активность группы изоферментов Ами1 (амилаза прорастания). Это свойство фитата позволяет по новому взглянуть на его физиологическую роль в зерновкеи в, частности, вероятность регулирования этим соединением активности α-амилазы, а также других металлсодержащих ферментов и белков в период прорастания. В отличие от широко применяемого ЭДТА, фитат натрия является более мягким хелатором, что может стать практически полезным его преимуществом в энзимологических исследованиях.