Проба на пероксидазу с хлоридом парафенилендиамина

69 
Приборы и реактивы. Пробирки, колба мерная вместимостью 500 см
3
, 
пипетки градуированные вместимостью 5 см
3
, капельницы из темного стекла, 
баня водяная с температурой (35 ± 2)°С, 2%-ный раствор п-фенилендиамина 
дигидрохлорида, цитратная буферная смесь, 0,5%-ный раствор перекиси во-
дорода, вода дистиллированная. 
Цитратная буферная смесь: 97 г гидрофосфата натрия и 0,65 г лимон-
ной кислоты растворяют в мерной колбе вместимостью 500 см
3
, доливают до 
метки и перемешивают.
Техника анализа. В пробирку отмеривают 5 мл молока и 2,5 мл раство-
ра буферной смеси, перемешивают и помещают в водяную баню с темпера-
турой (35 ± 2)°С на 3-5 мин. Затем добавляют 6 капель 0,5%-ного раствора 
перекиси водорода и 3 капли 2%-ного раствора п-фенилдиамина гидрохлори-
да. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реакти-
ва. Далее пробирку помещают в ту же водяную баню и наблюдают измене-
ние окраски смеси.
При отсутствии пероксидазы в молоке цвет смеси в пробирке останется 
белым, значит, молоко пастеризованное. При наличии пероксидазы смесь в 
пробирке приобретает темно-синее окрашивание. 
Проба на фосфатазу с 4-аминоантипирином (арбитражный метод)
Основана на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кислоты 
ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке. Выделившийся при гидро-
лизе свободный фенол в присутствии окислителя дает розовое окрашивание с 
4-аминоантипирином. 
Приборы и реактивы. Пипетки градуированные вместимостью 5 см
3
, 
пробирки стеклянные, колбы конические и мерные вместимостью 100 и 1000 
см
3
, баня водяная с температурой 40-45°С, 25%-ный раствор гидроокиси ам-
мония, осадитель системы цинк-медь, основной буферный раствор (рН 10), 
растворы А и Б, дистиллированная вода. 

70 
Основной буферный раствор: 40 г хлорида аммония в мерной колбе на 
1000 мл растворяют в 100-200 мл воды, добавляют 348 см
3
25%-ного раство-
ра гидроокиси аммония и доводят до метки дистиллированной водой. 
Раствор А: 1,25 г динатриевой соли фенифосфорной кислоты раство-
ряют в 100 см
3
основного буферного раствора. 
Раствор Б: 0,8 г 4-аминоантипирина растовряют в 900 см
3
дистиллиро-
ванной воды. 
Осадитель системы цинк-медь: 30 г сульфата цинка и 6 г сульфата ме-
ди растворяют в 1000 см
3
дистиллированной воды. 
Техника анализа. Перед работой готовят рабочий раствор субстрата, 
смешивая растворы А и Б в соотношении 1 : 9. Рабочий раствор пригоден для 
работы в течение 3 ч при хранении его в склянке из темного стекла. 
В пробирку вносят 3 см
3
молока и 2 см
3
рабочего раствора, перемеши-
вают и помещают в водяную баню с температурой 40-45°С на 30 мин. Далее 
в ту же пробу добавляют пипеткой 5 см
3
осадителя системы цинк-медь, пе-
ремешивают и снова помещают пробирку в ту же баню на 10 мин. 
Вынув пробирку из бани, сравнивают окраску содержимого пробирки с 
контролем. Контролем является аналогичная реакция с кипяченым молоком. 
При отсутствии фосфатазы в молоке содержимое пробирки (раствор, отде-
лившийся от осажденного белка) бесцветное. При наличии фосфатазы в мо-
локе раствор окрашивается в розовый или красный цвет. 

жүктеу/скачать 1.04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: