Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии»



жүктеу 0.72 Mb.
бет3/4
Дата17.06.2016
өлшемі0.72 Mb.
1   2   3   4

Молекулярные основы наследственной патологии




Анализ генома


Геном человека. Различные уровни анализа генома: цитогенетический, молекулярно-цитогенетический, молекулярно-биологический. Хромосомный набор, морфология хромосом. Дифференциальная окраска хромосом (G-, C-, R-, Q-, T-, Ag-). Анализ хромосом на разных стадиях митоза: метафазные хромосомы, раннеметафазные хромосомы, прометафазные хромосомы, профазные хромосомы. Гетерогенность G-окраски гомологичных хромосом на разных стадиях митоза. Молекулярная организация хромосомы: нуклеосомная упаковка ДНК, хроматиновое волокно и его упаковка, петли хроматина, сестринские хроматиды. Взаимосвязь упаковки хроматина и дифференциального окрашивания хромосомы: R-петли, Q-петли, районы прикрепления петель хроматина к каркасу, эухроматин, факультативный гетерохроматин, структурный гетерохроматин

Временные параметры репликации хромосом Хромосомные аномалии - классификация, механизмы и примеры. Численные аномалии хромосом: три- и тетраплоидии, анеусомии: трисомии хромосом 21 (синдром Дауна), 18 (синдром Эдвардса), 13 (синдром Патау), Х (синдромы ХХХ и Клайнфельтера), Y, моносомия Х (синдром Шерешевского-Тернера). Структурные аномалии хромосом: реципрокные и нереципрокные транслокации, робертсоновские транслокации, тандемные транслокации, инсерции прямые и инвертированные, делеции терминальные и интерстициальные, дупликации прямые и инвертированные, кольцевые хромосомы, изохромосомы моно- и дицентрические. Ломкость хромосом - фрагильные участки. Биодозиметрия

Операционные уровни в цитогенетике: светооптический, молекулярный. Молекулярная цитогенетика - методы: флуоресцентная гибридизация in situ, ПЦР на хромосомах, сравнительная геномная гибридизация, спектроскопический анализ хромосом. Операционные уровни в молекулярной биологии: крупные фрагменты ДНК, гены, мРНК, экзоны, нуклеотиды.

Методы анализа ДНК: анализ сцепления, электрофорез в пульсирующем поле, молекулярное клонирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР, методы поиска мутаций, секвенирование. Композиция генома человека: ядерный и митохондриальный геномы. Ядерный геном: гены и генные последовательности, кодирующие и некодирующие ДНК, псевдогены, фрагменты генов, нетранслируемые последовательности, повторяющиеся последовательности. Клиническая цитогенетика и онкоцитогенетика - база картирования генов наследственных заболеваний человека

.

Стратегии картирования генома


Стратегия «Функциональное клонирование»: геноспецифические олигонуклеотиды, специфические антитела, скрининг антител, экспрессионные библиотеки кДНК, функциональная комплементация. Список наследственных заболеваний человека, картированных с использованием этой стратегии.

Стратегия «Позиционное клонирование». Алгоритм исследования. Генетическое картирование, анализ сцепления: генетические маркеры, генетические карты, анализ гаплотипов, генетическое расстояние (сантиморган), кроссинговер, позитивный и негативный лод-балл, мультилокусное сцепление.

Делеционное картирование и клонирование точек разрыва. Микродиссекция и клонирование фрагментов ДНК. Анализ потери гетерозиготности и сравнительная геномная гибридизация. Физическое картирование определенного района, физические маркеры: искусственные дрожжевые хромосомы, клоны на основе вирусной и бактериальной ДНК, радиационные гибриды, хромосомоспецифические ДНК-библиотеки, контиги клонов, флуоресцентная гибридизация на нити ДНК, секвенированные маркерные участки (STS).

Тонкое генетическое картирование: анализ рекомбинаций, неравновесие по сцеплению. Идентификация гена в определенном районе: скрининг кДНК-библиотек с использованием геномных клонов, кДНК селекция, нозерн-блоттинг на панели тканей, зоо-блоттинг, идентификация CpG-островков, экзон-треппинг, компьютерный анализ последовательности: поиск гомологии, предсказание экзонов, поиск мотивов и сигнальных последовательностей, выявление мутаций.

Стратегия «Ген-кандидат»: «позиционно-независимый ген-кандидат», «позиционный ген-кандидат». Усредненные характеристики гена: размеры генов, экзонов, интронов, организация промоторных районов, гены внутри генов, антисмысловые генные последовательности.

ДНК-диагностика - практический подход


Основные типы мутаций: нуклеотидные замены, инсерции, делеции, хромосомные аномалии. Полиморфизмы ДНК (SNP). Методы косвенной ДНК-диагностики: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей. Методы прямой ДНК-диагностики: множественная ПЦР, анализ однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP), анализ гетеродуплексов (HA), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), градиентный по температуре гель-электрофорез (TGGE), химическое расщепление неспаренных участков (CCM), энзиматическое расщепление неспаренных участков, белок-усеченный тест (PTT), секвенирование. Анализ функционального состояния ДНК: метилчувствительная ПЦР, метилспецифическая ПЦР, метилспецифический фингерпринтинг. Анализ однородительской изодисомии. Анализ крупных структурных перестроек ДНК: электрофоретический анализ в пульсирующем поле, дозовый блот-гибридизационный анализ. Анализ экспансии тринуклеотидных повторов.

Классификация мутаций по функции: потеря функции, приобретение новой функции, изменение дозы гена. Классификация мутаций по структуре: миссенс-мутации, нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания. Мутации сайтов сплайсинга: механизмы возникновения мутаций сплайсинга, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты ветвления, криптические сайты сплайсинга. Номенклатура и правила записи мутаций. Характерные мутации при распространенных наследственных заболеваниях.



Молекулярные основы наследственной патологии


Картирование и клонирование генов EXT1 и EXT2 при множественной экзостозной хондродисплазии: синдром Лангера-Гидиона, трихо-рино-фаланговый синдром, множественная экзостозная хондродисплазия, делеция хромосомы 8q24.1, делеция хромосомы 11р12, анализ сцепления, критические рекомбинации, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, дозовый блот-гибридизационный анализ, анализ длин рестрикционных фрагментов, контиги космидных клонов, микросателлитные ДНК-маркеры, уникальные ДНК-маркеры, скрининг кДНК-библиотек, 5’- и 3’- RACE, нозерн блоттинг-гибридизация, зоо-блоттинг, анализ ДНК-последовательности по базам данных, определение экзон-интронной организации генов, скрининг и секвенирование мутаций. потеря гетерозиготности и мутации во вторичных хондросаркомах.

Картирование и клонирование генов PAX6 и WT1 при синдроме WAGR. Синдром аниридии, нефробластомы, аномалий мочеполового тракта, умственной и физической задержки развития, изолированная аниридия, изолированная нефробластома, делеция хромосомы 11р13, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, контиг космидных клонов. радиационные гибриды, флуоресцентная гибридизация на хромосомах, дозовый блот-гибридизационный анализ, дозовая ПЦР, экзон-интронная организация генов, скрининг и секвенирование мутаций.

Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена, варианты дистрофина в результате альтернативного сплайсинга в различных тканях, делеции гена дистрофина, молекулярная диагностика аномалий гена дистрофина.

Муковисцидоз: история картирования и клонирования гена. экзон-интронная организация гена, частота и спектр мутаций, методы детекции мутаций, гены-модификаторы, влияющие на течение заболевани.

Ретинобластома: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена. белковый продукт гена и его функция. взаимодействие pRB с другими генами в цепи регуляции клеточного цикла, частота и спектр герминальных мутаций, потеря гетерозиготности и мутации в опухоли, функциональная инактивация гена в опухоли, методы детекции мутаций.

Множественная эндокринная неоплазия, типы 2А и 2В, семейный медуллярный рак щитовидной железы и синдром Гиршпрунга: история картирования и клонирования гена RET, экзон-интронная организация гена, белковый продукт гена и его функция, частота и спектр герминальных мутаций при МЭН2А и 2В и медуллярном раке, частота и спектр герминальных мутаций при синдроме Гиршпрунга, структурные перестройки гена RET при папиллярной карциноме щитовидной железы, типы химерных генов на основе RET, приобретение новой функции, методы детекции химерных генов. Создание диагностических протоколов.



Болезни экспансии


Повторяющиеся последовательности генома. Классификация.

Мультигенные семейства: классические генные семейства (рРНК), генные семейства, кодирующие большие консервативные домены (PAX-гены, гомеобоксные гены), генные семейства, кодирующие короткие консервативные мотивы (DEAD-мотив), генные суперсемейства (гены иммуноглобулинов, комплекса гистосовместимости), кластерированные генные семейства (различные формы псевдогенов, глобиновый кластер), РНК-кодирующее генное семейство.

Внегенные повторяющиеся последовательности и мобильные элементы: тандемные повторы: сателлитная ДНК и центромерный гетерохроматин, минисателлитная ДНК (теломерное семейство, гипервариабельное семейство), микросателлитная ДНК, рассеянные повторы: SINE (Alu-повторы), LINE (Kpn-повторы), ME, THE-1, RTLV.

Механизмы возникновения структурной патологии и мутаций в повторяющихся районах генома: проскальзывание неспаренной нити ДНК (репликационное проскальзывание), неравный кроссинговер, неравный обмен сестринских хроматид, генная конверсия.

Примеры генетических заболеваний, связанных с районами повторяющихся последовательностей: вело-кардио-фациальный синдром, синдром Вильямса, синдром Смита-Магениса, азооспермия (DAZ), синдром Шарко-Мари-Тус. Синдром Мартина-Белл, как пример структурной и функциональной патологии: ломкость хромосомы Xq27.3, экспансия CGG-повтора, механизмы, методы ДНК-диагностики, метилирование повтора и промоторной области, область отсроченной репликации и нестабильность микросателлитов, ремоделирование хроматина. Другие болезни, связанные с динамическими мутациями: хорея Гентингтона, болезнь Кеннеди, спино-церебральные атаксии (SCA1-7), миотоническая дистрофия, миоклональная эпилепсия.

Днк-диагностика в онкологии


Двухударная теория канцерогенеза Кнудсона. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.

ДНК-диагностика моногенных и дигенных наследственных онкологических заболеваний: р53 и синдром Ли-Фраумени, АРС и семейный полипоз, АТМ и атаксия-телангиоэктазия, BRCA1, BRCA2 и наследственный рак молочной железы, NF1, NF2 и нейрофиброматоз, р16 и наследственная меланома, VHL и синдром фон Хиппель-Ландау.

ДНК-диагностика маркеров неблагоприятного прогноза: гиперэкспрессия/инактивация определенных генов в различных типах опухолей, клинико-биологические типы нейробластомы, молекулярная эволюция рака толстого кишечника и опухолей мозга.

ДНК-диагностика микрометастазов, РТ-ПЦР - как основной метод, определение экспрессии опухолеспецифических маркеров в периферической крови, тирозиназа при меланоме, тирозинкиназа при нейробластоме, цитокератин 19 при раке молочной железы.

Диагностика полиморфизмов ДНК, определяющих риск развития злокачественных новообразований: полиморфизмы гена ароматазы и риск развития рака молочной железы, полиморфизмы андрогенового рецептора и риск развития рака предстательной железы, полиморфизмы генов NAT1, PADPRP и риск развития рака легкого.

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухоли: инактивация гена hMLH при карциноме желудка, инактивация генов GSTP1, BRCA1, ER при раке молочной железы, инактивация MGMT, DAP, р16 при раке легкого.

Определение маркеров, свидетельствующих о злокачественном процессе на ранних стадиях, в плазме крови, метилирование р16, Е-кадгерина, BRCA1, мутации р53, потеря гетерозиготности по маркерам хромосом 3р, 9р, 17р, 18q. Исследование генных регуляторных цепей в опухоли. Разработка диагностических протоколов. Эпигенетические механизмы регуляции генной экспрессии и наследственная патология.

Структура хроматина и механизмы ее определяющие, нуклеотидные «сторожевые» районы, метилирование цитозинов, ацетилирование/деацетилирование гистонов, белковые комплексы, осуществляющие модификацию хроматина.

Эффект положения. Классические примеры: мозаичный эффект положения у дрозофилы, аниридия и ген PAX6, цефалополисиндактилия Грейга и ген GLI3, акроцефалосиндактилия и ген TWIST, синдром Ригера и ген PITX2, кампомелическая дисплазия и ген SOX9, Х-сцепленная глухота и ген POU3F4, голопрозэнцефалия и ген sonic hedgehog, XY-реверсия пола ген SRY, эктродактилия и ген DSS1, лице-плече-лопаточная мышечная дистрофия и ген FRG1, азооспермия и ген DAZ, механизмы ЭП, конформация ДНК, деацетилирование гистонов, эухроматиновый домен, гетерохроматиновый домен, время-зависимая экспрессия генов, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, конкуренция за регуляторный элемент, инактивирующий белковый комплекс.

Импринтинг. Определение. Примеры импринтинга: трансплантация пронуклеусов, андрогенетические зиготы, гиногенетические зиготы, пузырный занос, тератома, андроид, гиноид, синдром Шерешевского тернера, делеция хромосомы 15q11.2, синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром Миллера-Дикера, синдром ДиДжорджи, синдром «кошачьего крика», болезни экспансии, синдром Видеманна-Беквита, дупликация хромосомы 11р15.5. Моноаллельная экспрессия, метилирование, однородительская изодисомия, импринтированный ген, ген-импринтор, центр импринтинга, потеря импринтинга, глобальное деметилирование, кластеризация импринтированных генов, асинхронность репликации, онтогенетическая регуляция импринтинга, тканевая регуляция импринтинга, повторяющиеся последовательности, нетранслируемая РНК, антисмысловая РНК, метилспецифическая ПЦР, метилчувствительная ПЦР, микросателлитный анализ, инактивирующее влияние структурного гетерохроматина, метилспецифические белки, консервативность импринтинга.



Генная терапия и избранные главы по вирусологии
Генная терапия (ГТ) – новое направление современной биомедицины. Природа заболеваний, являющихся объектом ГТ. Наследственные болезни, обусловленные мутациями или отсутствием существенных генов. Онкологические заболевания, вызванные перестройкой и другими модификациями генома. Молекулярно-биологические и медицинские предпосылки создания и развития ГТ. Геномика. Реализация международного проекта «Геном человека». Достижения в структурно-функциональном анализе нормальных и дефектных генов. Локализация генов. Современные методы выделения и поддержания in vitro клеток человека различной специфичности. Методы создания функционирующих клеток с измененными свойствами. Генетически модифицированные организмы – трансгенные животные. Основные подходы и приемы генной терапии. Перенос и экспрессия целевых генов в тканях больных. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регулируемая экспрессия внесенных генов. Подавление экспрессии активированных онкогенов. Подавление развития инфекционных заболеваний методами ГТ за счет переноса и экспрессии неприродной рекомбинантной ДНК и РНК.

1   2   3   4


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет