Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии»
Генная терапия соматических клеток
жүктеу/скачать 335.5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Методы переноса и экспрессии генов
Генная терапия соматических клетокИскусственные железы. Идеология этого подхода. Экспрессия в клетках больного цитокинов, гормонов, ферментов для восполнения соответствующего дефицита. Генная терапия моногенных и полигенных заболеваний. МЗ – дефект одного гена. Примеры. Дополнительная ГТ МЗ. успешное лечение иммунодефицита, вызванного недостаточностью ADA. ПЗ – множественный склероз, волчанка, ревматоидный артрит. Заместительная и дополнительная генная терапия. Преимущества заменительной терапии. Трудности осуществления и способы их преодоления. Модельные эксперименты на перевиваемых клетках и лабораторных животных. LoxP – cre система. Преимущества и недостатки дополнительной генной терапии. Примеры клинического применения ДГТ: миодистрофия Дюшена, муковисцидоз; заболевания, вызванные дефицитом гормонов или цитокинов. Генная терапия злокачественных и вирусных заболеваний. 2/3 одобренных ГТ протоколов направлены на лечение злокачественных заболеваний. Основной подход – усиление иммунного отввета за счет усиления иммуногенности раковых клеток. Способы достижения. Антисмысловые РНК и антисмысловые олигонуклеотиды. Молекулярные основы действия антисмысловых последовательностей нуклеиновых кислот. Подавление на уровне трансляции. РНКазная деградация. Рибозимы. Основной молекулярный механизм действия рибозимов. 2 основных типа рибозимов. Подавление онкогенов рибозимами. Генная терапия репродуктивных клеток. Исправление гентических дефектов в репродуктивных клетках. Направленное изменение генома. Мораторий на ГТ репродуктивных клеток человека. Морально-этические проблемы генной терапии. Возможность направленного изменения генома – разрешительные органы, контролирующие органы. Проблема принятия решения. Церковь и генная терапия. Биологический риск. Оценка риска. Создание рекомбинантной ДНК и контроль за ее распространением, использованием и уничтожением. Спонтанное возникновение генетически модифицированных вирусов и микроорганизмов – возможные издержки генноинженерных технологий, используемых при ГТ. Методы переноса и экспрессии геновНевирусные методы переноса генов. «Химические методы» переноса экспрессируемых генов. Ca-фосфатная и DEAE-декстрановвая трансфекции. Принцип действия, использование при трансгенозе. Липосомы, типы липосом, использование при ГТ. Ограничения этих методов. «Физические методы» переноса экспрессируемых генов. Электропробой. Преимущества и недостатки. Баллистические методы доставки ДНК. Инъекция, струйный метод. Использование при ДНК-вакцинации. Вирусные методы переноса генов. Общая характеристика методов. Вирусы, используемые для конструирования векторов. Преимущества. Примеры использования. Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов. Основные характеристики вируса осповакцины. История использования вируса осповакцины в медицинской практике,. жизненный цикл и особенности строения генома. Существенные и несущественные гены. Векторы на основе осповакцины. Клонирование в векторах на основе вируса осповакцины. Использование гомологичной рекомбинации при клонировании генов в векторах на основе осповакцины. Векторы на основе аденовирусов. Структура аденовирусного генома. Ранние и поздние гены. Стратегия модификации генома. Жизненный цикл аденовирусов. Конструирование векторов на основе аденовирусов. Способы увеличения емкости этих векторов. Высокая иммуногенность аденовирусных векторов. Использование в целях генной терапии. Риск, связанный с их использованием. Адено-ассоциированный вирус, структура генома, жизненный цикл. Особенности вируса. Интеграция в определенный участок 19 хромосомы человека. Конструирование векторов на основе адено-ассоциированного вируса. Системы переноса терапевтических генов в рекомбинантных векторах на основе ААВ. Использование этих векторов в генной терапии. Преимущества и недостатки. Ограничения при использовании. Примеры использования в ГТ. Векторы на основе вирусов герпеса. Особенности структуры генома вирусов герпеса. Жизненный цикл вирусов герпеса. Конструирование векторов на основе вирусов герпеса и их использование в генной терапии. Удаление несущественных генов вируса и змаена их «терапевтическими генами». Использование при внесении генов в нервные клетки. Ограничения. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Ретровирусные векторы. Особенности жизненного цикла. Обратная транскриптаза. Молекулярный механизм действия ОТ. Классификация ретровирусов. Принципы классификации ретровирусов. Вирусы группы MLV. Спумавирусы (пенящие вирусы). Лентивирусы (HIV 1,2). Ретровирусы B-типа (MMTV). Ретровирусы группы лейкозов человека и крупного рогатого скота. Простые и сложные ретровирусы. Особенности структуры геномов простых и сложных ретровирусов. Жизненные циклы простых и сложных ретровирусов. Взаимодействие белков оболочки вируса с клеточными рецепторами. Тропизм вирусов. Экотропные, амфотропные и ксенотропные вирусы. Онкогенные ретровирусы. Природный перенос генов от одних клеток другим ретровирусами. Природа клеточных протоонкогенов. Захват геномом ретровирусов онкогенов. Переход протоонкогенов в активированные онкогены. Конструирование векторов на основе ретровирусов. (Вирусы группы лейкозов мышей, лентивирусы, пенящие вирусы). Цис- и транс-последовательности генома ретровирусов. Их функции. Емкость ретровирусных векторов. Упаковывающие клетки (УК). Принципы конструирования УК. УК первого, второго и третьего поколения. Псевдотипирование.Использование псевдотипирования для повышения титра. Ретровирусные векторы в генной терапии. Использование; преимущества и недостатки. Емкость векторов. Включение в состав ретровирусных векторов участков генома вирусов другой природы и регуляторных элементов генома человека. Регулируемая экспрессия. Настоящее и будущее генной терапии. Перспективы развития. Благо или зло. Первые 10 лет генной терапии. Конкретные достижения. Основные направления развития ГТ. Клонирование человека. Методические основы клонирования. Клонирование животных. Человечество перед выбором: аргументы за и против. Клонирование тканей и органов в целях трансплантации. Ответственность исследователей и врачей. Готово ли общество к клонированию? Культивирование и методы исследования эукариотических клеток (практические занятия) Использование культур эукариотических клеток в биологии и медицине. Преимущества работы с культурами клеток. Среды для культивирования клеток. Сбалансированные солевые растворы. Естественные среды, среды с определенным составом и среды с определенным составом с добавлением естественных компонентов. Роль сыворотки при культивировании клеток. Ростовые среды. Поддерживающие среды. Газовая фаза. Посуда и оборудование, используемые для культивирования клеток. Условия культивирования клеток. Принципы стерильной работы. Методы стерилизации. Контроль бактериального загрязнения.
Сохранение и оценка качества клеток. Замораживание клеток. Размораживание и оценка выхода клеток. Основные подходы к масштабированному культивировыанию клеток млекопитающих в биотехнологических целях. Техника получения моноклональных антител. Принципы соматической гибридизации. Подбор партнерских линий. Способы иммунизации. Гибридизация. Основы селекции, селективные среды. Методы тестирования моноклональных антител. Клонирование клеток. Кондиционированныые среды. Фидерный слой. Способы наращивания и выделения моноклональных антител. Гетерологичные гибридомы. Использование моноклональных антител. Использование радиоактивных изотопов в клеточной культуре. Типы ядерных распадов, используемые в клеточной биологии. Единицы измерения радиоактивности. Принципы измерения бета-радиоактивности. Принципы измерения гамма-радиоактивности. Изотопы, используемые в биологических исследованиях, их характеристики. Радиоавтография. Фотографическая эмульсия. Возникновение скрытого изображения. Проявление. Область применения радиоавтографии. Использование двойной метки. Сочетание радиоавтографии с другими методами (иммуноцитохимией, гистологическим окрашиванием и др.). Применение радиоавтографии при изучении клеточного цикла. Метод «меченых митозов». Метод «разведения метки» для изучения пролиферативного поведения клеток. Определение пролиферативного пула клеточной популяции. Иммуноцитохимия, принцип метода. Условия успешного проведения иммуноцитохимических исследований. Сохранность и доступность антигена. Антитела и специфичность окрашивания. Визуальзация реакции антиген-антитело. Иммунофлуоресцентные методы. Иммуноферментные методы. Прямой метод Кунса. Непрямой метод Веллера и Кунса. Метод пероксидазы-антипероксидазы (ПАП). Метод гаптенового сэндвича. Авидин-биотиновые методы. Мечение при помощи коллоидного золота. Окрашивание по двум антигенам одновременно. Использование лектинов, ингибиторов. Область применения иммуноцитохимических методов. Практические занятия по генной инженерии Масштабы и методы анализа геномов. Основные этапы молекулярно-генетических исследований, связанных с анализом геномов: 1) конструирование клонотек, поиск отдельных генов и определение их нуклеотидной последовательности; 2) установление взаимного расположения клонированных фрагментов и воссоздание строения более протяженных участков генома; 3) подходы к исчерпывающей структурной характеристике геномов любых размеров. Клонотека (библиотека) генома. Карты генома - физические и генетические. Энциклопедии генов. Масштабы разрешения методов молекулярного клонирования и генетического картирования. Клонирование ДНК. Общие принципы конструирования библиотек. Поиск и характеристика индивидуальных клонов. Скрининг библиотек методом гибридизации нуклеиновых кислот. Отбор клонов с помощью гомологичной рекомбинации. Использование иммунологической детекции для идентификации нужных клонов в экспрессирующих библиотеках. Другие методы скрининга экспрессирующих библиотек. Системы вектор – хозяин. Основные типы векторов для клонирования фрагментов чужеродной ДНК и размножения их в E. coli : бактериофаг , космиды, плазмиды, бактериофаг M13. Соотношение размеров молекул различных векторов и вставок (клонирующая емкость векторов). Основные свойства плазмидных векторов. Клонирование в плазмидах. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами. Проведение реакции рестрикции. Обработка рестрицированной ДНК щелочной фосфатазой. Лигирование ДНК. Электрофорез ДНК в агарозном геле. Общие принципы метода. Основные параметры, определяющие скорость миграции ДНК в агарозном геле при электрофорезе - размер молекул ДНК, концентрация агарозы, конформация ДНК, напряженность электрического поля, состав оснований и температура. Приготовление агарозного геля и нанесение проб. Метод визуализации ДНК в агарозных гелях с помощью окрашивания ее флуоресцирующим красителем - бромистым этидием. Извлечение ДНК из агарозного геля. Трансформация E. coli плазмидной ДНК. Общие принципы метода. Выбор конкретного штамма Е. coli. Приготовление основных сред и растворов для трансформации. Стандартная методика трансформации. Оценка результатов трансформации. Частота (эффективность) трансформации. Доля компетентных клеток. Выделение плазмидной ДНК. Сравнительные характеристики различных методов выделения плазмидной ДНК. Растворы для выделения плазмидной ДНК. Микрометод выделения плазмидной ДНК. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах, с радиоактивными зондами. Основные принципы метода. Растворы для блоттинга и гибридизации ДНК. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр. «Предгибридизация» фильтра в растворе, компоненты которого насыщают его неспецифические ДНК-связывающие центры. Виды ДНК-зондов для гибридизации. Способы включения метки в ДНК. Ник-трансляция ДНК. с помощью ДНК-полимеразы I (E.coli). Включение метки в 5'-концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Гибридизация на фильтрах по Саузерну. Отмывка от несвязавшейся метки. Параметры гибридизации и отмывки. Время полуренатурации зонда. Радиоавтография. Полимеразная цепная реакция. Общая схема экспоненциального увеличения количества копий ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Параметры реакции. Температурные циклы ПЦР, включающие последовательные стадии денатурации, отжига и элонгации цепей ДНК. Компоненты реакции. Основные типы ДНК-матрицы. Принципы подбора праймеров. Оптимизация условий ПЦР. жүктеу/скачать 335.5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|