Самостоятельная работа обучающегося по дисциплине Современные методы в биотехнологии
жүктеу/скачать 31.01 Kb.
|
| Порядок выполнения работы. 1 г растительной ткани (проростки или молодые листья) растирают в предварительно охлажденной ступке с жидким азотом до состояния пудры. Переносят в охлажденную пробирку и добавляют 7,5 мл горячего (~65°С) буфера для экстракции 2х ЕВ, в состав которого входят: 100 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 1,4М ЫаС1, 25 мМ ЭДТА, 2%-ный по массе СТАВ, 40 мМ р-меркаптоэтанол. Аккуратно перемешивают и инкубируют при 65°С 1 час, несколько раз перемешивая для более полного лизиса клеток. Пробирку охлаждают до комнатной температуры и добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом. Перемешивают плавными движениями в течение 15 мин до образования гомогенной эмульсии. Центрифугируют при 5000 §, 15 мин. Верхнюю водную фазу отбирают в новую пробирку и добавляют 1/10 часть объема 10%-ного раствора СТАВ (чтобы легче отобрать нужное количество вязкого раствора детергента, его нужно нагреть до 65°С). Хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом, осторожно перемешивают в течение 15 мин до образования гомогенной эмульсии. Центрифугируют при 5000 §, 15 мин. Снова отбирают водную фазу, добавляют 1/30 часть объема 10%-ного СТАВ и повторяют экстракцию смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. Для осаждения комплекса СТАВ-нуклеиновые кислоты добавляют равный объем РВ-буфера. В состав РВ-буфера входят 50 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 1%-ный СТАВ. Перемешивают и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Если осадок не выпадает, инкубируют 30 мин при 65оС. Центрифугируют при 12000 §, 30 мин. Полностью отбирают надосадочную жидкость, осадок растворяют в 1-2 мл горячего (~65°С) ТЕ-буфера, в состав которого входят: 1М НС1, 10 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА. При этом осадок может плохо растворяться. В этом случае инкубируют 30 мин при 65°С. Добавляют два объема охлажденного 96%-ного этанола и перемешивают. Инкубируют при -20°С в течение 1-3 ч (на этом этапе можно увидеть тяжи преципитирующей ДНК). Центрифугируют при 10000 §, 30 мин. Надосадочную жидкость сливают и осадок промывают несколько раз 151 холодным 70%-ным этанолом. Осадок подсушивают и растворяют в дистиллированной воде или ТЕ-буфере (10 мМ ТрисНС1, 1 мМ ЭДТА). ДНК хранят при 4°С, при длительного хранения - при -20°С
жүктеу/скачать 31.01 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|