Самостоятельная работа обучающегося по дисциплине Современные методы в биотехнологии
жүктеу/скачать 31.01 Kb.
|
| Порядок выполнения работы. В пробирку помешают 1 см2 листового растительного материала (предварительно удалив крупные жилки). Добавляют 400 мкл лизирующего буфера, содержащего: 250 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 250 мМ ИаС1, 50 мМ ЭДТА, 1%-ный 8ЭЗ, и растирают пестиком до гомогенного состояния. Инкубируют в течение 20 мин на водяной или воздушной бане при температуре 65°С, несколько раз перемешивая для более полного лизиса. Добавляют 200 мкл предварительно охлажденного 5 М ацетата калия (рН 5,2), аккуратно перемешивая. Инкубируют в течение 20 мин на ледяной бане, перемешивая несколько раз. Клеточный дебрис осаждают центрифугированием при 12000 §, 15 мин. Отбирают надосадочную жидкость в чистую пробирку. Добавляют равный объем смеси фенола с хлороформом, плавно перемешивают до получения гомогенной эмульсии. Водную и органическую фазы разделяют центрифугированием при 12000 §, 5 мин. Отбирают водную фазу в чистую пробирку, стараясь не захва149 тить частицы интерфазы. Затем очистку повторяют. Центрифугируют при 12000 § 5, мин. Снова осторожно отбирают водную фазу в чистую пробирку. Добавляют два объема холодного 96%-ного этанола, плавно перемешивают до выпадения осадка. Для более полного выпадения осадка пробирку охлаждают при температуре - 20°С в течение 30 мин (или оставляют на ночь). Нуклеиновые кислоты осаждают центрифугированием при 12000 §, 15 мин. Осадок промывают 200 мкл 70%-ного этанола, затем тщательно удаляют этанол. Промывание этанолом повторяют 2-3 раза. Если осадок отделяется от дна, еще раз центрифугируют. Осадок высушивают и растворяют в 20-50 мкл дистиллированной воды. Раствор ДНК хранят при температуре -20°С. Полученную ДНК можно использовать для проведения дальнейшего рестрикционного анализа или в качестве матрицы для методов, основанных на полимеразной цепной реакции.
жүктеу/скачать 31.01 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|