Самостоятельная работа обучающегося по дисциплине Современные методы в биотехнологии
жүктеу/скачать 31.01 Kb.
|
| Порядок выполнения работы. Берут 2-3 см2 листового растительного материала (предварительно удалив крупные жилки) либо почку (без покрывающих чешуек), измельчают и помещают в пробирку. К измельченному материалу добавляют 10 мкл 0,5%-ного Р-меркаптоэтанола и растирают пестиком до гомогенного состояния. Добавляют 300 мкл лизируюшего буфера, в состав которого входят: 200 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 250 мМ ИаС1, 25 мМ ЭДТА, 0,5%-ный 8РЗ. Инкубируют в течение 1 час при комнатной температуре, несколько раз аккуратно перемешивая. Добавляют свежеприготовленный РУР до конечной концентрации 6%, перемешивают. Добавляют 0,5 объема 7,5%-ного ацетата аммония. Инкубируют в течение 30 мин на ледяной бане, несколько раз перемешивая. Центрифугируют при 12000 §, 10 мин, с охлаждением). Надосадочную жидкость отбирают и переносят в новую пробирку. Добавляют равный объем предварительно охлажденного изопропанола и оставляют на 30-45 мин для преципитации ДНК. Затем ДНК осаждают центрифугированием при 12000 §, 15 мин, надосадочную жидкость отбирают, осадок ДНК высушива152 ют. Осадок ДНК не суспендируют в 500 мкл дистиллированной воды или в ТЕ-буфере. В состав ТЕ-буфера входят: 10 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Добавляют 1 мкл РНКазы (10 мг/мл) и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом и осторожно перемешивают до получения гомогенной эмульсии. Центрифугируют при 12000 §, 5 мин. Затем верхнюю водную фазу переносят в новую пробирку. Процедуру повторяют 1-2 раза до исчезновения интерфазы. Далее к водной фазе добавляют равный объем изопропанола и, спустя 15 мин, центрифугируют при 12000 §, 10 мин. Полученный осадок несколько раз промывают в 300 мкл 70%-ного этанола. Осадок высушивают и растворяют в 20-50 мкл дистиллированной воды. Раствор ДНК хранят при температуре 4°С, при длительном хранении -20°С.
ДНК, выделенную с помощью этого метода, можно использовать как для проведения дальнейшего рестрикционного анализа, так и в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Заключение В клетках нуклеиновые кислоты связаны с белками, образуя нуклеопротеиды. Поэтому для выделения ДНК и РНК надо разрушить нуклеопротеиды. При выделении вмДНК клетки лизируют добавлением к гомогенату детергентов и литических ферментов. Отличные результаты дает сочетание анионных детергентов и протеаз, при этом расход реагентов мал, но используются дорогие протеазы. Полисахаридные клеточные стенки микроорганизмов предварительно разрушают гликолитическими ферментами: у бактерий - лизоцимом и лизостафином, у дрожжей - зимолиазами. Анионные детергенты - додецилсульфатнатрия. (808-Ш) и п-лауроилсаркозинат натрия (саркозил) - лизируют клетки и ядра, денатурируют белки и образуют с ними отрицательно заряженные комплексы, разрушают нуклеопротеиды, высвобождая ДНК и РНК Список литературы URL: http://bono-esse.ru/blizzard/A/Chimia/Belki/fizhim_svojstva_belkov.html https://ebooks.grsu.by/osnovi_biohimii/rekomenduemaya-literatura.htm Анисимов, А.А. Основы биохимии / А.А.Анисимов. – М.: Высшая школа, 1986. – 551 с. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /под редакцией Северина Е.С. и Николаева А.Я. – М.: Гэотар-Мед, 2001. – 448 с. Ленинджер, Л. Основы биохимии / Л.Ленинджер. – М.: Мир, 1985. Т. 1 – 3. жүктеу/скачать 31.01 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|