Терминальные районы хромосом у двух близкородственных видов бурозубок, Sorex granarius и sorex araneus ( soricidae, eulipotyphla) 03. 00. 15 генетика



жүктеу 276.01 Kb.
Дата04.06.2016
өлшемі276.01 Kb.
На правах рукописи

МИНИНА ЮЛИЯ МИХАЙЛОВНА

ТЕРМИНАЛЬНЫЕ РАЙОНЫ ХРОМОСОМ У ДВУХ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ БУРОЗУБОК, Sorex granarius

И Sorex araneus (SORICIDAE, EULIPOTYPHLA)

03.00.15 – генетика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2008


Работа выполнена в Лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Жданова Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Высоцкая Людмила Васильевна

кандидат биологических наук,

Лебедев Игорь Николаевич

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный

университет, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 30 апреля 2008 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «____» марта 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Терминальные районы представляют собой хромосомные домены, которым отводится главенствующая роль в сохранении стабильности хромосом и определяющая роль в эволюции генома. Согласно современным представлениям, терминальные районы хромосом состоят из теломер и прилегающих к ним субтеломерных районов, отделяющих теломеру от основного тела хромосомы.

Теломеры состоят из тандемных (ТТАГГГ)n повтров и заканчиваются Г-обогащенным одноцепочечным концом, который «кэппирует» конец теломеры. Важную роль в поддержании структуры теломер играют белковые факторы TRF1/TRF2, осуществляющие регуляцию длины теломер, а также ряд факторов, необходимых для функционирования теломер и участвующих в репарации и рекомбинации ДНК (Saldanha et al., 2003). Теломеры играют важную роль в правильном протекании мейоза, а также во многих ключевых клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, клеточное старение и онкотрансформацию (Blasco et al., 1999; Feuerbach et al., 2002). Во многом они определяют структуру интерфазного ядра (Nagele et al., 2001).

Репликация теломер осуществляется с помощью специального фермента, теломеразы, представляющего собой комплекс обратной транскриптазы и РНК матрицы. Уменьшение активности теломеразы в соматических клетках человека приводит к нарушению структуры теломер и хромосомной нестабильности (Shay, Bacchetti, 1997; Gisselson et al., 2001). В настоящее время описан альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации теломерных и субтеломерных последовательностей (Bhattacharyya, Lustig, 2006; Bryan, Reddel, 1997), с помощью которого клетки преодолевают ростовой кризис в отсутствии теломеразы и становятся «бессмертными».

Субтеломерные районы хромосом также содержат повторенные последовательности, но это, как правило, смесь разного рода повторенных последовательностей и сегментных дупликаций. Субтеломеры являются наиболее пластичными хромосомными районами, для которых характерна повышенная частота рекомбинационных и мутационных событий. Эти свойства субтеломер обуславливают их роль в молекулярной эволюции генома и этиологии ряда врожденных заболеваний человека (Linardopoulou et al., 2005; Flint et al., 1995).

Несмотря на то, что теломеры и субтеломеры играют важную роль в структурно-функциональной организации хромосом, структура этих районов практически не изучена у других видов млекопитающих, нежели человек и мышь. Тем не менее, даже эти немногочисленные данные указывают на то, что структура этих районов может быть очень разной даже у близкородственных видов. В данном исследовании была изучена структура терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus) (Soricidae, Eulipotyphla). Кариотипы этих видов составлены из одинаковых на цитологическом уровне хромосомных плеч, однако отличаются числом акроцентрических и метацентрических хромосом. Главенствующую роль в их кариотипической эволюции сыграли Робертсоновские (Rb) перестройки, обусловленные слиянием акроцентриков и распадом метацентрических хромосом. Принимая во внимание тот факт, что эти виды-близнецы дивергировали недавно, несколько сот тысяч лет тому назад (Taberlet et al., 1994), мы надеялись выявить следы недавних эволюционных преобразований, связанных с терминальными районами хромосом.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus), представленной в нашем исследовании тремя хромосомными расами, которые отличаются интенсивностью Робертсоновских слияний, а также определение локализации теломерных последовательностей в хромосомах этих видов.

Непосредственные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Адаптировать дифференциальную окраску DAPI для идентификации всех хромосом Sgranarius и Saraneus при проведении FISH с используемыми в исследовании пробами;

2. Используя FISH, изучить распределение теломерных последовательностей в хромосомах Sgranarius и Saraneus и оценить размер теломер в хромосомах этих видов с помощью разных методических подходов: Q-FISH, модифицированной Q-FISH и TRF анализа;

3. Определить локализацию рибосомной ДНК и потенциально активных ядрышкообразующих районов на хромосомах Sgranarius и Saraneus;

4. Изучить структуру теломер Sgranarius, используя двуцветный FISH на фибриллах с теломерной и микродиссекционной пробой, полученной из перицентромерных районов двух акроцентриков Sgranarius, а также с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК.



Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые было изучено распределение теломерной ДНК и определены размеры теломер в хромосомах Sgranarius и Saraneus. У Sgranarius выявлены теломеры двух типов: очень длинные, содержащие в среднем 213 т.п.н., и очень короткие, содержащие в среднем 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Размер теломер в разных хромосомных расах близкородственного вида Saraneus колебался от 6,8 до 15,2 т.п.н.

2. Впервые в хромосомах Saraneus Новосибирской расы были выявлены ITS, причем частота встречаемости их в перицентромерных районах была тем выше, чем позже в ходе кариотипической эволюции эти хромосомы сформировались.

3. Впервые было показано, что число и локализация потенциально активных ядрышкообразующих районов может сильно различаться у видов-близнецов. У Sgranarius ЯО районы были локализованы на концах коротких плеч 32-х акроцентриков, тогда как у Saraneus ЯО районы были локализованы в дистальных районах плеч t, u, o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

4. Впервые у одного из видов бурозубок, Sgranarius, были описаны теломеры, необычной для млекопитающих структуры, в которых теломерные последовательности перемежаются с рибосомными.

Полученные в ходе исследования результаты используются при чтении спецкурса «Цитогенетика» для студентов 4 го курса специальности «цитология и генетика» биологического отделения ФЕН Новосибирского государственного университета.



Положения, выносимые на защиту.

1. Использование подхода, сочетающего ряд методов молекулярной цитогенетики: FISH с набором проб разного происхождения на хромосомах и отдельных фибриллах, Q-FISH в классическом и модифицированном вариантах, 3D-микроскопии, выявление потенциально активных ЯО районов с помощью окраски серебром, а также определение размеров рестрикционных теломерных фрагментов позволило установить, что размер и структура теломер у Sgranarius отличаются от таковых у вида-близнеца Saraneus и других изученных видов млекопитающих.

2. У Sgranarius выявлено два типа теломер: теломеры первого типа локализованы на коротких плечах 32-х акроцентриков и содержат в среднем 213 т.п.н. теломерной ДНК. В проксимальной части большинства этих теломер теломерные повторы перемежаются с рибосомными. Второй тип представлен короткими теломерами размером 3,8 т.п.н. Они локализованы на остальных концах хромосом. Таким образом, теломеры в одной клетке и даже на одной хромосоме Sgranarius могут различаться по размеру почти на два порядка.

3. По-видимому, теломеры уникальной структуры на хромосомах Sgranarius сформировались в результате реорганизации терминальных районов хромосом, заключающейся в совместной амплификации теломерных и рибосомных повторов и перераспределении их по терминальным районам хромосом.



Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на «The Chromosome Conference XV» (Лондон, Великобритания, 2004), на «7th Meeting of the International Sorex araneus Cytogenetic Committee (ISACC)» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), на «17th European Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping» (Лисcабон, Португалия, 2006), на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, Россия, 2007), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и содержит 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ


В работе были использованы фибробласты S. granarius и S. araneus Томской, Новосибирской и Cordon рас на 2-10 пассажах культивирования. Культуры первичных фибробластов получали из фрагментов межрёберных мышц. Препараты метафазных хромосом делали по стандартной методике с гипотонической обработкой 0.074 M р-ом KCl при 370С в течение 25-30 мин. Для приготовления препаратов фибрилл на предметные стекла наносили 2 мкл суспензии клеток в PBS. Ядра лизировали в 10 мкл буфера STE1 (0,5% SDS, 50 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис, pH 7.0), наклоняя стекла под углом 450 (Parra, Windle, 1993). ЯО районы выявляли с помощью 50% р -ра AgNO3 в 2%-ном р -ре желатина, инкубируя препараты 3-7 мин. при 600С (Verma, Babu, 1995). Теломерные последовательности выявляли с помощью меченых био-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ проб, полученных с помощью ПЦР в безматричном синтезе с олигонуклеотидами (TTAGGG)5 и (CCCTAA)5 (Ijdo et al, 1991). Для проведения Q-FISH и модифицированной Q-FISH использовали меченую Cy3 PNA пробу (CCCTAA)3 (Applied Biosystems). Рибосомные повторы выявляли с помощью фрагмента 18S рДНК человека размером 3,2 т.п.н., клонированного в плазмиде pHr13 (Малыгин и др, 1992) и меченого био-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ в ник-трансляции (набор реактивов ООО "Медиген"). Микродиссекцию хромосомных районов и мечение микробиблиотек в DOP-ПЦР проводили по протоколу Рубцова и других (Rubtsov et al., 2000). FISH и двуцветную FISH на хромосомах и фибриллах проводили по стандартному протоколу с рядом модификаций (Zhdanova et. al., 2005). 3D-FISH на интерфазных ядрах, специально приготовленных для трехмерной микроскопии, проводили так, как описано у Соловей с соавторами (Solovei et al, 2002). Для TRF анализа теломерной ДНК использовали высокомолекулярную ДНК (Blocher, Kunhi, 1990). TRF анализ был проведен Ж.-А. Лондоно-Валехо (Франция) (Londono-Vallejo et al., 2001). Q-FISH с PNA пробой была проведена на приготовленных нами препаратах хромосом S. granarius П. Лансдорпом (Канада) (Lansdorp et al., 1996; Zijlmans et al., 1997), а модифицированная Q-FISH была проведена нами так, как описано у Вонга и Слижепцевика (Wong, Slijepcevic, 2004). Для статистической обработки данных модифицированной Q-FISH использовали пакет программ STATISTICA 6 (StatSoft Inc., USA, http://www.statsoft.com/downloads/maintenance/download6.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ


Кариотипы Sorex granarius и Sorex araneus: дифференциальная

окраска хромосом DAPI.

S. granarius и S. araneus относятся к группе видов Sorex araneus, для которых характерно определение пола XX/XY1Y2 (Pack et al., 1993). Единицей кариотипов S. granarius и S. araneus являются хромосомные плечи, обозначаемые буквами латинского алфавита. Робертсоновские перестройки играли ведущую роль в формировании кариотипов этих видов. В настоящее время предпочтение отдается гипотезе, согласно которой предковый кариотип S. granarius и S. araneus содержал как минимум четыре метацентрика: af, bc, de и tu (Taberlet et al., 1994; Fumagalli et al., 1996). Два из них распались у S. granarius, но сохранились у S. araneus. Во всех хромосомных расах S. araneus наряду с упомянутыми выше метацентриками присутствует хромосома jl, а остальные хромосомные плечи представлены либо акроцентриками, либо формируют метацентрики в разных сочетаниях в отдельных расах. В таблице 1 приведены кариотипы использованных в работе видов и рас бурозубок. Кариотипы S. granarius и S. araneus представлены на рисунке 1.

Идентификация хромосом S. granarius и S. araneus обычно проводилась согласно идиограмме G-дифференциально окрашенных хромосом. Поскольку в работе стояла задача идентифицировать хромосомы этих видов в FISH экспериментах, то мы составили идиограмму окрашенных DAPI (4′,6-диамино-2-фенилиндол) хромосом (Рис. 2) и показали, что характер дифференциальной исчерченности после окраски DAPI и Гимза после предобработки трипсином оказался схож (Minina et al., 2007).


Таблица 1. Описание кариотипов S. granarius и S. araneus (по Wojcik et al., 2003).


Вид, раса

Кариотип самки

2n у самки/самца

S. granarius

de, tu, a, b, c, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r

36 / 37

S. araneus, Cordon

de, tu, af, bc, jl, g, h, i, k, m, n, o, p, q, r

30 / 31

S. araneus, Томская

de, tu, af, bc, jl, gk, hi, mn, o, p, q, r

24 / 25

S. araneus, Новосибирская

de, tu, af, bc, jl, ik, go, hn, mp, qr

20 / 21





Рис. 1. А - кариотип S. granarius, 2n=36, XX; Б - кариотип S. araneus Новосибирской расы, 2n=21, XY1Y2; окраска хромосом DAPI. Изображения инвертированные.



Рис. 2. Идиограмма окрашенных DAPI хромосом S. araneus Новосибирской расы. Изображение инвертированное.
Локализация теломерной ДНК и размер теломер на хромосомах Sorex granarius.

FISH с теломерной пробой, синтезированной в ПЦР, выявила теломерные сигналы только в терминальных районах коротких плеч всех акроцентриков Sgranarius (Рис. 3 А). Выявить все теломеры на хромосомах S. granarius удалось при проведении Q-FISH с PNA теломерной пробой (Рис. 3 Б). Оказалось, что теломеры, локализованные на коротких плечах 32-х акроцентриков, содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора (в среднем 213 ± 5,8 т.п.н.), тогда как теломеры, локализованные на длинных плечах акроцентриков и на метацентрических хромосомах de и tu, содержат в среднем 3,8 ± 0,2 т.п.н. Таких длинных и таких коротких теломер до сих пор не было описано ни у одного изученного вида млекопитающих. Таким образом, теломеры на хромосомах S. granarius разделяются на 2 типа: длинные и короткие. Интерстициальной теломерной ДНК в хромосомах этого вида выявлено не было.




Рис. 3. FISH на хромосомах S. granarius: А - меченой биотином ПЦР теломерной ДНК пробы (детекция авидином-FITC); Б –меченой Cy3 теломерной PNA пробы. Окраска хромосом DAPI.
Другой удивительный факт связан с тем, что длинные теломеры локализованы на коротких плечах акроцентриков, а короткие - на длинных (Zhdanova et. al., 2005). Полиморфизм по размеру теломер на р и q плечах хромосом у млекопитающих был ранее описан, однако у всех изученных видов теломеры на коротких плечах были существенно короче, чем на длинных (McElligott et al., 1997; Slijepcevic, 2001; Modino et al., 2002).


Дополнительно размер теломер в хромосомах Sgranarius был определен с помощью TRF (терминальные рестрикционные фрагменты) анализа. Длина рестрикционных фрагментов варьировала, в основном, от 10 до 80 т.п.н. и не превышала 100 т.п.н. (Рис. 4). Поскольку с помощью Q-FISH было показано, что длинные теломеры содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора, то полученные данные указывают на то, что эти теломеры наряду с теломерной ДНК должны содержать другую ДНК, в которой локализованы сайты рестрикции для RsaI или HinfI.


Рис. 4. Результат блот-гибридизации по Саузерну высокомолекулярной геномной ДНК S. granarius, обработанной RsaI и HinfI, с меченым P32 олигонуклеотидом (СССТАА)5 (справа). Слева – линейка ДНК фрагментов в т.п.н.


Локализация теломерной ДНК и размер теломер на хромосомах Sorex araneus.

В отличие от S. granarius сигналы визуально одной интенсивности после FISH с ПЦР пробой к теломерным повторам были выявлены на концах всех хромосом S. araneus из всех изученных хромосомных рас (Рис. 5).




Рис. 5. FISH меченой биотином ПЦР пробы к теломерным последовательностям на хромосомах S. araneus расы Cordon (А), Томской (Б) и Новосибирской расы (В). Детекция сигнала авидином-FITC. Окраска хромосом DAPI.
На хромосомах Новосибирской расы был проведен анализ сигналов в интерстициальных сайтах (ITS). Из данных таблицы 2 видно, что с наибольшей частотой (от 29% до 81%) ITS были выявлены в перицентромерных районах хромосом: ik, go, jl, hn, mp и qr. В перицентромерных районах хромосом bc, af, de и tu частоты сигналов были существенно ниже и не превышали 10%. Кроме того, ITS с частотами 19% и 12% были выявлены в плече а хромосомы af и в плече b хромосомы bc, соответственно. Проще всего полученные данные объяснить, если предположить, что Rb слияния у бурозубок проходили с сохранением, по крайней мере, части теломерной ДНК, которая впоследствии как нефункциональная проявляла тенденцию к потере или модификации.
Таблица 2. Частоты встречаемости ITS после FISH с ПЦР теломерной пробой на хромосомах S. araneus Новосибирской расы.


Хромосома

af

bc

ik

go

jl

hn

mp

qr

tu

de

Частота встречаемости ITS в % на хромосоме

2

9

50

44

29

46

81

74

7

7

Проанализировано 104 метафазные пластинки.
Размер теломер в хромосомах S. araneus Томской и Cordon рас был определен с помощью модифицированной Q FISH. В качестве стандарта были использованы длинные и короткие теломеры S. granarius, размер которых был ранее определен с помощью стандартной Q FISH (Zhdanova et al., 2005). Данные по измерению интенсивностей свечения теломерных сигналов приведены в таблице 3.

Отношения средней интенсивности свечения сигналов на длинных и коротких теломерах S. granarius к средней интенсивности свечения сигналов на теломерах S. araneus Cordon расы оказались равными 31,3 (z = 27,62; p<0,001) и 0,42 (z = 19,5 p<0,001) соответственно. Учитывая данные по длине теломер у S. granarius (213 и 3,8 т.п.н. (Zhdanova et al., 2005)), можно легко подсчитать размер теломер у S. araneus Cordon расы. Он составляет 6,8 – 9 т.п.н. Аналогичный подсчет показал, что на хромосомах S. araneus Томской расы размер теломер составляет 11,5 – 15,2 т.п.н., а соответствующие отношения - 18,5 (z = 27,05; p<0,001) и 0,25 (z = 27,01; p<0,001). Следует заметить, что если распределение интенсивностей свечения для теломер S. granarius, особенно для длинных теломер, приближалось к нормальному, то распределение интенсивностей свечения для теломер S. araneus резко отличалось от нормального и указывало на то, что у S. araneus наряду с теломерами размером 15 т.п.н. встречались теломеры, содержащие существенно большее количество теломерной ДНК. Однако мы особо обращаем внимание на то, что в обеих хромосомных расах S. araneus размер теломер на коротких плечах акроцентриков с одной стороны и длинных плечах акроцентриков и на метацентриках с другой стороны достоверно не различался.

Таким образом, теломеры S. araneus оказались близки по размеру к описанным ранее теломерам диких видов млекопитающих, а особые размеры теломер, установленные нами для хромосом S. granarius, характерны только для этого вида бурозубок.

Таблица 3. Средние интенсивности свечения теломерных сигналов в хромосомах S. granarius и S. araneus Cordon и Томской рас.

Вид


Sorex granarius

Sorex araneus

раса

Cordon

Томская

теломеры

На коротких плечах акроцентриков

На метацентриках и длинных плечах акроцентриков

На концах всех хромосом

На коротких плечах акроцентриков

На длинных плечах акроцентриков

На концах всех хромосом

На коротких плечах акроцентриков

На длинных плечах акроцентриков

средняя интенсивность теломерного сигнала за вычетом фона

344551±5895

4657±140

11006±282

10799±435

9706±355

18583±489

12066±668

13416±675

Локализация 18S рДНК на метафазных хромосомах и в интерфазных ядрах Sorex granarius.

Двуцветная FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК выявила кластеры рибосомной ДНК на концах коротких плеч всех 32-х акроцентриков S. granarius (Рис. 6 А). Однако интенсивность сигналов от пробы к рДНК на разных акроцентриках была разной. На акроцентриках o, p, q и r интенсивность сигналов была настолько мала, что блоки рДНК выявлялись не во всех экспериментах. Локализация сигналов от проб к теломерной и 18S рДНК визуально совпадала. Чтобы более точно определить, как относительно друг друга расположены блоки теломерной и рДНК на коротких плечах акроцентриков, мы проанализировали профили интенсивностей гибридизационных сигналов от этих проб как минимум для 20 копий каждого из акроцентриков. Оказалось, что сигналы от проб к теломерной и рДНК на разных акроцентриках перекрывались в разной степени. На некоторых акроцентриках пики сигналов проб к теломерной и рДНК практически совпадали, как, например, на акроцентрике m (Рис. 6 Б). Были выявлены также акроцентрики, например, акроцентрик i, на котором блок рДНК прилегал к теломере (Рис. 6 В).




Рис. 6. А - FISH меченой биотином пробы к 18S рДНК (детекция авидином-FITC (зеленый)) на хромосомах S. granarius. Окраска хромосом DAPI. Типичные профили распределения интенсивности трех сигналов по хромосоме m (Б) и i (В): теломерного (1), 18S рибосомного (2) и DAPI (3).
Сходные результаты были получены на интерфазных ядрах после двуцветной 3D-FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК на препаратах, обработанных и не обработанных РНК-азой А (Zhdanova et al., 2007). На препаратах, не обработанных РНК-азой А в интерфазных ядрах выявлялись крупные блоки теломерной ДНК, большая часть из которых имела контакт с ядрышками. На препаратах, обработанных РНКазой А, двуцветная 3D-FISH выявила в ядрах S. granarius колокализацию или частичное перекрывание сигналов, соответствующих теломерной и рДНК (Рис. 7 А). Таким образом, мы можем говорить о полной или частичной колокализации потенциальных ЯО районов не только на метафазных хромосомах, но и в интерфазных ядрах S. granarius.
Выявление активных ЯО районов на хромосомах Sorex granarius.

Показано, что активные ЯО районы представляют собой Ag+ бэнды (Verma, Babu 1995). Мы выявили такие бэнды на концах коротких плеч всех акроцентриков S. granarius. Кроме того, дополнительно красящиеся серебром районы часто выявлялись в перицентромерном районе хромосомы de, а также в дистальных и перицентромерном районах хромосомы tu (Рис. 7 Б).




Рис. 7. А - Оптический срез (0,6 мкм) интерфазного ядра Sorex granarius после FISH с биотинилированной пробой к теломерной (детекция авидином-FITC (зеленый)) и к 18S рДНК, меченой дигоксигенином (детекция антидигоксигенином-Cy3 (красный)). Б - Хромосомы S. granarius, окрашенные AgNO3. Стрелки указывают на дополнительные Ag+ бэнды.
Несмотря на сделанное выше утверждение, в некоторых случаях Ag+ бэнды не соответствовали активным ЯО районам (Dobigny et al., 2002). Описанные выше данные позволяют предположить, что дополнительно Ag+ бэнды могут быть не связаны с ЯО районами, а представляют собой районы с высоким содержанием кислых белков. Однако следует обратить внимание на Ag+ бэнды на концах хромосомы tu, где, как мы покажем, у S. araneus локализованы ЯО районы. Возможно, что на концах этой хромосомы также локализованы ЯО районы, но они настолько малы, что не выявлялись использованной нами пробой к рДНК при FISH.
Локализация рДНК и ЯО районов на хромосомах Sorex araneus.

Двуцветная FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК была проведена на хромосомах трех рас S. araneus: Cordon, Томской и Новосибирской. У всех изученных рас кластеры 18S рДНК были выявлены в терминальных районах хромосом tu и длинных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах (Рис. 8 А). Также как и на хромосомах S. granarius, блоки рДНК на хромосомах S. araneus казались частично совпадающими или прилегающими к теломерам.

Анализ профилей интенсивности теломерных и рибосомных сигналов показал, что во всех хромосомных расах пики сигналов от теломерной и рибосомной проб в значительной степени перекрывались на конце q плеч. На остальных хромосомах они перекрывались в разной степени или прилегали к теломерам.


Рис. 8. Хромосомы S. araneus расы Cordon после FISH с меченой биотином пробой к 18S рДНК (детекция авидином-FITC) (А) и после окраски AgNO3 (Б).
Районы, интенсивно красящиеся серебром, были выявлены в терминальных районах хромосом tu и длинных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах (Рис. 8 Б). Эти результаты находятся в соответствии с полученными ранее данными о числе и локализации ЯО-районов в хромосомах S. araneus из некоторых хромосомных рас (Olert, Schmid, 1978).

Таким образом, вместо 32-х ЯО районов, характеризующих кариотип S. granarius, кариотип S. araneus содержит всего 8 ЯО районов. Несмотря на терминальную локализацию, у S. araneus они локализованы в совершенно других районах хромосомных плеч, нежели у S. granarius.


Изучение структуры длинных теломер на хромосомах Sorex granarius.

То, что у S. granarius теломеры на коротких плечах акроцентриков содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора, тогда как длина TRF не превышает 100 т.п.н., свидетельствует о том, что длинные теломеры не представляют собой единый тандемный блок теломерной ДНК. Очевидно, наряду с теломерными повторами они содержат и другие повторенные последовательности. Данные о колокализации и частичном перекрывании длинных теломер с потенциальными ЯО районами позволили предположить, что этими последовательностями могут быть рибосомные повторы. Чтобы подтвердить это предположение мы сначала использовали двуцветную FISH на хромосомах и фибриллах с ПЦР теломерной пробой и микродиссекционной (МД) пробой, полученной в результате диссекции 6 копий перицентромерных районов хромосом a и b S. granarius, а затем FISH на фибриллах с теломерной PNA пробой и пробой к 18S рДНК.

Сигнал после гибридизации с МД пробой на хромосомах S. granarius был зарегистрирован в перицентромерных районах всех акроцентрических хромосом (Рис. 9 А). Однако у S. araneus сигнал был выявлен только в прицентромерных районах плеч a и b хромосом af и bc (Рис. 9 Б).


Рис. 9. FISH меченой биотином микродиссекционной пробы (детекция авидином-FITC), полученной из перицентромерных районов а и b хромосом S. granarius с хромосомами S. granarius (А) и S. araneus (Б). Окраска хромосом DAPI.
Данная проба, по-видимому, содержит в разных пропорциях теломерные, рибосомные и другие типы повторов, в том числе повторенные последовательности, специфичные для перицентромерных районов хромосомных плеч a и b. Описанное распределение сигналов свидетельствует о том, что на концах коротких плеч акроцентриков S. granarius локализованы повторяющиеся последовательности, которых в необходимом количестве для регистрации сигнала нет в терминальных районах хромосом S. araneus.

FISH с ПЦР теломерной и МД пробой на фибриллах S. granarius выявила как отрезки фибрилл, на которых сигналы от обеих проб были локализованы совместно, так и отрезки, на которых были выявлены сигналы только от микродиссекционной пробы или теломерной. В качестве контроля была проведена FISH с теми же пробами на фибриллах лабораторной мыши и S. araneus. В обоих случаях были выявлены сигналы только от теломерной пробы. Учитывая состав микродиссекционной пробы, можно предположить, что в длинных теломерах S. granarius среди теломерных повторов действительно могут быть локализованы другие типы повторенных последовательностей.

FISH, проведенная с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК на фибриллах S. granarius выявила чередование районов, окрашенных разными пробами. Кроме того, были выявлены небольшие районы, окрашенные обеими пробами (Рис. 10). Очевидно, это районы, состоящие из настолько небольших блоков теломерной и рибосомной ДНК, что они выглядят как районы, окрашенные обеими пробами. На разных фибриллах мы наблюдали сигналы разного размера и разной плотности. В ряде случаев между окрашенными участками были локализованы участки, не окрашенные ни одной из использованных проб. Причин появления неокрашенных участков может быть несколько. Не исключено, что проба к рДНК обладает недостаточной чувствительностью для выявления районов такого размера на сильно растянутых фибриллах. Следует также учитывать тот факт, что маркером ЯО районов в наших экспериментах является 18S рДНК, а ЯО районы наряду с 18S рДНК содержат еще и другие рДНК, а также спейсерные последовательности. И, наконец, мы не можем исключить, что наряду с последовательностями ЯО районов длинные теломеры S. granarius могут содержать повторенные последовательности, не имеющие отношения к ЯО районам, и «пустые» участки на окрашенных фибриллах указывают именно на них.


Рис. 10. FISH на фибриллах S. granarius с двумя пробами: меченой Cy3 PNA теломерной пробой (красный) и пробой, гомологичной 18S рДНК, меченой биотином (детекция авидином-FITC (зеленый)). Окраска фибрилл DAPI.
В аналогичных экспериментах на фибриллах S. araneus нам не удалось выявить протяженных участков, в которых бы районы, окрашенные теломерной пробой, перемежались с районами, окрашенными рибосомной пробой. Мы обнаружили лишь небольшие районы, окрашенные одной из использованных проб. Не исключено, что в тех восьми районах хромосом S. araneus, для которых нами была описана терминальная локализация ЯО, теломеры и ЯО районы перекрываются в существенно меньшей степени, чем в длинных теломерах S. granarius.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность полученных в этом исследовании данных свидетельствует о том, что S. granarius обладает необычной структурой теломерных районов хромосом, отличающейся от структуры теломер как у изученных видов млекопитающих, так и у близкородственного вида S. araneus. Их уникальность состоит в том, что теломеры на коротких плечах всех 32-х акроцентриков содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора (в среднем 213 т.п.н.), в то время как теломеры на концах метацентриков de и tu, а также на концах длинных плеч акроцентриков содержат в среднем всего 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Поскольку у S. araneus, как мы определили с помощью модифицированной Q-FISH, теломеры составляют от 7 до 15 т.п.н., то можно предположить, что предшественник S. araneus имел размер теломер сходный с размером теломер у современных обыкновенных бурозубок, а в современном кариотипе S. granarius сформировались теломеры либо уникального, либо редко встречающегося среди млекопитающих размера.

Мы показали, что длинные теломеры S. granairus наряду с теломерными повторами содержат повторы 18S рДНК. По полученным нами данным можно представить структуру теломерных районов S. granarius следующим образом: на дистальных концах длинных теломер локализован блок тандемных теломерных повторов, за которым локализован район, в котором теломерные и рибосомные повторы перемежаются, а затем следует блок рибосомных повторов. По всей видимости, второй и третий районы могут быть разной протяженности на разных хромосомах. Поскольку второй район в длинных теломерах по своей структуре напоминает субтеломерные районы хромосом млекопитающих, которые насыщены разными повторами, перемежающимися с нативными и частично дегенерированными теломерными последовательностями (Жданова и др., 2007), то можно предположить, что формирование длинных теломер на концах хромосом S. granarius является первым шагом на пути выделения из теломер субтеломерных районов. Возможно, что формирование особой структуры теломер у этого вида было спровоцировано распадом двух метацентрических хромосом и явилось результатом глобальной реорганизации терминальных районов хромосом, сопровождающейся амплификацией и рекомбинацией теломерной и рибосомной ДНК в профазе мейоза на стадии хромосомного букета, когда терминальные районы хромосом приближены друг к другу. В пользу этого предположения свидетельствуют данные по молекулярной филогении видов из группы видов Sorex araneus, которые показывают, что в предковом кариотипе S. granarius и S. araneus могло быть не два, а четыре метацентрика: af, bc, de и tu. Два из них распались при формировании кариотипа S. granarius, но сохранились в линии S. araneus (Hausser et al., 1998).

У вида-близнеца S. araneus структура терминальных районов, по всей видимости, схожа со структурой терминальных районов общего предшественника S. araneus и S. granarius. Формирование кариотипа S. araneus сопровождалось Робертсоновскими слияниями, следствием чего явилось наличие множества рас S. araneus, чьи кариотипы отличаются числом и составом метацентриков. Мы обнаружили в перицентромерных районах метацентрических хромосом S. araneus Новосибирской расы интерстициальные теломерные последовательности. Частота выявления сигнала коррелировала с временем возникновения метацентрика. Из этого мы заключили, что Робертсоновские слияния у бурозубок могли проходить с сохранением части теломерной ДНК, которая со временем либо модифицировалась, либо терялась.


ВЫВОДЫ

1. Впервые, используя комбинированный подход, сочетающий ряд методов молекулярной цитогенетики и молекулярной биологии, была изучена структура терминальных районов хромосом у близкородственных видов бурозубок: Sorex granarius и Sorex araneus. Показано, что размер и структура теломер у Sorex granarius отличаются от таковых у вида-близнеца Sorex araneus и других изученных видов млекопитающих.

2. В хромосомах Sorex granarius было выявлено два типа теломер. Длинные теломеры размером 213 ± 5,8 т.п.н. были локализованы на коротких плечах всех 32 х акроцентриков, тогда как на остальных концах хромосом были локализованы короткие теломеры (3,8 ± 0,2 т.п.н.). Длина теломерных рестрикционных фрагментов у Sorex granarius, в основном, была от 10 до 80 т.п.н.

3. Было показано, что в хромосомах Sorex araneus все теломеры близки по размеру и содержали в среднем 6,8 - 15,2 т.п.н. теломерной ДНК.

4. В перицентромерных районах хромосом Sorex araneus Новосибирской расы были выявлены интерстициальные теломерные сайты. Чем раньше в ходе кариотипической эволюции вида сформировались метацентрики, тем с меньшей частотой в них выявлялись интерстициальные теломерные сайты. По-видимому, Робертсоновские слияния у бурозубок проходили с сохранением части теломерной ДНК, которая затем постепенно либо терялась, либо модифицировалась.

5. Установлено, что на концах коротких плеч акроцентриков Sorex granarius локализованы потенциально активные ЯО районы. Наряду с теломерными повторами длинные теломеры Sorex granarius содержали 18S рибосомную ДНК.

6. У Sorex araneus потенциальные ЯО районы были выявлены в дистальных районах хромосомы tu и хромосомных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

7. По-видимому, формирование кариотипа Sorex granarius было связано с реорганизацией терминальных районов хромосом, сопровождающейся совместной амплификацией теломерной и рибосомной ДНК, а также негомологичной рекомбинацией хромосомных плеч.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


1. Zhdanova N.S., Karamisheva T.V., Minina J., Astakhova N.M., Lansdorp P., Kammori M., Rubtsov N.B., Searle J.B. Unusual distribution pattern of telomeric repeats in the shrews Sorex araneus and Sorex granarius // Chromosome Res. 2005. V. 13. P. 617-625.

2. Belonogova N.M., Karamysheva T.V., Biltueva L.S., Perepelov E.A., Minina J.M., Polyakov A.V., Zhdanova N.S., Rubtsov N.B., Searle J.B., Borodin P.M. Identification of all pachytene bivalents in the common shrew using DAPI-staining of synaptonemal complex spreads // Chromosome Res. 2006. V. 14. P. 673-679.

3. Zhdanova N.S., Minina J., Karamisheva T.V., Draskovic I., Rubtsov N.B., Londono-Vallejo J. The very long telomeres in Sorex granarius (Soricidae, Eulipotyphla) contain ribosomal DNA // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 881-890.

4. Minina J.M., Borodin P.M., Searle J.B., Volobouev V.T., Zhdanova N.S. Standard DAPI karyotype of the common shrew Sorex araneus L. (Soricidae, Eulipotyphla) // Russian J. of Teriology. 2007. V. 6. P. 3-6.

5. Zhdanova N.S., Minina J., Karamisheva T.V., Rubtsov N.B. Distribution of telomeric and ribosomal DNA in chromosomes of two related species, Sorex araneus and Sorex granarius (Soricidae, Eulipotyphla) // Russian J. of Teriology. 2007. V. 6. P. 7-13.

6. Жданова Н.С., Рубцов Н.Б., Минина Ю.М. Терминальные районы хромосом млекопитающих: эволюционный аспект (обзор) // Генетика. 2007. T. 42. C. 721-732.

7. Zhdanova N., Karamisheva T., Astakhova N., Rubtsov N., Minina J., Landsdorp P., Kammori M. Localization of telomere repeats in chromosomes of two species, Sorex araneus and Sorex granarius // Chromosome Res. 2004. V. 12. P. 60-61.

8. Минина Ю.М. Теломеры в хромосомах двух видов-близнецов Sorex araneus и Sorex granarius (Soricidae, Insectivora) // Материалы XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», биология, Новосибирск. 2004. C. 58-59.

9. Zhdanova N., Minina J., Karamisheva T., Rubtsov N. Repaterning of chromosome ends in closely related shrew Sorex araneus and Sorex granarius // The Chromosome Conference and 7th Meeting of the International Sorex araneus Cytogenetic Committee (ISACC). Evolution in the Sorex araneus group: cytogenetic and molecular aspects. 2005. P. 36.

10. Zhdanova N., Minina J., Karamysheva T., Volobouev V., Rubtsov N. Chromosome termini in two sibling species, Sorex araneus and Sorex granarius (Soricidae, Eulipotyphla) // Book of Abstracts 17th European Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping, Lisbon, Portugal. 2006. P. 42.

11. Минина Ю.М., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Жданова Н.С. Сравнительный анализ терминальных районов хромосом у двух видов-близнецов бурозубок, Sorex granarius и Sorex araneus // Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск. 2007. C. 120-121.

12. Рогозина Ю.И., Минина Ю.М., Жданова Н.С. Интерстициальная теломерная ДНК и размеры теломер в хромосомах двух близкородственных видов бурозубок: Sorex granarius и Sorex araneus // Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск. 2007. C. 152-153.








©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет