В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. 
   Ознакомиться с устройством люминесцентного микроско­па, техникой включения и подготовкой к работе.
   
2. 
   Ознакомиться с основными видами флуорохромов.
   
3. 
   Приготовить раствор акридина оранжевого 1:10000 рН 3,8.
   
4. 
   Приготовить препараты из различного вируссодержащего материала.
   
5. 
   Обработать препараты раствором флуорохрома.
   
6. 
   Просмотреть препараты под микроскопом и зарисовать ] рабочую тетрадь.
   

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: демонстрация физиологического раствора; фосфатного буфера; набора флуорохромов; препаратов для вирусоскопии.

4. Подведение итогов занятия.

5. Задание к следующему занятию.

При проведении занятия в качестве материала для приго­товления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфициро­ванных вирусом, с которыми работают сотрудники кафедры.

Ввиду дефицита учебного времени демонстрацию и некото­рые объяснения преподавателя можно совмещать с окрашиванием препаратов.

Вопросы домашнего задания

1. Репродукция вирусов.

2. Метод иммунофлуоресценции и его варианты.

ЗАНЯТИЕ 5. Люминесцентная микроскопия. Метод иммунофлуоресценции

Цель занятия: ознакомиться с различными вариантами ме­тода иммунофлуоресценции, применяемыми в вирусологической практике.

Материалы и оборудование: препараты-отпечатки с любым вирусным антигеном, соот­ветствующие антивирусные флуоресцирующие сыворотки, флуо­ресцирующие сыворотки против глобулинов кролика, комплемент морской свинки, дистиллированная вода. физиологический рас­твор, пробирки с резиновыми пробками, пастеровские пипетки, пипетки на 1 и 5 мл, влажная камера, фильтровальная и черная бумага, предметные и покровные стекла, забуференный глицерин, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, люминесцентный мик­роскоп, таблицы по теме, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Аль­бертом Кунсом в 1942 году. Данный метод для ранней диагности­ки инфекционных заболеваний животных в ветеринарии начал изучать П.И.Притулин в 1955 году.

Принцип данного метода заключается в том, что антитела, предварительно соединенные с флуорохромами, сохраняют спо­собность вступать в специфическую связь с гомологичным анти­геном. Образующийся комплекс антиген-антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. В качестве красителя антител наиболее часто применяют ФИТЦ — флуоресцеина изо-тиоцианат (зеленое свечение) и РСХ — родамина сульфохлорид (красное свечение).

Метод иммунофлуоресценции сочетает в себе специфичность серологических реакций и морфологического метода исследова­ния. Его применяют для:

1) индикации, идентификации вирусов и вирусных антиге­нов в различных объектах;

2) выяснения локализации вирусов при изучении патогенеза инфекции;

3) определения местонахождения нормальных и иммунных глобулинов;

4) уточнения антигенного родства вирусов и др.

Одно из главных преимуществ метода иммунофлуоресценции перед другими серологическими реакциями состоит в том, что при его применении значительно сокращается время и не тре­буется большой массы антигена. При использовании строго спе­цифических, хорошо оттитрованных сывороток можно весьма точно поставить диагноз.

Различают два основных способа диагностического приме­нения метода иммунофлуоресценции: прямой и непрямой. При использовании прямого, или одноступенчатого ме­тода для идентификации различных вирусных антигенов приме­няют соответствующие флуоресцирующие антитела диагностиче­ских сывороток, непосредственно обрабатывая ими препараты из исследуемого материала.

При непрямом, или двухступенчатом, способе антиген вна­чале обрабатывают гомологичными нефлуоресцирующими анти­телами (1-ая ступень) затем для обнаружения последних, а вместе с ними и искомого антигена, применяют соответствующую им флуоресцирующую сыворотку против антител-глобулинов живот­ного определенного вида: кролик, бык и т.д. (2-ая ступень). Кро­ме того, вирусный антиген может быть соединен с антисыворот­кой и комплементом (1-ая ступень), а затем обработан флуоресцирующей сывороткой против комплемента (2-ая ступень, принцип РСК). Непрямой способ более чувствительный, так как каждое антитело 1-ой ступени, применяемое для выявления анти­гена, многовалентно и может присоединить к себе несколько флуоресцирующих антител 2-ой ступени. Соответственно повыша­ется и сила свечения искомых антигенов.

В качестве объектов исследования можно использовать пре­параты-отпечатки и мазки, гистосрезы, культуры клеток и т.д. Предметные стекла должны быть тонкими, чистыми, обезжирен­ными, бесцветными и не иметь царапин. Для итого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром.

П

При использовании прямого метода на препарат наносят 1-2 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Продолжительность окрашивания — 30 мин. Для предупреждения высыхания препараты помещают в большие чашки Петри с ватными тампонами, смоченными водой (влажная камера). Затем их тщательно промывают физраствором, можно водопроводной водой. Препараты подсушивают и микроскопируют.

При применении непрямого метода препарат вначале обрабатывают 30 мин во влажной камере антивирусной специфической сывороткой. Сыворотку смывают водопроводной водой. На подсушенные препараты наносят на 30 мин флуоресцирующую сыворотку против глобулинов того вида животных (кролика, быка, лошади и т.д.), на которых получена специфическая сыворотка против данного антигена. Затем препараты промывают, подсушивают и микроскопируют.

При обработке препаратов с применением комплемента (2-ой вариант непрямого метода) вначале наносят смесь нефлуоресцирующей сыворотки с комплементом, а потом — антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку. Для каждого этапа предусмотрена 20...30 минутная экспозиция во влажной камере помещенной в термостат. Препараты хорошо промывают, высушивают и просматривают под микроскопом.

1. Ознакомиться с набором флуоресцирующих сывороток 1 наставлениями по их применению.

2. Обработать препараты прямым методом иммунофлуоресценции.

3. Просмотреть приготовленные препараты в микроскопе I зарисовать в тетрадь.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация набора флуоресцирующих сывороток; б) положительных препаратом Ауески, ПГ-3 и др.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

При проведении занятия в качестве материала для приготовления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфицированных вирусом, с которым работают сотрудники кафедры.

При отсутствии таких возможностей можно пользоваться живыми вакцинами, которыми заражают культуру клеток Флюоресцирующие сыворотки к возбудителям болезни можно найти в диагностических наборах, выпускаемых биопромышленностью.

С учетом дефицита отведенного времени демонстрацию I объяснения преподавателя можно совмещать с периодом окрашивания препаратов (20...30 мин).

1. Общая характеристика и биологические особенности онкогенных вирусов.

2. Принципиальная схема устройства электронного микро­скопа.

3. Техника приготовления препаратов для электронной микроскопии.

Электронная микроскопия — один из важных методов ин­дикации и идентификации вирусов и диагностики вирусных ин­фекций. Важное преимущество этого метода перед другими — быстрота получения ответа и возможность дифференциации виру­сов по их морфологии.

Предпосылкой для конструирования электронного микро­скопа явилось установление возможности использования вместо света потока электронов. Кроме того, было выяснено, что маг­нитные поля с осевой симметрией, являясь для потока электро­нов фокусирующими, действуют как настоящие линзы в обычном световом микроскопе. Это и дало возможность получить изобра­жение объектов при использовании потока электронов. Первый электронный микроскоп был сконструирован в Германии в 1932 г. М.Кнолем и Э.Руска. В нашей стране электронные микро­скопы начали создавать в 1937 г. В 1939-1947 г.г. появились их первые заводские образцы, изготовленные с учетом исследований С.Л.Пупко, Н.Г.Сушкина, М.Лебедева.

Электронная микроскопия позволяет непосредственно (виэуально) выявлять вирусные частицы в различных материалах, Дифференцировать их по форме, размеру и ультраструктуре.

Одна из основных характеристик различных микроскопов — их разрешающая способность. Это наименьшее Расстояние между двумя объектами, которые воспринимаются глазом раздельно. Величина эта математически выражается сле­дующим образом:

где d — расстояние; λ — длина волны; n— показатель преломления среды между линзой и объективом, α - угол половины апертуры объектива линзы. |

Если вместо символов поставить их числовые значения, то для светового микроскопа получим d = 2 мкм. Как видно из фор­мулы, только уменьшение длины волны может существенно уве­личить разрешающую способность микроскопа, так как другие величины изменяются лишь в небольших пределах. Известно, что пучок электронов обладает волновыми свойствами, а длина вол­ны — переменная величина, зависящая от ускоряющего напря­жения. Известно также, что электронным пучком можно управ­лять с помощью магнитного поля. Эти факты и легли в основу конструкции электронного микроскопа, разрешающая способ­ность которых к настоящему времени достигла 0,1...0,2 нм.

Схематически электронный микроскоп может быть изображен в виде металлического цилиндра, в котором создан вакуум. В этом цилиндре (колонна микроскопа) последовательно сверху вниз расположены вольфрамовая нить (катод), металличеcкая пластина с отверстием посередине (анод), ряд магнитных линз, между которыми находится держатель объекта, люминесцирующий экран и фотографическая пластинка. Магнитные лин­зы представляют собой катушки содержащие несколько тысяч витков проволоки, через которые пропускают ток. Проходящий через катушку ток создает концентрическое магнитное поле, с помощью которо­го фокусируется электронный пучок.

Ток в несколько сот мкА, прохо­дящий через вольфрамовую нить, нагревает ее, и атомы металла ис­пускают электроны (эмиссия элек­тронов), которые стремятся скон­центрироваться на вершине нити, образуя электронное облачко. Высо­кое отрицательное напряжение, приложенное к нити, обусловливает большую разность потенциалов, возникающую между ней и зазем­ленной пластиной анода. Она и ус­коряет движение электронов по на­правлению к аноду. Часть электронов проходит через отверстие в его центре (центральная апертура) и образует электронный пучок, направляющийся вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок, сфокусированный первой магнитной линзой (конденсорной), освещает объект.

Когда объект введен в колонну микроскопа, он оказывается на пути электронного пучка. При этом происходит взаимодейст­вие электронов с объектом, часть их будет рассеиваться тяжелы­ми атомами объекта и выбиваться из общего электронного пучка. Большая часть электронов пройдет через объект без отклонения и вызовет свечение люминесцентного экрана в точках попадания электронов. Совокупность темных и светлых точек на экране создает изображение.

Если ввести в колонну микроскопа необработанные вирусные частицы, то на экране появятся лишь размытые пятна. Контрастирование достигается в том случае, когда близлежащие области в исследуемом объекте обладают хорошо выраженной разностью электронных плотностей. Поскольку биологические объ­екты состоят из веществ с малым атомным номером (водорода, углерода, азота, кислорода и др.), то разность их электронных плотностей недостаточна для получения удовлетворительного изображения, при исследовании таких объектов приходиться искусственно повышать их электронную плотность. В этом и состоит одна из процедур подготовки образца для исследования его в электронном микроскопе.

Методические указания.

При отсутствие на кафедре электронного микроскопа необходимо иметь схему его устройства и работы.

На занятиях надо иметь набор электронных микрофотографий вирусов.

Вопросы домашнего задания.

1. 
   Генетика вирусов.
   
2. 
   Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионов.
   

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусоло­гическую практику в 30-х годах XX века. Их использование рас­ширило спектр культивируемых в лаборатории вирусов и позво­лило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи. Объясняется это тем, что РКЭ имеют ряд преимуществ перед дру­гими живыми системами:

1) это закрытая живая система. Скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального зараже­ния;

2) у РКЭ высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (недостаточное развитие защитных механизмов);

3) РКЭ — легкодоступный объект;

4) РКЭ — экономичная живая система, не требующая ухода и кормления;

5) РКЭ не образуют антител в ответ на заражение. Куриные эмбрионы используют в вирусологии для:

1) обнаружения в патматериале активного вируса или пер­вичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивиру­ют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

2) поддержания вирусов в условиях лаборатории;

3) титрования вирусов;

4) накопления вируса для лабораторных исследований и по­лучения вакцин;

5) реакции нейтрализации, как тест-объект. При отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодержащим материалом к ним предъявляют следующие требования: эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, скорлупа яиц должна быть непиг­ментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до темпера­туры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальней­шее развитие зародыша. В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения ви­русами.

Куриное яйцо заключено в скорлупу, через ее поры совер­шается газообмен. Под ней лежит подскорлупная (белковая) оболочка. Это своеобразная буферная система между содержимым яйца и скорлупой. Подскорлупная оболочка в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздуш­ная камера (пуга).

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится хорион-аллонтоисная оболочка (ХАО — сосудистая оболочка), которая формирует аллонтоисную полость, заполненную жидкостью. На 11-12-й день развития количество ее достига­ет 6...7 мл. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в амниотическую жидкость, заполняющую амниотическую полость, сформированную из амниотической оболочки. Количество амниотической жидкости к 10-11-му дню развития эмбриона составляет в среднем 1 мл. Зародыш пуповиной связан с желтком, который располагается эксцентрично. Этот резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в нача­ле инкубации, а по мере развития зародыша он уменьшается. Кроме того, в полости РКЭ находится белок, покрытый оболоч­кой, являющийся питательным материалом для эмбриона .

Размножение вирусов воз­можно во всех структурах эмбриона, имеющих клеточное строение, к которым относятся зародыш, ХАО и желточный мешок. Накопление вирусов происходит в тех же структурах, но целый ряд их может накапливаться в аллантоисной и в амниотической жидкостях, образуя практически готовую суспензию вирусов. Заражение в ту или другую область эм­бриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назна­чением и определяет оптимальные для заражения возраст эм­бриона. Так, желточный мешок, как резервуар питательных ве­ществ, имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем, после 12-го дня, по мере развития зародыша, он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-ой день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл. Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-ый день развития эм­бриона, поэтому заражение в нее проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорион-аллантоисная оболочка богата кровеносными сосу­дами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности порис­той скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело за­родыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13 день. Зараже­ние на хорион-аллантоисную оболочку проводят на 10-12 день инкубации.

Подготовка РКЭ для заражения. Эмбрионы доставляют из инкубатора, не допуская охлаждения в пути. В лаборатории их инкубируют в термостате при 37 °С и 60... 70% влажности. Для этого в термостат помещают открытые широкогорлые сосуды с водой. Эмбрионы ставят в специальные штативы воздушной ка­мерой вверх.

Поступившие в лабораторию РКЭ овоскопируют и отмечают простым карандашом границу воздушного пространства (пуги), тело и головку эмбриона, безсосудистую зону. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании определяют жив зародыш или погиб. Зародыш, проявляющий активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считается живым.

Заражение проводят в боксе. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед началом работы стол дезинфицируют спиртом, поджигая его на столе.

Готовят следующие инструменты и принадлежности: комочки ваты для дезинфекции поверхности скорлупы, 0,5%-ную настойку йода, пробойники, шприцы, иглы, парафин в пипетках, подставки для эмбрионов. После этого рабочий стол в течение 1 ч облучают УФ-лучами.

Способы, заражения. Существует ряд способов заражения эмбрионов. При любом из них скорлупу яйца над местом введения материала обрабатывают спиртом, обжигают, затем об­рабатывают слабым раствором йода и вновь обжигают.

Одним из распространенных в вирусологии способов явля­ется заражение на хорион-аллантоисную оболочку. Оно применя­ется в тех случаях, когда, вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы — вирусы оспы, осповакцины, эктромелии; герпесвирусы — вирус ларинготрахеита; онкорнавирусы — вирус лейкоза кур и др.) Для этой цели ис­пользуют 11-14-дневные РКЭ.

Техника заражения сводится к следующему. В центре воз­душной камеры снимается часть скорлупы и в результате обна­жается подскорлупная оболочка. Ее приподнимают и удаляют — обнажается прозрачная, блестящая, красная, пронизанная крове­носными ссудами хорион-аллантоисная оболочка. На нее пипет­кой наносят вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. После этого окошечко в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином.

Заражение в аллантоисную полость наиболее часто приме­няют при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, онкорнавирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (вирус гриппа). Возраст куриных эмбрионов должен быть 10-11 суток.

Вируссодержащий материал можно вводить двумя способа­ми.

1. Делают прокол в скорлупе над центром воздушной каме­ры. Через отверстие шприцем с короткой иглой, который держат в вертикальном положении, вводят материал (0,1...0,2 иногда 0,5 мл) на 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Затем отвер­стие в скорлупе заливают стерильным парафином или закрывают лейкопластырем.

2. Делают два прокола — первый в скорлупе над воздушной камерой, второй — над безсосудистой зоной. Через второе отвер­стие с помощью шприца вводят материал (0,1...0,2 мл) прямо в аллантоисную полость. Для того, чтобы жидкость не выливалась обратно, через первое отверстие пипеткой с резиновой грушей от­сасывают воздух, затем оба отверстия заливают парафином.

Заражение в амниотическую полость — самый эффектив­ных метод выделения ряда орто- и парамиксовирусов. При этом способе вирус размножается в органах и тканях эмбриона. Для заражения обычно используют 6...11-дневные эмбрионы. Следует отбирать такие эмбрионы, у которых зародыши близко располо­жены к воздушному пространству.

Существует два способа введения материала в амнион.

1. Скорлупу над воздушной камерой удаляют и в образо­вавшемся окне глазным пинцетом осторожно отслаивают 1...1,5 см подскорлупной оболочки. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки тем же пинцетом делают прокол в направлении к эмбриону в том месте, где нет сосудов. Далее за­хватывают амниотическую оболочку и осторожно извлекают часть ее наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. В складку амниотической оболочки с по­мощью шприца вводят вируссодержащий материал в дозе 0,05...0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным кол­пачком или лейкопластырем, края заливают стерильным пара­фином. Это так называемый открытый способ (метод окна).

2. В центре воздушной камеры производят прокол скорлу­пы. Через образовавшееся отверстие иглу шприца вводят на 8...1,2 см ниже границы воздушной камеры. Под легким давле­нием игла проникает в амниотическую полость, куда и вводят 0,1...0,2 мл материала. После заражения отверстие в скорлупе яаливают стерильным парафином. Это закрытый способ заражения в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок используют для культиви­рования поксвирусов - вирусов группы оспы, орта- и парамиксо-вирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.). Для заражения в желточный мешок пригодны 5…6-дневные эмбрионы. В скорлупе над воздушной камерой делают прокол, накло­няют яйцо в направлении местонахождения эмбриона и вводят длинную иглу шприца на глубину 2,5...4,5 см от поверхности скорлупы, наклоняя ее в сторону, противоположную эмбриону. Доза вируссодержащего материала 0,2...0,5 мл. Методы зараже­ния РКЭ при диагностике ряда вирусных инфекций представлены в табл.2.

Таблица 2.

Использование РКЭ для культивирования вирусов

Заражение эмбрионов всегда сопровождают следующие контроли: а) на спонтанную возможность заражения. В термостат ставят несколько эмбрионов, с которыми не проводили никаких манипуляций; б) на токсичность материала. РКЭ заражают фильтратом исследуемого патологического материала после уничтожения в нем вирусов автоклавированием; в) контроль жидкости, в которой разводили вируссодержащий материал (раствор Хенкса, физиологический раствор и пр.).

Для исследования вируссодержащего материала и контро­лей используют не менее 4-х эмбрионов (чаще 5-7).

Инфицированные и контрольные эмбрионы помещают в термостат или инкубатор для дальнейшей инкубации при 35...37 °С и относительной влажности 60...70%. Эмбрионы еже­дневно овоскопируют, погибших помещают в холодильник (4-6 °С) на 2...3 ч, а затем вскрывают.