Тема 9. Использование в вирусологии куриных эмбрионов

Вскрывают куриные эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них вирусов и получения вируссодержащего материала. Последнее требует соблюдения правил асептики при вскрытии.

Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способностью агглютинировать эритроциты, т. е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА) Явление гемагглютинации представляет собой соединение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса.

Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепторы, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритроцитов. Такие вирионы адсорбируются на поверхности эритроцитов. Адсорбция одного вириона одновременно на двух эритроцитах ведет к тому, что последние оказываются соединенными между собой, а адсорбировавшийся вирион играет роль мостика между ними.

Образованием таких мостиков между многими эритроцитами и объясняется склеивание эритроцитов в хлопья.

Образование хлопьев, видимых невооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмытых эритроцитов на плоской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроцитов и вируса в пробирке хлопья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называемого зонтика.

РГА используют для обнаружения и титрования вирусов. Хлопья эритроцитов появляются через 5–10 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвеси эритроцитов (рис. 22). Положительная гемагглютинация не только указывает на присутствие вируса, но и выявляет его гемагглютинирующую активность с определенным видом эритроцитов, что может служить вспомогательным диагностическим признаком.

Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инструментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искусственной), через которую заражали. При этом яйцо держат под некоторым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздушной камеры.

Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью установления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изменения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами возможно больше. Для осмотра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а хорионаллантоисную оболочку отслаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в стерильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмотрена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.

Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша (рис. 23). Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рис. 25).

При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25 °С и ниже.



Рисунок 25. Извлечение тела зародыша
Задания

1. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.

2. Заразить куриные эмбрионы вирусами ньюкаелской болезни и оспы голубей (кур).

3. Вскрыть зараженные куриные эмбрионы, получить ХАО и аллантоисную жидкость.

4. Поставить капельную РГА с аллантоисной жидкостью.

Самостоятельная работа студентов:

а) подготовка рабочих мест и спецодежды к вскрытию куриных эмбрионов, зараженных на предыдущем занятии;

б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА;

в) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, извлечение ХАО, подсчет и зарисовка оспин;

г) подготовка к обеззараживанию инструментов, эмбрионов, посуды.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы

1. Что вы знаете о методах индикации вирусов в куриных эмбрионах?

2. Какие способы получения вируссодержащего материала от куриных эмбрионов вы знаете?

3. Каковы гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование? Каков механизм гемагглютинации?

можно добиться заражения практически всех культур клеток, что позволяет получать вируссодержащий материал с наивысшей концентрацией вируса при наименьшем содержании белкового балласта;

поскольку можно получить культуры клеток любого вида животного, снимаются видовые ограничения культивирования вирусов;

возможно вмешательство в инфекционный процесс в любой момент, не нарушая целостности живой системы;

можно непрерывно контролировать ход инфекционного процесса;

возможно получение готовой суспензии вируса в виде культуральной жидкости;

соблюдается полная стерильность культуральном жидкости в отношении грибов и бактерий;

предельно просты техника заражения и получение вируссодержащего материала;

относительная дешевизна.

Культуры клеток – наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаще всего используют для первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала, накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории, титрования вирусов и как тест-объект в реакции нейтрализации.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования:

используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу. Чувствительность ее повышается, если клетки получены от молодых животных (лучше эмбрионов);

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 26). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.



Рисунок 26. Первичная культура клеток легких эмбриона овцы (по Троценко Н.И. и др.)

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой.

Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8–10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо от происхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5-–10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

Диплоидные культуры клеток. Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотр. показали способность клеток размножаться в свободно суспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии – применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях (рис. 27) в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).



Рисунок 27. Культивирование клеток на микроносителях (схема)

10.2 Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур – первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток – хранение их при 4 °С до 1–6 нед. Успешно применяют хранение клеточных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 10⁶ в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10–40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применяют ДМСО – диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1–3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хранения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азот е в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1–2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80–90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7–8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следующие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитологические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти препараты следует строго дозировать и применять дифференцированно. Их использование – необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах, характер действия которых приведен в таблице 5. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.

Таблица 5.

Противомикробные препараты для культур клеток (Л. П. Дьяконов и др.)

Препарат	Чувствительные микроорганизмы	Антимикробное действие	Оптимальные концентрации для культур клеток (Ед/мл, мкг/мл)
Пенициллин	Б +	Бактерицидное	100,0
Стрептомицин	Б±	Бактерицидное	100,0
Мономицин	Б±, М	Бактерицидное	100,0
Неомицин	Б±, М	Бактерицидное	50,0
Канамицин	Б±, М	Бактерицидное	200,0
Гентамицин	Б±, М	Бактерицидное	200,0
Полимиксин	Б±	Бактерицидное	50,0
Фурагин	Б±	Бактерицидное	8,0

Обозначения: Б+ – грамположительные бактерии; Б– -грамотрицательные бактерии; М – микоплазмы

10.4 Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами клеток растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистилли-рованной воде с добавлением различных солей и глюкозы.

Раствор Хенкса: на 1 л бидистиллированной воды 8,0 rNaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄-7H₂O, 0,14 г СаС1₂, 0,06 г КН₂РО₄, 0,06 г NaH₂PO₄, 1,0 г глюкозы, 0,02 г фенолрота, 0,07 г NaHCO_v

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды 6,8 г NaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄, 0,2 г СаС1₂, 0,125 г NaH₂PO, 2,2 г NaHCO₃, 1,0 г глюкозы.

Эти сбалансированные солевые растворы используют для приготовления всех питательных сред, так как они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Кроме того, их применяют при различных манипуляциях с культурой клеток (отмывание от ростовых сред, разведение вируса и т. д.).

При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25%-ный на фосфатном буфере) используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена – натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02%-ный на растворе Хенкса) – используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.

10.5 Питательные среды. Различают естественные и искусственные (синтетические и полусинтетические) питательные среды.

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сыворотки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта (эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Количество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует. Используют эти среды редко.

В настоящее время применяют в основном искусственные питательные среды. К полусинтетическим питательным средам относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, фермснтативно-казеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др. Наиболее широко используют в вирусологической практике 5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, 5%-ный и 2,5%-ный раствор гемогидролизата.

Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. В состав среды 199 входит более 60 компонентов: 20 аминокислот, 17 витаминов, компоненты нуклеиновых кислот, источники липидов, 8 минеральных солей и другие вещества. В состав среды Игла также входит не менее 60 компонентов, включающих аминокислоты, витамины, углеводы и т.д.

Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добавляют индикатор феноловый красный (0,002 %) для определения концентрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При снижении рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисле-ния продуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую; при сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновый цвет. При нейтральном значении рН (7,2– 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃) и 3%-ный раствор уксусной кислоты (СН₃СООН). Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

Все питательные среды принято делить на две группы:

- ростовые, обеспечивающие жизнь и размножение клеток. Они содержат 2–10 % сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

- поддерживающие, обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не размножение их. Они не содержат сыворотки крови, используются обычно после заражения культуры клеток вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота – обязательный компонент ростовых питательных сред. В ее состав входит ряд биологически активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. В практической работе наибольшее применение нашли сыворотки как взрослого крупного рогатого скота, так и телят, получаемые на мясокомбинатах. Самая лучшая сыворотка для культуры клеток – сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать строгую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам клеток.

Предложено много способов обработки посуды, и в каждой лаборатории применяют один из них, наиболее экономичный, удобный и дающий наилучшие результаты. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилизации посуды, пробок и др. Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Обработка стеклянной посуды состоит из нескольких этапов:

1) инфицированную посуду погружают в 2–3%-ный раствор NaOH на 5–6 ч;

2) споласкивают в 3–4 сменах водопроводной воды;

3) замачивают (на ночь) в 0,3–0,5%-ном растворе порошка «Лотос», «Лоск» или мыла Б;

4) тщательно моют с помощью ерша в теплом растворе порошка «Лотос» или «Лоск»;

5) споласкивают в нескольких сменах (8–10 раз) водопроводной воды;

6) споласкивают в дистиллированной воде, содержащей 0,5 % НС1;

7) споласкивают 4–5 раз водопроводной водой и в трех сменах дистиллированной воды;

8) сушат в сушильном шкафу;

9) монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу (180 °С, 3–4 ч), кроме резиновых пробок, или автоклавируют (при 200 кПа 1,5–2 ч).

Всю новую посуду моют теплой водой с мылом, споласкивают водой и погружают на 3 ч в хромпик (100 г двухромовокислого калия на 1 л концентрированной серной кислоты), затем в течение 9 ч промывают в проточной воде и нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют и стерилизуют. Старую, бывшую в употреблении посуду обрабатывают хромпиком лишь периодически и не более чем в течение 1 ч.

Новые резиновые пробки кипятят 1 ч в 5%-ном растворе двууглекислой соды, затем промывают несколько раз горячей водопроводной водой и кипятят каждый раз по 1 ч в шести сменах дистиллированной воды. Пробки, бывшие в употреблении, автоклавируют или кипятят 1 ч. Очищают щеткой, прополаскивают несколько раз водопроводной и один раз дистиллированной водой. Затем кипятят в дистиллированной воде 1 ч, споласкивают в трех сменах дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве.

Металлические инструменты моют горячей водой с мылом, промывают водопроводной и дистиллированной водой, стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. Во время работы в стерильном боксе инструменты находятся в стакане с 96%-ным этиловым спиртом, перед использованием инструменты прожигают пламенем горелки.

В последние годы получили широкое распространение и с успехом применя­ются в лабораториях пластмассовые флаконы, пробирки, чашки Петри и плас­тины с лунками, предназначенные для одноразового использования. В основ­ном такая посуда выпускается стерильной, готовой к использованию. Пластины с лунками обрабатывают этиловым спиртом и стерилизуют ультрафиолетовым светом.

Для культуральных пробирок и флаконов выпускают пробки из нетоксичес­кой силиконовой резины. Обычные резиновые пробки и шланги перед исполь­зованием в работе с культурой ткани кипятят в 5 %-ном растворе углекислого натрия и споласкивают несколько раз в дистиллированной воде.

Самостоятельная работа студентов.

а) Изучить методические указания по теме б) Просмотреть под микроскопом готовые первичные и перевиваемые культуры клеток.

1. Преимущества и недостатки метода культивирования вирусов на культурах клеток.

2. Типы клеточных культур.

3. Классификацию и требования, предъявляемые к питательным средам и растворам.

4. С какой целью используют культуры клеток и тканей в вирусологических исследованиях.