Частота мейотического нерасхождения хромосом у мужчин с нарушением репродукивной функции 03. 02. 07 Генетика

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна

Федеральное государственное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник отдела гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите диссертаций на соискание ученой

степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

Хромосомные нарушения являются одной из главных причин аномалий развития эмбриона или плода. Приблизительно 30-50% случаев ранних доимплантационных потерь, около 30% случаев спонтанных абортов в течение первого триместра беременности и 6% случаев мертворождений или случаев младенческой смертности обусловлены наличием хромосомных аномалий (ХА) в клетках эмбриона/плода (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004; Лебедев И.Н., 2012). Наиболее высокие частоты встречаемости хромосомных заболеваний среди новорожденных характерны для трисомий по хромосомам 13, 18, 21, X и Y. В целом, среди новорожденных частота встречаемости конституциональных ХА составляет приблизительно 0,8-1% (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004).

Этиологическими факторами развития хромосомной патологии у потомства являются геномные и хромосомные мутации, которые приводят к изменению числа или структуры хромосом. Большинство трисомий по хромосомам в регулярной форме имеют гаметическое происхождение (Кулешов Н.П., 1979), поэтому исследование частоты встречаемости мужских и женских гамет с различными вариантами анеуплоидии является актуальной задачей современной биологии и медицины.

В гаметогенезе у человека естественным образом происходит формирование числовых и структурных ХА. К настоящему времени получены свидетельства того, что у здоровых женщин и у здоровых фертильных мужчин могут быть обнаружены гаметы с хромосомным дисбалансом (Guttenbach M. et al., 1997b). Однако вклад материнского и отцовского происхождения различных вариантов ХА в структуру причин ранней эмбриональной смертности и многих синдромальных форм хромосомной патологии у потомства не является одинаковым (Hunt P.A., Hassold T.J., 2002). По данным R.H. Martin частота нерасхождения хромосом в оогенезе в I-ом мейозе и во II-ом мейозе составляет приблизительно 20%, тогда как частота мейотического нерасхождения хромосом в сперматогенезе составляет приблизительно 1-2% (Martin R.H., 2008a).

В течение последних десятилетий в ряде исследовательских работ показано, что частота мейотического нерасхождения хромосом (или хроматид) в гаметогенезе у человека значительно варьирует в зависимости от группы хромосом, особенностей их структуры, и в зависимости от стадии мейоза, в течение которой произошла ошибка сегрегации хромосом (Abruzzo M.A., Hassold T.J., 1995; Hassold T.J., Hunt P.A., 2001; Hassold T.J. et al., 2007). При некоторых формах нарушения сперматогенеза частота мейотического нерасхождения хромосом может превышать референсные значения более чем в 3 раза (Martin R.H., 2007).

Применение методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) помогает решить проблему деторождения в ряде случаев мужского и женского бесплодия. Тем не менее, использование методов ВРТ увеличивает риск передачи генных и хромосомных мутаций, формирующихся de novo в ходе гаметогенеза у одного из родителей. Немаловажным является и то, что использование ВРТ для наступления беременности увеличивает риск по развитию хромосомной патологии эмбриона, которая не приводит к летальному исходу и ее наличие у плода совместимо с живорождением (Bonduelle M. et al., 2002). Данное обстоятельство указывает на необходимость исследования хромосомного набора зрелых мужских гамет при различных формах патозооспермии, в том числе в случаях наличия числовых и структурных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции.

Целью настоящей работы являлась оценка частот встречаемости сперматозоидов с различными вариантами анеуплоидии у мужчин с нарушениями репродуктивной функции и патозооспермией, в том числе у мужчин с числовыми и структурными ХА.

1. 
   Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом 46,XY.
   
2. 
   Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди пациентов с различными формами патозооспермии из супружеских пар с бесплодием и/или отягощенным акушерским анамнезом, а также в случаях наличия хромосомной патологии у эмбриона/плода или в случаях рождения ребенка с хромосомной патологией.
   
3. 
   Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с числовыми и структурными ХА.
   
4. 
   С помощью FISH-метода провести анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку или числовое нарушение хромосом, у мужчин со структурными или числовыми ХА в соматических клетках организма.
   
5. 
   Оценить состояние сперматогенеза у пациентов с различными формами патозооспермии и/или с конституциональными ХА методом количественного кариологического анализа незрелых половых клеток из эякулята.
   

В настоящей работе впервые проведен FISH-анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку, у мужчины с реципрокной транслокацией t(1;11)(q44;q21). Также впервые проведен FISH-анализ частоты встречаемости в сперматозоидах рекомбинантных хромосом у мужчины с перицентрической инверсией хромосомы 18 при кариотипе 46,XY,inv(18)(p11.23q21.1).

1. 
   Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором, с дисомией по хромосомам 13, 18 и 21, частота встречаемости сперматозоидов c XX, XY и YY дисомией среди мужчин с нормальным мужским кариотипом 46,XY и нормозооспермией в среднем составляет 0,37%, 0,11%, 0,05%, 0,20%, 0,04%, 0,17% и 0,06%, соответственно.
   
2. 
   Тяжелые формы нарушения сперматогенеза, умеренная или тяжелая форма олигоастенотератозооспермии у мужчин с нарушением репродуктивной функции, сопровождаются повышенной частотой мейотического нерасхождения хромосом.
   
3. 
   Хромосомы 21, X и Y в большей степени, чем хромосомы 13 и 18, предрасположены к мейотическому нерасхождению в гаметогенезе у мужчин.
   
4. 
   FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией может быть использован как метод определения доли зрелых мужских половых клеток со специфическим хромосомным дисбалансом.
   

Группы обследуемых пациентов сформированы из мужчин, обратившихся в лабораторию генетики нарушений репродукции ФГБУ «МГНЦ» РАМН по поводу бесплодия в браке, отягощенного акушерского анамнеза у супруги, случаев рождения детей с хромосомной патологией или по поводу клинического обследования с целью планирования деторождения. Препараты ПК 89 мужчин в возрасте от 24-х до 54-х лет (в среднем 35±7 лет) послужили материалом для проведения исследования. Контрольную группу составили 11 мужчин: 10 мужчин в статусе доноров спермы и один мужчина с нормозооспермией, с нормальным мужским кариотипом (46,XY) и подтвержденной фертильностью. Мужчины с олигоастенотератозооспермией (OAT) различной тяжести (27 человек) составили 1-ю группу. Мужчины с астенотератозооспермией (AT) (28 человек) составили 2-ю группу. Мужчины с конституциональными ХА, числовыми и структурными ХА, (23 человека) и с различными формами патозооспермии составили 3-ю группу. Для проведения ретроспективного анализа частот встречаемости конституциональных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции использовали архивные данные медицинских карт пациентов.

Анализ кариотипа по лимфоцитам периферической крови проводили по обще-

принятой методике, используя GTG-дифференциальное окрашивание (Захаров и др., 1982). Спермиологический анализ (СА) эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1999). Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (ККА НПК) проводили на препаратах ПК из эякулята по методу, предложенному проф. Л.Ф. Курило (Патент на изобретение №2328736, 2007 г.). Молекулярно-цитогенетический анализ мужских ПК проводили по методике, предложенной Martin и соавторами (Martin R.H. et al., 1993). Непосредственно нами оптимизирована методика предобработки сперматозоидов в растворе дитиотреитола для деконденсации хроматина головок сперматозоидов.

Для каждого пациента проводили молекулярно-цитогенетический анализ ПК по пяти хромосомам с использованием двух- и трехцветной FISH. Для двухцветной FISH использовали смесь локус-специфичных ДНК-зондов на хромосомы 13 и 21: LSI 13, локус гена ретинобластомы RB-1, 13q14, Spectrum Green, LSI 21, локусы D21S259, D21S341, D21S342, 21q22.13-q22.2, Spectrum Orange. Трехцветную FISH проводили со смесью ДНК-зондов, специфичных к альфа-сателлитным последовательностям центромерного и прицентромерного гетерохроматина хромосом 18, X и Y: CEP 18, локус D18Z1, 18p11.1-q11.1, Spectrum Aqua, CEP X, локус DXZ1, Xp11.1-q11.1, Spectrum Green, CEP Y, локус DYZ3, Yp11.1-q11.1, Spectrum Orange (Abbott Molecular Vysis Inc., U.S.A).

Для анализа мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в перестройку, у мужчин с конституциональными ХА проводили индивидуальный подбор ДНК-зондов. Использовали критерии молекулярно-цитогенетического анализа ПК, разработанные Williams и соавторами (Williams et al., 1993). Репрезентативность выборки определена согласно статистическому обоснованию величины выборки при исследовании редких событий, предложенной Плохинским (Биометрические методы, 1975).

Статистический анализ проводили в программе БИОСТАТ (Glantz S.A., 1999). Для проверки гипотезы о связи двух переменных использовали критерий Пирсона. Для анализа сопряженности значений частот сперматозоидов с ХА использовали t-критерий Стьюдента. Для сравнения частот сперматозоидов с ХА использовали критерий Манна-Уитни. Значение p<0,05 выбрано как статистически значимое.

Для выявления корреляции между частотой сперматозоидов с ХА, концентрацией сперматозоидов, долей сперматозоидов с поступательной подвижностью или долей сперматозоидов с нормальной морфологией проводили регрессионный анализ в программе STATISTICA 8.

По данным ретроспективного анализа среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии частота встречаемости конституциональных ХА составила 10% (рис. 1). Всего обследовано 2074 пациента за период с 1989 г. по 2011 г..

Р
ис. 1. Частота встречаемости конституциональных ХА среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии.

Спектр ХА среди мужчин с бесплодием представлен следующими вариантами ХА:

У мужчин со структурными ХА выявлена гетерогенность проявлений нарушения сперматогенеза (Гордеева Е.Г. и др., 2010). Cреди мужчин с Робертсоновскими транслокациями (RobТ) степень нарушения сперматогенеза варьировала от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до AT, при этом у одного мужчины (код пациента A8) выявлена нормозооспермия при направительном диагнозе - привычное невынашивание беременности. Среди мужчин с реципрокными транслокациями аутосом и инверсиями аутосом степень нарушения сперматогенеза варьировала также от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до AT и тератозооспермии (T).

В качестве референсных значений частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y в настоящей работе приняты значения частот сперматозоидов с анеуплоидией, полученные для 11-и здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,XY). Всего проанализировано 113 340 сперматозоидов. Результаты FISH-анализа представлены в табл. 1 и 2. Полученный широкий разброс значений (R) частот сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и Y, свидетельствует о наличии межиндивидуальных различий по частоте ошибок мейотического расхождения хромосом. Наиболее высокие значения частот исследованных вариантов ХА в мужских половых клетках при нормозооспермии характерны для гоносомных анеуплоидий – 0,56%, для диплоидного хромосомного набора – 0,37%, и для дисомии по хромосоме 21 – 0,2% (Гордеева Е.Г. и др., 2011).

Выбор пациентов для исследования происходил случайным образом, поэтому среди обследуемых мужчин выраженных форм мономорфной тератозооспермии с характерным одним типом морфологических аномалий сперматозоидов ни в одном случае не выявлено. Первую и вторую группу обследуемых составили мужчины с наиболее часто встречающимися сочетанными формами патозооспермии – с AT и OAT различной тяжести, во всех случаях при проведении СА согласно рекомендациям ВОЗ (1999) у пациентов была выявлена полиморфная тератозооспермия в сочетанной форме (WHO, 1999). Среди обследованных у 35-и из 56-и мужчин выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены профазы I мейоза. Ассоциации между наличием признаков частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены профазы I мейоза, и повышенной частотой встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у обследованных мужчин мы не выявили.

В ходе работы FISH-методом проанализировано 270 894 сперматозоида. Средние по группам значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y представлены в табл. 1 и 2. В контрольной группе и во всех группах обследованных пациентов мы наблюдали межхромосомные вариации частот сперматозоидов с анеуплоидией, в среднем значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 и с дисомией по половым хромосомам превосходят значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13 и 18, соответственно.

Среди пациентов в 1-й и во 2-й группе, как и в контрольной группе, наблюдался широкий разброс значений (R) частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и Y.

В среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нарушением репродуктивной функции и патозооспермией превосходит частоту встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,XY). В зависимости от степени нарушения сперматогенеза и от формы патозооспермии частота встречаемости анеуплоидных гамет может превосходить референсные значения в 1,5-3 раза и более (рис. 2).

При выполнении анализа полученных результатов каждую форму патозооспермии, олигозооспермию, астенозооспермию и тератозооспермию рассматривали как самостоятельную или отдельную качественную или количественную характеристику состояния сперматогенеза у пациентов, изменение

Табл. 2. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 18, X и Y (%) у мужчин с нормозооспермией, AT и OAT различной тяжести.

В среднем высокую частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией мы наблюдали при снижении концентрации сперматозоидов, при олигозооспермии различной тяжести.

Регрессионный анализ показал, что характер изменения частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией при снижении концентрации сперматозоидов в эякуляте может быть достаточно точно описан гиперболической (или степенной) функцией (r = -0,64, p<0,01), но не линейной (r = -0,36, p<0,01) (рис. 3).




* - статистически значимые отличия (p<0,05).
Рис. 2. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нормозооспермией (N), AT и OAT.

У пациентов с тяжелыми формами нарушения сперматогенеза при концентрации сперматозоидов ниже 10 млн/мл (OAT II-III) в среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y выше на один порядок, чем среди здоровых мужчин с нормозооспермией (Гордеева Е.Г. и др., 2013). Наиболее высокие уровни анеуплоидии сперматозоидов характерны для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии, при концентрации сперматозоидов ниже 1 млн/мл.

Не выявлено сильной взаимосвязи повышения уровня анеуплоидии сперматозоидов и диплоидных ПК и снижения поступательной подвижности сперматозоидов (r = -0,29, p=0,02). Корреляционная зависимость доли морфологически нормальных сперматозоидов и частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией также достаточно слабая (r = -0,29, p=0,02).

На основании проведенной работы мы полагаем, что высокая частота мейотического нерасхождения хромосом в большей степени сопряжена с изменением такого показателя СА, как концентрация сперматозоидов в эякуляте.

Р
ис. 3. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нормозооспермией, c различными формами патозооспермии и нормальным мужским кариотипом 46,XY. Даны уравнения регрессии и показана обратная зависимость изменения частоты сперматозоидов с анеуплоидией и изменения концентрации сперматозоидов. Коэффициент корреляции Пирсона (линейная функция) r = -0,36, (степенная функция) r = -0,64.

Частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у мужчин с хромосомной патологией у потомства

Среди мужчин из 2-й группы условно выделена подгруппа пациентов с отягощенным акушерским анамнезом у супруги, со случаями хромосомной патологии у эмбриона/плода или новорожденного. В этой подгруппе у двух мужчин с ХА у потомства обнаружены повышенные частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией. У мужчины (код пациента 63), с отметкой в анамнезе у супруги о беременности плодом с кариотипом 47,+21, частота сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 составила 0,68%, тогда как частоты сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13, 18, X и Y не превышали референсных значений. У пациента (код пациента 62), отца ребенка с синдромом Дауна, выявлены повышенные частоты встречаемости сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21, с XY дисомией и с диплоидным хромосомным набором, которые составили 0,42%, 0,58%, и 3,19%, соответственно (Гордеева Е.Г. и др., 2013).