Циклоспорин а-чувствительное, кальций-независимое разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени крыс 03. 01. 04 ─ биохимия

На правах рукописи

РЫБАКОВА СНЕЖАНА РАФАИЛОВНА

Циклоспорин А-чувствительное, кальций-независимое разобщающее действие

жирных кислот в митохондриях печени крыс

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань 2013

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии и в лаборатории молекулярной биоэнергетики ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет» (г. Йошкар-Ола)
Научный руководитель: Самарцев Виктор Николаевич,

доктор биологических наук, профессор

Защита диссертации состоится «14» ноября 2013 г. в 13.00 часов

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор

биологических наук, профессор Абрамова Зинаида Ивановна

Естественными метаболитами монокарбоновых жирных кислот являются α,ω-диоловые (α,ω-дикарбоновые) кислоты, образующиеся в клетках печени путем ω-окисления их монокарбоновых аналогов (Ferdinandusse et al., 2004; Wanders et al., 2011). Показано, что одна из таких кислот – α,ω-тетрадекандиоловая, стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала (Маркова и др., 1999). Необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на выяснение механизма разобщающего действия как монокарбоновых жирных кислот, так и α,ω-диоловых кислот.

В качестве возможного инструмента для исследования действия жирных кислот наше внимание привлек циклоспорин А, нейтральный липофильный циклический ундеканпептид, хорошо известный как эффективный иммуносупрессор (Schreiber and Crabtree G.R., 1992; Mathieson, 2000). В митохондриях печени циклоспорин А связывается с высоким сродством с пептидил-пролил цис-транс изомеразой (циклофилин D) и препятствует индукции кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры) уже при его концентрации 150 – 300 нМ (Halestrap and Davidson, 1990; Andreeva and Crompton, 1994). Вместе с тем остается не известным, как влияет циклоспорин А в более высокой концентрации (5 – 10 мкМ) на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени. Можно предположить, что циклоспорин А, будучи нейтральным липофильным соединением, но в то же время имея способные формировать водородные связи полярные группы, в высокой концентрации мог бы оказывать влияние на разобщающее действие свободных моно- и дикарбоновых жирных кислот.

Митохондрии печени месячных крысят массой 50 г. по сравнению с митохондриями печени взрослых крыс массой 250 г. имеют более высокую скорость дыхания как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты (Самарцев и др., 2004). Представляет интерес выяснить как влияет циклоспорин А на разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени крыс различного возраста.

1. Выявить влияние циклоспорина А в концентрации 5-10 мкМ на показатели дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс.

2. Исследовать действие циклоспорина А (5-10 мкМ) на стимулированное пальмитиновой и лауриновой кислотами дыхание митохондрий печени крыс.

3. Определить влияние циклоспорина А в концентрации 5-10 мкМ на сниженный жирными кислотами мембранный потенциал митохондрий печени крыс.

4. Исследовать влияние α,ω-тетрадекандиоловой кислоты на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени крыс в отсутствии и присутствии циклоспорина А.

5. Сравнить влияние циклоспорина А в эффективной концентрации на стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий печени крыс разного возраста.

1. В митохондриях печени животных составляющая часть разобщающей активности монокарбоновых жирных кислот, не связанная с функционированием ADP/ATP- аспартат/глутаматного антипортеров, и разобщающая активность α,ω-дикарбоновых кислот осуществляется по одному и тому же механизму внутреннего разобщения.

2. Циклоспорин А в концентрации 10 мкМ может быть использован как инструмент для оценки степени индукции моно- и α,ω-дикарбоновыми жирными кислотами внутреннего разобщения в митохондриях печени животных.

3. Активность пальмитиновой кислоты как индуктора свободного окисления в митохондриях печени крыс по механизму внутреннего разобщения зависит от возраста этих животных.

В состоянии 2, т.е. при условии отсутствия синтеза АТР и без разобщителей, митохондрии потребляют кислород с небольшой скоростью, а циклоспорин А даже в концентрации 10 мкМ не оказывает какого-либо существенного влияния на скорость дыхания (рис. 1, кривая а). Классический протонофорный разобщитель ФКФ, будучи добавленный к митохондриям печени в концентрации 60 нМ, стимулирует дыхание в 2 раза, и при этих условиях циклоспорин А также не эффективен (рис. 1, кривая б).

Как показано в таблице 1, циклоспорин А в концентрации 10 мкМ не оказывает влияния на скорости дыхания в состоянии 2 (J₂), в состоянии 4 (J₄), а также на скорость дыхания при максимальном разобщающем действии 50 мкМ 2,4-динитрофенола (J_u), но снижает как скорость дыхания в состоянии 3 (J₂), так и скорость фосфорилирования ADP (J_Р) на 18% (таблица 1). Вместе с тем при этих условиях циклоспорин А не оказывает влияния на характеризующие эффективность окислительного фосфорилирования коэффициенты RC и ADP/O (таблица 1).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что циклоспорин А в концентрации 10 мкМ, т.е. в значительно большей, чем та в которых он обычно применяется для подавления индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (Halestrap and Davidson, 1990; McGuinness et al., 1990; Andreeva and Crompton, 1994), не оказывает влияния на дыхание митохондрий печени в состояниях 2 и 4, а также при условии максимальной стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом. В этой же концентрации циклоспорин А вызывает небольшое снижение скорости дыхания в состоянии 3 (J₃), и скорости фосфорилирования ADP, что, по-видимому, связано с влиянием этого пептида непосредственно на систему синтеза АТР (F₀F₁-АТР-синтаза) и (или) на обменный транспорт ADP на АТР через внутреннюю мембрану митохондрий.

Рис. 1. Отсутствие влияния циклоспорина А на дыхание митохондрий печени в состоянии 2 (а) и при условии стимуляции дыхания ФКФ в 2 раза (б). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, среда инкубации дополнительно содержала БСА (0,2 мг/мл). Мит – митохондрии печени (1 мг/мл), ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ФКФ – 60 нМ, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

* Различия между опытом (присутствие циклоспорина А) и контролем (его отсутствие) статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

На рис. 2 приведены данные сравнительных исследований разобщающего действия пальмитиновой кислоты в концентрации 30 мкМ при температуре 25ºС и 37ºС. Как видно из и рис. 2 пальмитиновая кислота в концентрации 30 мкМ стимулирует дыхание митохондрий приблизительно в равной степени (в 2,7 раза) как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС. Последующее добавление карбоксиатрактилата и глутамата приводит к частичному ингибированию дыхания, что свидетельствует об их способности подавлять разобщающее действие жирных кислот, т.е. о ресопрягающем действии (Samartsev et al., 1997a; 1997b; Самарцев и др., 2011). Добавление циклоспорина А в концентрации 10 мкМ после глутамата приводит к полному подавлению разобщающего действия пальмитиновой кислоты как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС (рис. 2).

Для количественной оценки степени участия ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных применялись величины ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата) соответственно (Samartsev et al., 1997b; Самарцев и др., 1999). Установлено, что ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата, глутамата и циклоспорина А одинаковы как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС. все последующие эксперименты были проведены при температуре 25ºС.

Рис. 2. Влияние карбоксиатрактилата, глутамата и циклоспорина А на стимулируемое пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий печени при температурах 25ºС (а) и 37ºС (б). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части. Мит – митохондрии печени (1 мг/мл), Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Глу – 2 мМ глутамата калия, ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

В следующих экспериментах (таблица 2) циклоспорин А был внесен в ячейку сразу после добавления митохондрий. Как видно из таблицы, если в отсутствии циклоспорина А пальмитиновая кислота в концентрации 30 мкМ стимулирует дыхание митохондрий в 2,36 раза, то в присутствии – в 2,09 раза. При этом в присутствии циклоспорина А карбоксиатрактилат и глутамат способны полностью подавлять стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание (таблица 2).
Таблица 2 ─ Ингибирование карбоксиатрактилатом и аспартатом стимулированного пальмитатом дыхания митохондрий печени крыс в отсутствии (контроль) и присутствии циклоспорина А

Добавки	Скорость дыхания, нмоль О2/мин на 1 мг белка
	Контроль (n = 4)	Циклоспорин А (n = 4)
Без добавок Пал Пал + Катр Пал + Катр + Асп Пал + Катр + Асп + ДНФ	11,1 ± 0,5 25,3 ± 1,2 19,1 ± 0,6 13,9 ± 0,4 78,2 ± 3,6	10,9 ± 0,4 22,6 ± 1,1 16,3 ± 0,5* 11,2 ± 0,4* 77,6 ± 3,4

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и на рис. 5. Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп – 3 мМ аспартата калия, 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.

* Различия между опытом (присутствие циклоспорина А) и контролем (его отсутствие) статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Циклоспорин А существенно уменьшает разобщающую активность лауриновой кислоты, но при этом не влияет на составляющие разобщающей активности чувствительную к карбоксиатрактилату и чувствительную к глутамату. Следовательно, и при разобщении лауриновой кислотой действие циклоспорина А не связано с его влиянием на ADP/ATP- и аспартат/глутаматный антипортеры.

По аналогии с карбоксиатрактилатом и глутаматом способность циклоспорина А ингибировать разобщающее действие лауриновой кислоты также была выражена количественно как ресопрягающий эффект. При добавлении циклоспорина А после лауриновой кислоты, карбоксиатрактилата и глутамата его ресопрягающий эффект составляет 26,1 ± 1,0 % (n = 4), в отсутствие карбоксиатрактилата и глутамата – 27,0 ± 1,6 % (n = 4). Карбоксиатрактилат и глутамат не влияют на составляющую разобщающей активности, чувствительную к циклоспорину А (J_CsA).

На рис. 3 приведены результаты исследования зависимости ресопрягающего эффекта циклоспорина А от его концентрации. Как видно из рисунка 3, в низкой концентрации 0,5 и 1 мкМ циклоспорин А неэффективен и его ресопрягающий эффект проявляется только в концентрации 2 мкМ и выше, т.е. в существенно больше чем та, в которой он эффективно ингибирует кальций-зависимую неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий (Halestrap and Davidson, 1990; McGuinness et al., 1990; Andreeva and Crompton, 1994).

Рис. 3. Зависимость ресопрягающего эффекта циклоспорина А от его концентрации при разобщении митохондрий печени лауриновой кислотой в концентрации 30 мкМ. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и в примечании к таблице 3. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 4).

Опыты с измерением разности электрических потенциалов (ΔΨ) на внутренней мембране митохондрий с помощью ТФФ-селективного электрода нередко проводятся в присутствии нигерицина, который, как известно, способен превращать ΔрН в ΔΨ (Скулачев, 1989; Samartsev et al., 1997а; 2000). Это необходимо для устранения возможных артефактов, связанных с изменением ΔΨ в присутствии пальмитиновой и лауриновой кислот. Концентрация применяемого в настоящей работе нигерицина 20 нМ является оптимальной, поскольку дальнейшее её увеличение не приводит к повышению ΔΨ (Samartsev et al., 1997; 2000). Установлено, что в этой концентрации нигерицин уменьшает ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата, но увеличивает ресопрягающий эффект циклоспорина А. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что вызванное нигерицином превращение ΔрН в ΔΨ приводит к ингибированию разобщающей активности пальмитиновой кислоты при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров и одновременно к увеличению разобщающей активности этой жирной кислоты при участии структуры, чувствительной к циклоспорину А.

Как видно из рисунка 4, добавление нигерицина к митохондриям приводит к повышению Ψ, а последующее добавление пальмитиновой кислоты – к снижению Ψ. Добавление карбоксиатрактилата и глутамата приводит к повышению Ψ (ресопрягающий эффект), что хорошо согласуется с известными данными (Samartsev et al., 1997a). Совместное ресопрягающее действие карбоксиатрактилата и глутамата приводит к полному восстановлению Ψ, в этом случае циклоспорин А обладает слабым эффектом на Ψ (рис. 4).

Рис. 4. Влияние карбоксиатрактилата (Катр), глутамата (Глу) и циклоспорина А (ЦсА) на ΔΨ митохондрий печени в присутствии нигерицина (Ниг) и пальмитиновой кислоты (Пал). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и в примечании к таблице 4. Среда инкубации была дополнена 1,6 мкМ хлоридом тетрафенилфосфония (ТФФ).

В отсутствии нигерицина внесение циклоспорина А к митохондриям после лауриновой кислоты приводит к снижению Ψ. Аналогичным образом действует циклоспорин А на Ψ и в отсутствии жирных кислот. Полученные результаты свидетельствуют о том, что циклоспорин А не только не повышает Ψ, как следовало бы ожидать исходя из его действия на дыхание митохондрий печени как ресопрягающего агента, но даже понижает этот потенциал.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в митохондриях печени разобщающее действие жирных кислот полностью подавляется при совместном действии карбоксиатрактилата, аспартата (или глутамата) и циклоспорина А. В отличие от карбоксиатрактилата и глутамата, циклоспорин А в указанной выше концентрации не влияет на мембранный потенциал митохондрий в присутствии жирных кислот. Полученные результаты позволяют предположить, что стимуляция дыхания митохондрий печени жирными кислотами обусловлена, помимо их протонофорного действия при участии ADP/АТР-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера, еще и активацией транспорта электронов по дыхательной цепи без снижения мембранного потенциала. Такой механизм активации свободного окисления в митохондриях известен под названием «внутреннее разобщение комплексов дыхательной цепи» (Van Dam et al., 1990; Papa et al., 2006).

Известно, что α,ω-тетрадекандиоловая кислота (ТДК) стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала, в то время как карбоксиатрактилат и глутамат не влияют на дыхание (Маркова и др., 1999). Как видно из рис. 5 (кривая а ), ТДК в концентрации 400 мкМ увеличивает скорость дыхания митохондрий печени почти в 2 раза. Последующее добавление к митохондриям циклоспорина А в концентрации 10 мкМ приводит к ингибированию дыхания до исходного уровня. В том случае, если циклоспорин А был добавлен к митохондриям в начальный момент их инкубации, стимуляции дыхания ТДК не наблюдалось (кривая б). Эти данные получены при стандартной для биохимических исследований температуре 25°С. Аналогичные результаты получены при температуре 37°С (кривые в и г). Во всех случаях последующее добавление протонофорного разобщителя 2,4-динитрофенола в оптимальной концентрации 50 мкМ приводит к стимуляции дыхания приблизительно в 7 раз (рис. 5). Полученные результаты подтверждают известные ранее данные о способности ТДК активировать свободное окисление в митохондриях печени (Маркова и др., 1999). Новым является то, что стимулирующее действие этой жирной кислоты практически полностью устраняется циклоспорином А.

Рис. 5. Сравнение действия на дыхание митохондрий печени циклоспорина А при добавлении его до (кривые а и в) и после (кривые б и г) ТДК при температуре 25°C (кривые а и б) и 37°C (кривые в и г). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в разделе «Материалы и методы». Мит – митохондрии (1 мг/мл); ЦсА – циклоспорин А, 10 мкМ; ТДК, 400 мкМ; ДНФ – 2,4-динитрофенол, 50 мкМ. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

Зависимость скорости дыхания митохондрий печени в состоянии 2 и в состоянии 4 от концентрации ТДК линейна. Это позволяет для характеристики активности ТДК использовать величину удельной активности (V_a) и коэффициент активности α.

Как показали проведенные исследования, P_i не оказывает влияния на активность ТДК (таблица 3). Олигомицин, в концентрации полностью ингибирующей окислительное фосфорилирование, не изменяет активность ТДК как в отсутствии, так и в присутствии P_i (таблица 3). В присутствии олигомицина и P_i ADP также не влияет на активность ТДК (таблица 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемый эффект ТДК не связан с влиянием на F₀F₁-АТР-синтазу и отличается от действия мембранотропных разобщителей.
Таблица 3 ─ Удельная активность (V_a) ТДК в митохондриях печени при различных экспериментальных условиях

Экспериментальные условия	Va , нМ О2/ мин на 1 мкМ ТДК
Без добавок (n = 6) Олигомицин (n = 4) Pi (состояние 2) (n = 5) Pi (состояние 4) (n = 4) Pi + АТР (n = 3) Pi + олигомицин (n = 3) Pi + олигомицин + ADP (n = 3)	14,9 ± 0,6 15,6 ± 0,4 16,8 ± 1,0 22,8 ± 0,4* 15,4 ± 0,4 16,1 ± 0,6 15,1 ± 0,5

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в разделе «Материалы и методы» и на рис. 5. Олигомицин, 2 мкг/мл; P_i, 5 мМ; АТР, 200 мкМ; ADP, 200 мкМ, Нигерицин 20 нМ. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 3 – 6).

* Различия между значеньями удельной активности ТДК в состоянии 2 и в состоянии 4 статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Ранее уже отмечалось (Маркова и др., 1999), что действие ТДК на митохондрии похоже на действие десопрягающих агентов, которые, как полагают, переключают работу комплексов дыхательной цепи на холостой режим, или, говоря по-другому, осуществляют внутреннее разобщение (Van Dam et al., 1990; Papa et al., 2006). Проведенные в настоящей работе исследования, позволившие исключить другие известные пути стимуляции дыхания митохондрий, свидетельствуют в пользу такого механизма действия ТДК. Можно предположить, что циклоспорин А, будучи нейтральным липофильным соединением, но в то же время имея полярные группы, способен формировать водородные связи в гидрофобной области мембраны с полярными группами мембранных белков. Возможно, что подобным образом циклоспорин А затрудняет взаимодействие ТДК с сайтами комплексов дыхательной цепи и, вследствие этого, препятствует переводу их в холостой режим. Существует мнение, что внутреннее разобщение комплексов дыхательной цепи отсутствует в условиях окислительного синтеза АТР (Papa et al., 2006). Полученные в настоящей работе данные, показывающие отсутствие влияния ТДК на коэффициент ADP/O, вполне согласуются с этой точкой зрения.

Результаты проведенных исследований позволяют говорить о том, что имеется общее в механизме действия моно- и дикарбоновых жирных кислот. По-видимому, составляющая разобщающего действия монокарбоновых жирных кислот, чувствительная к циклоспорину А, и разобщающее действие α,ω-диоловых кислот осуществляется по одному и тому же механизму внутреннего разобщения. Обращает на себя внимание то, что циклоспорин А в концентрации 10 мкМ практически полностью подавляет часть разобщающей активности монокарбоновых жирных кислот, не связанной с функционированием ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, и разобщающую активность α,ω-дикарбоновых кислот. Следовательно циклоспорин А может быть использован как инструмент для оценки степени индуцированного этими моно- и α,ω-дикарбоновыми жирными кислотами внутреннего разобщения.

На рис. 6 приведена гипотетическая схема, объясняющая действие моно- и α,ω-дикарбоновых жирных кислот как индукторов внутреннего разобщения в митохондриях печени. Эта схема основывается на концепции локального сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях (Yaguzhinsky et al., 2006; Papa et al., 2006). Согласно этой концепции, в течение окислительного синтеза АТР выбрасываемые комплексами дыхательной цепи протоны непосредственно передаются на комплекс F₀F₁-АТРсинтазу (рис 6, а). Часть протонов диффундирует в объемную водную фазу межмембранного пространства и возвращается обратно в матрикс путем пассивной утечки через внутреннюю мембрану. В этом случае монокарбоновые жирные кислоты могут усиливать пассивную утечку, действуя как разобщители-протонофоры при участии ADP/ATP- и аспартата/глутаматного антипортеров, в то время как α,ω-дикарбоновые кислоты не эффективны. Предполагается, что в отсутствии синтеза АТР протоны, минуя F₀F₁-АТР-синтазу, возвращаются обратно к комплексам дыхательной цепи (рис 6, б). Этот процесс, рассматриваемый нами как внутреннее разобщение окислительного фосфорилирования, значительно усиливается с помощью моно- и α,ω-дикарбоновых жирных кислот и подавляется циклоспорином А.

Митохондрии печени месячных крысят массой 50 г. по сравнению с митохондриями печени взрослых крыс массой 250 г. имеют более высокую скорость дыхания как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты и это различие в наибольшей степени обусловлено за счет составляющей разобщающей активности не чувствительной к карбоксиатрактилату и глутамату (V_Ins) (Самарцев и др., 2004). Можно было бы полагать, что в митохондриях печени крысят составляющая разобщения V_Ins также будет полностью подавляться циклоспорином А. Однако нельзя исключить и то, что более высокие значения V_Ins в митохондриях печени крысят связаны с функционированием еще одной системы разобщения.

Как показано в таблице 4, скорость дыхания митохондрий печени месячных крысят как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты превышает аналогичные показатели митохондрий печени взрослых крыс, что подтверждает опубликованные ранее данные (Самарцев и др., 2004). Разобщающее действие пальмитиновой кислоты в том и в другом случае эффективно подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом (таблица 6), что свидетельствует об участии в разобщении ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров. Выше уже отмечалось, что полное подавление разобщающего действия пальмитиновой кислоты достигается при добавлении после карбоксиатрактилата и аспартата циклоспорина А. В митохондриях печени месячных крысят полное подавление разобщающего действие пальмитиновой кислоты также достигается при последующем добавлении циклоспорина А (таблица 6). Установлено, что в митохондриях печени месячных крысят ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата меньше, а циклоспорина А больше, чем в митохондриях печени взрослых крыс.
Таблица 4 ─ Сравнение скорости дыхания митохондрий печени крыс массой 250 г. и крысят массой 50 г. в присутствии пальмитата и при последующем добавлении карбоксиатрактилата, аспартата и циклоспорина А

Добавки	Скорость дыхания (нмоль О2/мин на 1мг белка)
	Митохондрии крыс массой 250 г (n = 6)	Митохондрии крысят массой 50 г (n = 6)
Без добавок Пал Пал + Катр Пал + Катр + Асп Пал + Катр + Асп + ЦсА Пал + Катр + Асп + ЦсА+ДНФ	10,8 ± 0,3 24,3 ± 0,8 18,2 ± 0,8 13,4 ± 0,5 10,8 ± 0,3 77,6 ± 3,3	15,1 ± 0,9* 35,5 ± 1,9* 27,7 ± 1,2* 22,4 ± 1,2* 15,1 ± 0,9* 76,9 ± 3,1

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и на рис. 23. Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп – 3 мМ аспартата калия, ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.

* Различия между показателями митохондрий печени крыс массой 250 г и крысят массой 50 г статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

В следующих экспериментах, проведенных на митохондриях печени месячных крысят, циклоспорин А был добавлен непосредственно после внесения митохондрий. В этом случае циклоспорин А в концентрации 10 мкМ не влияет на дыхание митохондрий в контролируемом состоянии (в отсутствие синтеза АТР и разобщителей) и при максимальной стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом, но приводит к снижению скорости дыхания в присутствии пальмитиновой кислоты и при последующем добавлении карбоксиатрактилата и аспартата на одну и ту же величину. Под влиянием циклоспорина А ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата увеличиваются и в сумме достигают 100%.

Рис. 7. Сравнение удельной разобщающей активности пальмитиновой кислоты (VU) и ее составляющих частей: чувствительной к карбоксиатрактилату (VC), чувствительной к аспартату (VA) и чувствительной к циклоспорину А (VCsА) в митохондриях печени крыс массой 250 г (1) и крысят массой 50 г (2). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в примечании к таблице 6. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 6). * Различия между показателями митохондрий печени крыс массой 250 г. и крысят массой 50 г. статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

1. Циклоспорин А в концентрации 10 мкМ не оказывает влияния на дыхание митохондрий печени в состояниях 2 и 4, а также при максимальной стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом, но вызывает снижение скорости дыхания в состоянии 3, и скорости фосфорилированияADP.

2. Циклоспорин А в концентрациях 5 и 10 мкМ ингибирует стимулированное пальмитиновой и лауриновой кислотами дыхание митохондрий печени как в отсутствие, так и в присутствии карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата).

3. Циклоспорин А концентрации 10 мкМ не влияет на мембранный потенциал митохондрий в присутствии жирных кислот при добавлении его после карбоксиатрактилата и глутамата.

4. α,ω-Тетрадекандиоловая кислота обратимо стимулирует дыхание митохондрий печени по механизму внутреннего разобщения окислительного фосфорилирования только в отсутствие синтеза АТР. Стимулирующее действие α,ω-тетрадекандиоловой кислоты полностью устраняется циклоспорином А в концентрации 10 мкМ.

5. Активность пальмитиновой кислоты как внутреннего разобщителя окислительного фосфорилирования в митохондриях печени зависит от возраста крыс – больше в митохондриях печени месячных крысят, чем взрослых крыс.

1. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Рыбакова С.Р. Циклоспорин А ингибирует протонофорную разобщающую активность лаурата в митохондриях печени // Биологические мембраны. – 2008. – Т. 25. – № 3. – С. 191–195. (Перевод: Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. – 2008. – Vol. 2. – № 2. – P. 139–143).

2. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Рыбакова С.Р. Зависимость разобщающей активности пальмитата в митохондриях печени от массы тела крыс различного возраста // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 2010. – Т. 46. – № 2. – С. 164–166. (Перевод: Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. – 2010. – Vol. 46. – № 2. – P. 198–201).

3. Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Самарцев В.Н. Особенности активации свободного окисления в митохондриях печени α,ω-тетрадекандиоловой кислотой // Биологические мембраны. – 2013. – Т. 30. – № 1. – С. 30–39.

4. Самарцев В.Н., Рыбакова С.Р., Дубинин М.В. Взаимодействие свободных жирных кислот с митохондриями в процессе разобщения окислительного фосфорилирования // Биофизика. – 2013. – Т. 58. – Вып. 3. – С. 481–487.

Статьи, тезисы докладов региональных, всероссийских и международных конференций:

1. Самарцев В.Н., Рыбакова С.Р., Кожина О.В., Марчик Е.И. Циклоспорин А-чувствительное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени без участия ионов кальция // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: международная конференция (Пущино, 2–4 июня 2009 г.): сборник статей. - Пущино, 2009. – Т. 2. – С. 624–627.

2. Рыбакова С.Р., Самарцев В.Н. Влияние циклоспорина А на индуцированное жирными кислотами дыхание митохондрий печени крыс различного возраста // Тринадцатые Вавиловские чтения. Глобализация. Глобалистика. Потенциалы и перспективы России в глобальном мире: материалы постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием. – Йошкар-Ола, 2010. – С. 191–192.

3. Рыбакова С.Р., Самарцев В.Н. Сравнительное исследование циклоспорин А-чувствительного кальций-независимого разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс различного возраста // Актуальные проблемы экологии, биологии и химии: материалы Всероссийской конференции. – Йошкар-Ола: Мар. гос. ун-т, 2010. – Вып. 1. – С. 213–214.

4. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Марчик Е.И., Рыбакова С.Р., Шамагулова Л.В. Взаимодействие жирных кислот с митохондриями печени: механизмы и физиологическое значение // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: сборник трудов первой международной научно-практической конференции, 23–26.11.2010 г. – СПб., 2010. – Т. 1. – С. 213–214.

5. Марчик Е.И., Рыбакова С.Р., Самарцев В.Н. Транспорт ионов как фактор регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени // Биология – наука XXI века. 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18–22 апреля 2011 г.): сборник тезисов. – Пущино, 2011. – С. 98.

6. Самарцев В.Н., Марчик Е.И., Рыбакова С.Р., Чернядьева А.В. Изучение механизмов регуляции кальций-независимого разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: международная конференция (Пущино, 24–26 мая 2011 г.): сборник статей. – Пущино, 2011. – С. 715–718.

7. Рыбакова С.Р., Самарцев В.Н. Влияние α,ω-тетрадекандикарбоновой кислоты на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени // Актуальные проблемы экологии, биологии и химии: сборник материалов Всероссийской конференции.– Йошкар-Ола: Мар. гос. ун-т, 2011. – Вып.2. – С. 190-192.

8. Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Самарцев В.Н. Циклоспорин А-чувствительная стимуляция дыхания митохондрий печени α,ω-тетрадекандикарбоновой кислотой без участия ионов кальция // Биология – наука XXI века. 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16 – 21 апреля 2012 г.): сборник тезисов. – Пущино, 2012. – С. 192.

9. Рыбакова С.Р., Самарцев В.Н. Особенности взаимодействия с митохондриями печени различных предельных жирных кислот, отличающихся длиной цепи // Актуальные проблемы экологии, биологии и химии: материалы конференции по итогам НИР БХФ за 2011.– Йошкар-Ола: Мар. гос. ун-т, 2012. – Вып. 3. – С. 34–35.

10. Самарцев В.Н., Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Григорьева Л.В., Чернядьева А.В. Особенности взаимодействия свободных предельных жирных кислот различной длины цепи с митохондриями в процессе разобщения окислительного фосфорилирования // IV съезд биофизиков России 20-26 августа 2012 г. Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток»: материалы докладов. – Нижний Новгород, 2012. – С. 259.

11. Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Иванова А.Е., Самарцев В.Н. Изучение механизмов активации свободного окисления в митохондриях печени α,ω-тетрадекандикарбоновой кислотой // Международная конференция молодых ученых. 22-24 октября 2012 г. «Экспериментальная и теоретическая биофизика `12»: сборник тезисов. – Пущино, 2012. – С. 93–94.

БСА – бычий сывороточный альбумин;

ДНФ – 2,4-динитрофенол;

ТДК – α,ω-детрадекандикарбоновая кислота;

ТФФ⁺ – катион тетрафенилфосфония;

ФКФ – n-трифторометоксикарбонилцианидфенилгидразон;

EGTA – этиленгликоль - бис - (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N¢, N¢ - тетрауксусная кислота;

ADP – аденозин-5’-дифосфат;

ATP – аденозин-5’-трифосфат;

ADP/O – стехиометрический коэффициент, показывающий эффективность окислительного фосфорилирования (P/O, ATP/O);

HEPES – N-2- гидроксиэтилпиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота; буфер;

P_i – фосфат неорганический;

DY – разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий;

ΔрН – разность концентраций ионов водорода по обе стороны внутренней мембраны митохондрий.