Цитофизиологические основы взаимоотношений организмов в патосистеме «Puccinia triticina Erikss виды семейства p о aceae Barnh.»

Специальность 03.00.24 – Микология

03.00.12 – Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009
Работа выполнена на кафедре селекции, генетики и физиологии растений ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»

Научный консультант –	доктор биологических наук, профессор Дьяков Юрий Таричанович
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук Лапочкина Инна Федоровна, доктор биологических наук Лекомцева Светлана Николаевна,
	доктор биологических наук Мазин Валентин Викторович
Ведущая организация –	Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений

Защита состоится 29 мая 2009 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.46 при биологическом факультете МГУ им. М. В. Ломоносова

по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, к. 12, ауд. М-1.

тел / факс (0495)9393970

Автореферат разослан «6 » апреля 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета –

кандидат биологических наук М. А. Гусаковская

Общая характеристика работы
Актуальность работы. Возбудитель бурой ржавчины Puccinia triticina Erikss. – специализированный биотрофный паразит, поражающий мягкую пшеницу Triticum aestivum L. и другие виды злаков. В биоценозах происходит процесс сопряженной эволюции, приводящий к преодолению грибами устойчивости растений. В агроценозах микроэволюционные процессы существенно ускорились, что приводит к развитию болезней и ежегодным потерям урожая.

Специализированные патогены способны развиваться на ограниченном круге видов, которые становятся для них хозяевами. Остальные виды не поражаются и являются видами-нехозяевами (nonhosts) (Heath, 1981), они защищены видовым иммунитетом (Вавилов, 1986). Генофонд культурных растений постоянно пополняется интрогрессированными генами, при этом отдельные гены устойчивости регулярно преодолеваются, в то время как видовой иммунитет остается стабильным. В связи с этим фундаментальные основы видового иммунитета привлекают пристальное внимание исследователей.

Некоторые сорта с моно-, олиго- и полигенным контролем сохраняют устойчивость длительное время при интенсивном возделывании (Parlevliet, 1993; Михайлова, 2005). Следует отметить, что, несмотря на селекционные достижения, мало известно о проявлении интрогрессированных генов в геноме культурных растений и механизмах длительной устойчивости. Не исследованы цитологические аспекты эволюции взаимоотношений патогенов с растениями при возникновении признака вирулентности.

Цитологические исследования вносят весомый вклад в изучение взаимодействия патогенных микроорганизмов с растениями и являются одним из основных направлений фитоиммунологии. Наиболее активно цитологические исследования на различных патосистемах проводили в 60–80-х гг. ХХ в. СССР основные цитофизиологические исследования взаимоотношений возбудителей стеблевой и желтой ржавчины с пшеницей были проведены под руководством Ю.М. Плотниковой в ГБС АН СССР в 70–80-х гг. ХХ в. Возбудитель бурой ржавчины пшеницы P. triticina наименее изучен с точки зрения цитологии. В СССР исследования взаимодействия этого гриба с рядом сортов пшеницы проведены под руководством Б.Г. Рейтера и М.П. Лесового в 70-х гг. Позже за рубежом были проведены гистологические исследования действия некоторых генов возрастной устойчивости (Rubiales, Niks, 1996; Martinez et al., 2001). В то же время остаются неизученными вопросы устойчивости к P. triticina видов-нехозяев, цитологические аспекты сопряженной эволюции ржавчинного гриба с растениями, действие эффективных генов устойчивости. В последние десятилетия были сделаны фундаментальные открытия в области фитоиммунологии, касающиеся роли активных форм кислорода, защитных PR-белков, системной приобретенной устойчивости в защите растений. Влияние этих механизмов на цитологические взаимоотношения ржавчинных грибов с растениями практически не изучено.В связи с этим цитофизиологические исследования взаимодействия P. triticina с видами-нехозяевами и устойчивыми линиями пшеницы высоко актуальны. Они вносят вклад в развитие теории иммунитета растений, а также имеют большое значение для защиты культурных растений.

Диссертационная работа выполнялась в ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» (ОмГАУ, г. Омск) с 2003 по 2008 г. в рамках темы «Изучение цитофизиологических механизмов длительной и индуцированной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине» (№ гос. регистрации 0120.0 509874).

Цель и задачи исследований. Целью работы было выявление фундаментальных основ видового иммунитета растений к Puccinia triticina Erikss. и цитофизиологических аспектов сопряженной эволюции гриба с видами семейства Poaceae Barnh.

В соответствии с поставленной целью были определены задачи:

– изучить цитологическую основу взаимодействия P. triticina c растениями видов-нехозяев, принадлежащих к классам Двудольные и Однодольные;

– выявить комплекс пассивных и активных механизмов, определяющих устойчивость к P. triticina видов семейства Мятликовые Poaceae: Zea mays L., Panicum miliaceum L., Avena sativa L., Secale cereale L., Agropyron elongatum (Host) Beauv.;

– на примере пшенично-пырейных гибридов выявить комплекс цитологических механизмов видового иммунитета A. elongatum к бурой ржавчине;

– изучить гистологические и ультраструктурные особенности взаимодействия P. triticina c почти изогенными линиями сорта Тэтчер и иммунными аналогами сорта Новосибирская 67;

– исследовать цитофизиологические аспекты сопряженной эволюции

P. triticina с T. aestivum при преодолении генов устойчивости Lr19, Lr23, Lr24;

– выявить цитофизиологическую основу возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине;

– исследовать цитофизиологические аспекты влияния системной приобретенной устойчивости на развитие бурой ржавчины пшеницы;

– внедрить результаты исследований в процесс обучения студентов, а также в программу селекции сортов пшеницы.

В диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором и под его руководством.

– комплекс цитофизиологических механизмов, обеспечивающих устойчивость видов-нехозяев к P. triticina;

– экспрессия механизмов устойчивости видов-нехозяев в интрогрессивных линиях пшеницы;

– система защитных механизмов, определяемых идентифицированными и перспективными генами устойчивости;

– цитофизиологическая основа возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине;

– цитофизиологическая основа коэволюции ржавчинного гриба с растениями пшеницы с интрогрессированными генами устойчивости;

– дифференциальное проявление системной приобретенной устойчивости в разных по совместимости с P. triticina и в различных по генотипу растениях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает введение, 7 глав, выводы и приложения. Работа изложена на 360 страницах текста, содержит 16 таблиц, 36 рисунков, иллюстрирована 187 микрофотографиями, полученными с помощью световой, люминесцентной и электронной микроскопии. Список литературы состоит из 475 наименований.
Основное Содержание работы

1. Организация работы, объекты и методы исследований

Взаимодействие P. triticina с растениями-нехозяевами и мягкой пшеницей изучали на различных генетических моделях с применением комплекса методов исследований. Общая структура исследований, взаимосвязь разделов работы, объекты и методы исследования, логическая схема получения теоретических и практических результатов приведены на схеме (рис. 1).

Для изучения механизмов устойчивости видов-нехозяев были использованы листья растений видов класса Двудольные и Однодольные: бегонии клубневой Begonia tuberhybrida L., сингониума ножколистного Syngonium podophyllum Schott., розы Rosa floribunda L., хлорофитума хохлатого Chlorophytum comosum (Thunb.) Jacques, лука посевного Allium cepa L., пырея удлиненного Agropyron elongatum (Host) Beuv., кукурузы Zea mays L. (гибрид Вера), проса посевного Panicum miliaceum L. (сорт Омское), овса посевного Avena sativa L. (сорт Тарский 2), ржи посевной Secale cereale L. (сорта Ирина, Сибирская 82, Юбилейная 25, Сибирь, Сибирь 3). Факторы устойчивости пырея удлиненного Agropyron elongatum изучали на примере многолетних и однолетних пшенично-пырейных гибридов (ППГ), полученных путем насыщающих скрещиваний с восприимчивыми сортами мягкой пшеницы, чередующихся с самоопылением.

Устойчивость мягкой пшеницы T. aestivum. к бурой ржавчине изучали на почти изогенных линиях сорта Тэтчер (линии TcLr) с генами устойчивости Lr1–Lr3 (a, bg, ka), Lr9–Lr38 и сорта Новосибирская 67 (линии АНК). В качестве контроля в полевых и лабораторных исследованиях использовали восприимчивые сорта мягкой пшеницы Саратовская 29, Новосибирская 67 и Чернява 13.

Наблюдения в полевых условиях (в 2003–2007 гг.) позволили оценить устойчивость сортов и линий мягкой пшеницы к западносибирской популяции

P. triticina в лесостепной зоне Западной Сибири (г. Омск). В 2005 и 2007 гг. развивались интенсивные эпифитотии, в 2002, 2004, 2006 гг. наблюдалось умеренное поражение растений, в 2008 г. болезнь не развивалась. В экспериментах

Рис. 1. Схема исследований и логические связи между разделами диссертации. Обозначения: АФК – активные формы кислорода; СК и ЯК – салициловая и янтарная кислоты; SAR – системная приобретенная устойчивость

оценивали тип реакции растений по 5-балльной шкале («0» – иммунитет, «4» –­ восприимчивость) (Mains, Jackson, 1926) и степень поражения растений (%) (Peterson, 1948). Степень поражения линий с генами возрастной устойчивости в полевых условиях оценивали в динамике с момента проявления ржавчины до созревания растений. Объекты для цитофизиологических исследований устойчивости были определены на основании оценки в полевых условиях.

Для лабораторных исследований использовали моноспоровый инокулюм изолятов, при заражении которыми растения проявляли реакции, сходные с на- блюдавшимися в полевых условиях. При изучении цитофизиологической основы коэволюции P. triticina с пшеницей использованы наборы авирулентных и вирулентных изолятов к линиям ТсLr19, ТсLr23 и ТсLr24. Для изучения действия генов устойчивости использовали листья 8–10-суточных проростков либо флаговые листья растений в фазе колошения (линии с возрастной устойчивостью). Основную часть экспериментов в лабораторных условиях проводили по методике отсеченных листьев (Михайлова, Квитко, 1970).

Генерацию растениями супероксид-аниона О₂^– выявляли путем окрашивания листьев нитросиним тетразолием (Heath, 1998). Функционирование митохондрий в клетках гриба определяли с помощью красителя родамина В (Барыкина, 2004). Гистологические исследования развития гриба на поверхности и в тканях, а также проявления реакции сверхчувствительности (СВЧ) проводили на целых листьях, окрашенных анилиновым синим в лактофеноле (А.с., Плотникова Л.Я., 1990). Для выявления комплекса защитных реакций гистологические и цитохимические исследования проводили на фиксированных целых листьях по разработанной для этой цели технологии (РИП, Плотникова Л.Я., 2008). Белки в инфекционных структурах гриба определяли с помощью красителя проционового синего (Ivanov, 1987). ДНК и РНК в клетках гриба выявляли окрашиванием 0,01% акридиновым оранжевым (Зеленин, 1967). Каллозу (β-1,3-глюкан) на стенках клеток определяли окрашиванием кораллином (Барыкина и др., 2004). Комплекс фенольных веществ в цитоплазме и в составе лигнина выявляли окрашиванием сернокислым анилином (Джапаридзе, 1953), а также по их автофлуоресценции (Rubiales, Niks, 1995). Транскоричный альдегид в составе фенолов определяли окраской флороглюцином (Beardmore et al., 1983), сирингин – хлор-сульфитным методом (Ride, 1975). Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали глутаровым альдегидом и ОsO₄, для окраски срезов применяли двойное окрашивание по общепринятым методикам (Уикли, 1975; Raynolds, 1963).

Окислительный взрыв подавляли путем обработки листьев 0,01% водным раствором верапамила, блокирующим поступление в клетку ионов Са²⁺ необходимых для генерации О₂^- (Xu, Heath,1998). Биосинтез белка ингибировали обработкой листьев раствором циклогексимида (2,5 мг/мл) (Heath, 1979). Системную приобретенную устойчивость (systemic acquired resistance – SAR) пшеницы в лабораторных условиях индуцировали опрыскиванием листьев 0,01% водными растворами салициловой (СК) и янтарной кислоты (ЯК), а также 0,00015% Биона (бензотиадиазол CGA245704) (Gorlach et al., 1996; Тютерев, 2002). Влияние SAR на развитие бурой ржавчины в линиях TcLr19 и TcLr24 изучали на проростках, а в линиях с генами возрастной устойчивости – в фазе «выход в трубку». В полевых экспериментах SAR индуцировали 2-кратной обработкой растений начиная с фазы колошения по методике, рекомендованной для посевов пшеницы (Список пестицидов, 2002; Gorlach et al.,1996).

Гистологические и цитохимические исследования проводили на световом микроскопе МБИ-15. Автофлуоресценцию фенольных веществ, люминесценцию нуклеиновых кислот и митохондрий изучали с помощью люминесцентного микроскопа Люмам-5. Микрофотосъемку проводили на пленку «Микрат-300» или с помощью цифровой фотокамеры марки Olympus SP-320. Ультратонкие срезы изучали на трансмиссионном микроскопе МБИ-100.

Для выявления цитологической основы устойчивости к P. triticina видов-нехозяев в экспериментах были использованы растения классов Двудольные и Однодольные. Гистологические исследования показали, что на листьях восприимчивого сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 (контроль) споры активно прорастали. Ростковые трубки направлялись к устьицам, большая их часть (90%) формировала на устьицах аппрессории, обеспечивающие проникновение в устьица. Затем формировались подустьичные везикулы, инфекционные гифы, материнские клетки гаусториев (МКГ) и гаустории в мезофилльных клетках листа. Мицелий гриба активно развивался, через 8–10 сут после инокуляции появлялись пустулы с новой генерацией спор. На листьях растений класса Двудольные сингониума ножколистного Syngonium podophyllum и бегонии клубневой Begonia tuberhybrida прорастание спор было существенно подавлено, адгезия ростковых трубок к поверхности нарушена. На листьях розы Rosa floribunda ростковые трубки были аномально длинными и тонкими. На поверхности всех видов класса Двудольные ростковые трубки располагались хаотично, аппрессории не образовывались. Сходные результаты наблюдались при взаимодействии P. triticina с другими видами класса Двудольные (горох посевной, томаты, петрушка) (Плотникова Л.Я., Кнаус, 2007). На листьях растений видов класса Однодольные прорастание спор и прикрепление ростковых трубок к поверхности листьев не отличалось от контроля. Однако на хлорофитуме Chlorophytum comosum (сем. Agavaceae) ростковые трубки гриба ориентировались произвольно. На листьях лука и Allium cepa (сем. Liliaceae) ростковые трубки направлялись поперек проводящих пучков, образовывали лишь единичные аппрессории аномальной формы; проникновения в устьица не отмечено.

На листьях филогенетически далеких от T. aestivum видов семейства Poaceae проса Panicum miliaceum и кукурузы Zea mays была нарушена ориентация ростковых трубок в направлении устьиц. На листьях иммунных видов злаков ростковые трубки образовывали мало аппрессориев (рис. 2). На просе и кукурузе аппрессории не прикреплялись к замыкающим клеткам устьиц, имели аномальную лопастную форму с вакуолизированной цитоплазмой, синтез белков в них был подавлен, большая часть погибала на устьицах. Аппрессории на устьицах овса имели малые размеры, в части из них нарушалось митотическое деление ядер. С помощью люминесцентной микроскопии установлено, что ядрышки в ядрах аппрессориев и подустьичных везикул имели малые размеры, в цитоплазме клеток присутствовало низкое количество РНК в сравнении с контролем. Это свидетельствует о нарушении морфогенеза инфекционных структур гриба на листьях иммунных видов злаков. Сходные закономерности были выявлены при взаимодействии возбудителя корончатой ржавчины овса P. coronata с кукурузой и пшеницей (Плотникова Л.Я., 2008). Очевидно, нарушение развития поверхностных инфекционных структур характерно для взаимодействия грибов рода Puccinia с видами-нехозяевами.

Рис. 2. Развитие P. triticina на листьях иммунных ви-дов злаков: 1 – ростковые трубки, образовавшие ап-прессории; 2 – аппрессо-рии, погибшие на устьи-цах; К – мягкая пшеница

и активных механизмов растений. Для понимания причины несовместимости ключевое значение имеет определение момента узнавания гриба нехозяевами. В настоящее время известно, что первой реакцией растений при узнавании патогенов (или элиситоров) является образование активных форм кислорода (О₂^-, Н₂О₂, ОН^-), что приводит к окислительному взрыву в месте инфекции. Нами впервые выявлена интенсивная экстраклеточная генерация супероксид-аниона О₂^- замыкающими клетками устьиц вида-нехозяина A. sativa при контакте с аппрессориями P. triticina. О₂^- накапливался в цитоплазме аппрессориев или подустьичных везикул – в результате инфекционные структуры отмирали.

Роль окислительного взрыва в устойчивости видов-нехозяев была также изучена на растениях, обработанных верапамилом. Обработка растений не вли-яла на формирование поверхностных инфекционных структур гриба. На листьях кукурузы наблюдалось слабое усиление проникновения P. triticina в устьица, образования инфекционных гиф и МКГ, но гаустории в клетках не образовывались, реакция СВЧ не проявлялась (рис. 3). В листьях растений овса развитие P. triticina усиливалось, формировались инфекционные гифы, МКГ и гаустории, внедрение которых приводило к отмиранию клеток. Роль синтеза белков в устойчивости видов была изучена на примере растений, обработанных ингибитором биосинтеза циклогексимидом. Подавление биосинтеза белков в листьях кукурузы и овса достоверно не влияло на развитие патогена. Особенности взаимоотношений с видами разных таксонов представлены на схеме (рис. 4).

Рожь посевная Secale cereale устойчива к P. triticina, ее генофонд используется для защиты мягкой пшеницы от бурой ржавчины. Исследования устойчивости ржи проводили на проростках пяти сортов селекции СибНИИСХа (г. Омск). Листья заражали инокулюмом моноспорового изолята P. triticina, выделенного из западносибирской популяции и размноженного на мягкой пшенице. Эксперименты показали, что сорт Ирина проявлял иммунитет. Остальные 4 сорта были гетерогенны по устойчивости к P. triticina, большая часть их растений была устойчива (тип реакции «0–2»), но в популяциях выявлены восприимчивые растения (6–13%), на них развивались редкие небольшие пустулы, окруженные зоной хлороза (тип реакции «3»). Цитологические исследования выявили несколько этапов нарушения взаимодействия P. triticina с растениями

1

2

3

Цитохимические исследования не выявили генерации супероксид-аниона в листьях ржи. В тканях большинства растений активные реакции в форме синтеза каллозы и отложений лигнина с зеленой автофлуоресценцией, характерной для проводящих пучков листьев, проявлялись в зоне отмерших колоний либо вокруг пустул в момент спороношения. Поскольку эти защитные реакции проявлялись после подавления развития гриба, то, очевидно, нарушение формирования гаусториев является основным механизмом устойчивости растений ржи.

В настоящее время известно, что развитие инфекционных структур грибов стимулируется морфологическими, физическими и химическими свойствами растений. Химическими индукторами развития поверхностных инфекционных структур служат составляющие кутикулы и воска, а МКГ и гаусториев –

компоненты клеточных стенок растений (Heath, 1997; Gold, 2001 и др.). При получении комплекса адекватных сигналов активируются сигнальные системы и экспрессируется пул генов, необходимый для клеточной дифференциации инфекционных структур и биотрофного взаимодействия с клетками растений. Наши эксперименты показали, что частичное (на видах семейства Poaceae) или полное (на видах других семейств) подавление развития поверхностных инфекционных структур P. triticina происходило до окислительного взрыва на устьицах. На примере взаимодействия гриба с S. cereale продемонстрировано, что морфогенез инфекционных структур, необходимых для биотрофного взаимодействия с клетками, был подавлен до активации защитных реакций. Вероятно, отсутствие полноценного комплекса стимулов для морфогенеза инфекционных структур является основным или существенным пассивным механизмом, определяющим видовой иммунитет к P. triticina. Дополнительную защиту злаков от неспециализированного ржавчинного гриба обеспечивает окислительный взрыв на устьицах растений.

Комплекс механизмов видового иммунитета к P. triticina пырея удлиненного Agropyron elongatum был изучен на примере пшенично-пырейных гибридов (ППГ). Благодаря многолетнему образу жизни растений мы имели возможность одновременно изучить особенности взаимодействия гриба с исходными иммунными растениями пырея и ППГ различных поколений. При развитии P. triticina на растениях A. elongatum наблюдались типичные черты несовместимости с нехозяевами: интенсивное нарушение образования аппрессориев и остановка на стадии аппрессориев или подустьичных везикул. Несмотря на изменение морфологии листьев у гибридов в сторону признаков пшеницы, описанный вариант взаимодействия проявлялся у промежуточного гибрида T. durum х A. elongatum и ППГ, полученных путем скрещивания с восприимчивым сортом мягкой пшеницы. После 2-го насыщающего скрещивания было получено 7 растений ППГ, различающихся по устойчивости (4 иммунных – «0», 1 устойчивое – «1», 2 восприимчивых – «3», «4»). Цитологические исследования показали, что проявлялись разные варианты несовместимости P. triticina с растениями: 1) взаимодействие. аналогичное с A. elongatum; 2) образование маленьких абортивных колоний с недоразвитыми гаусториями, внедрение которых приводило к отмиранию единичных клеток растений; 3) гибель колоний, связанная с нарушением образования МКГ и гаусториев без реакции СВЧ. Взаимодействие гриба с устойчивым растением ППГ (тип реакции «1») сопровождалось реакцией СВЧ и было сходно с проявлениями сортовой устойчивости. В тканях восприимчивых растений ППГ было подавлено образование гаусториев, а размеры колоний и пустул гриба были существенно меньше, чем в восприимчивом сорте мягкой пшеницы. Таким образом, нами впервые экспериментально продемонстрировано на клеточном уровне разделение механизмов видового иммунитета при создании устойчивых линий растений. Установлено, что иммунитет A. elongatum к бурой ржавчине определяется комплексом механизмов. Ряд цитологических механизмов устойчивости сходны у видов злаков, принадлежащих к разным родам (рис. 4).

Двудольные Однодольные

сем. Begoniaceae сем. Agavaceae,

Araceae Liliaceae сем. Poaceae



















Рис. 4. Влияние факторов устойчивости видов-нехозяев на развитие инфекционных структур P. triticina.

Обозначения: – подавление развития инфекционных структур; – реакция СВЧ; – разрушение клеток растения на поздних этапах патогенеза. ап – аппрессорий; АФК – активные формы кислорода; г – гаусторий; мкг – материнская клетка гаустория; пв – подустьичная везикула

Результаты наблюдений в полевых условиях показали, что сорта пшеницы Саратовская 29 и Новосибирская 67, Тэтчер (Lr22b), а также большая часть линий сорта Тэтчер с известными генами устойчивости были восприимчивы к бурой ржавчине (4 балла / 100%). Иммунитет проявили линии ТсLr9, ТсLr28, ТсLr38, АНК-АНК-37С, АНК-39А, АНК-39С, АНК-39D; высокую устойчивость – линии ТсLr19, ТсLr24, АНК-39В, АНК-39Е (1–2 балла / 5–10%); слабую или умеренную степень поражения – линии ТсLr23, ТсLr25, ТсLr26, ТсLr36. На линиях пшеницы с генами возрастной устойчивости наблюдалось медленное развитие болезни (slow rusting), при этом поражение ТсLr12, ТсLr13, ТсLr22a, ТсLr35 и ТсLr37 в годы эпифитотий не превышало 20–40%, а линия ТсLr34 умеренно поражалась (40–60%).

Большая часть устойчивых линий несла интрогрессированные гены видов: Agropyron elongatum (Host) Beuv. (TcLr19, TcLr24), A. intermedium (Host) Beuv. (TcLr38), Aegilops umbellulata Zhuk. (TcLr9), A. speltoides Tausch. (ТсLr28, ТсLr35, ТсLr36, АНК-39A, АНК-39D, АНК-39E), A. tauschii Coss. (ТсLr22a), A. ventricosa Tausch. (ТсLr37), Secale сereale L. (ТсLr25, ТсLr26), Triticum timopheevii Zhuk. (ТсLr18, АНК 37В, АНК 37С), T. turgidum L. (ТсLr23) (McIntosh, 1998; Коваль, 2001). Исключение составляют гены Lr12, Lr13, Lr34, выявленные в сортах пшеницы в начале XX в., происхождение которых не представляется возможным проследить.

При исследовании цитологических аспектов устойчивости пшеницы к ржавчине внимание было сосредоточено на линиях, несущих эффективные в различных регионах мира и перспективные для селекции гены. Изучение развития гриба на линиях с генами, проявляющихся на стадиях проростков, показало, что механизмы несовместимости проявлялись на нескольких этапах патогенеза. В результате наблюдалось несколько типичных вариантов взаимодействия (рис. 5). На листьях большинства линий (за исключением TcLr23 и АНК-39Е) было существенно (в 1,3–1,7 раза) подавлено формирование аппрессориев. На листьях линий Lr9, Lr28, Lr36, Lr38, АНК-37С развитие гриба прекращалось на стадиях ростковых трубок – подустьичных везикул. В листьях линии TcLr19 и АНК-39D гриб останавливался в развитии после образования недоразвитого гаустория, что приводило к гибели клетки в результате СВЧ. Такие особенности развития считаются характерными для взаимодействия ржавчинных грибов с растениями-нехозяевами. В тканях линий TcLr24, TcLr26, АНК-37В, АНК-39Е было подавлено образование инфекционных гиф, а внедрение гаусториев в клетки растений сопровождалось реакцией СВЧ различной интенсивности. В листьях линии ТсLr23 мицелий активно ветвился, но образование МКГ и гаусториев было подавлено, в результате значительная часть колоний отмирала на ранних этапах развития, другие развивались слабо. Взаимодействие не сопровождалось реакцией СВЧ.

Линии с генами возрастной устойчивости проявляли частичную устойчивость, т.е. растения были восприимчивы, но на листьях развивалось мало пустул. Цитологические исследования показали, что на этих линиях 45–70% инокулюма погибало на поверхности, либо на этапе внедрения в устьица (рис. 6, а). Паразит образовывал колонии лишь в части инфекционных мест, формирование инфекционных структур в них было подавлено, что приводило к гибели части колоний на разных стадиях развития. В результате на растениях каждой линии наблюдались различные варианты взаимодействия (рис. 5). На всех линиях развивались колонии малого размера (в 3–9 раз меньше, чем на сорте Саратовская 29), спорогенез был подавлен (рис. 6, б). Существенных отличий в латентном периоде от контроля не отмечено. Характерной особенностью взаимодействия было отсутствие типичной реакции СВЧ. Лишь в растениях линии TcLr13 единичные клетки отмирали на ранних стадиях патогенеза. В остальных линиях медленное разрушение клеток растения отмечено в зоне отмерших колоний паразита, либо в зоне пустул.

А Б

Влияние на инфекционные Результат Влияние на инфекционные Результат

структуры взаимодействия структуры взаимодействия


TcLr9, TcLr28, TcLr36, TcLr38, АНК-37С

TcLr24, TcLr26, АНК-37В, АНК-39Е

Традиционно действие отдельных генов в генотипе культурных растений трактуется как проявление расоспецифической устойчивости хозяев. Однако в случае интрогрессивных линий мы имеем дело с проявлением генетического материала других видов в геноме культурных растений. Полученные нами результаты показывают, что интрогрессивные гены определяли эффекты, сходные с видовым иммунитетом, или воспроизводили отдельные механизмы устойчивости (рис. 4, 5). Нами были установлены различия между проявлениями генов, происходящих из одних источников: Lr19 и Lr24 от A. elongatum; генов T. timopheevii в сестринских линиях АНК-37C и АНК-37В; генов A. speltoides в линиях ТсLr28, ТсLr35, ТсLr36 и сестринских линиях АНК-39D и АНК-39E. Вероятно, эти результаты иллюстрируют разделение механизмов устойчивости нехозяев при интрогрессии материала в геном пшеницы. Часть генов (Lr9, Lr13, Lr19, Lr23, Lr24, Lr34) доказали свою длительную эффективность против бурой ржавчины пшеницы при интенсивном использовании в коммерческих сортах в различных регионах мира. Вероятно, они оказывают неспецифический эффект на разных этапах взаимодействия P. triticina с растениями.

Роль окислительного взрыва в защите пшеницы от бурой ржавчины была изучена на примере интрогрессивных линий, а также TcLr1 с геном расоспецифической устойчивости от T. aestivum. Впервые установлено, что замыкающие клетки устьиц линий ТсLr9, ТсLr38 и АНК-37С, аналогично видам-нехозяевам, экстраклеточно генерировали супероксид-анион, который накапливался в цитоплазме аппрессориев и подустьичных везикул. С помощью люминесцентной микроскопии продемонстрировано, что окислительный взрыв приводил к нарушению функции митохондрий и быстрому отмиранию клеток гриба. Реакции растений были аналогичны наблюдавшимся при взаимодействии P. triticina с видами-нехозяевами. В то же время в линии TcLr1 умеренная генерация О₂^-

Рис. 6. Особенности взаимодействия P. triticina с линиями с генами возрастной устойчивости: а – соотношение инокулюма, остановившегося на разных стадиях развития. I – ростковые трубки без аппрессориев или с аппрессориями на эпидермальных клетках; II – аппрессории на устьицах и подустьичные везикулы; III – колонии, прекратившие развитие; б – интенсивность спорогенеза. К – контроль Саратовская 29, 1 –Тэтчер Lr22b; 2 – TcLr12; 3 – TcLr13;

4 – TcLr22a; 5 – TcLr34; 6 – TcLr35; 7 – TcLr37
наблюдалась значительно позже в коллапсированных после внедрения гаусториев мезофилльных клетках.

Роль окислительного взрыва в защите пшеницы была подтверждена экспериментами на растениях, обработанных верапамилом. В иммунных растениях линий ТсLr9, TcLr38, АНК-37С усиливалось проникновение в устьица, формирование инфекционных гиф и образование единичных недоразвитых гаусториев, но дальнейшего развития гриба не происходило. В то же время наблюдалось существенное усиление развития колоний в растениях линии TcLr1, умеренное – в тканях линий АНК-39D и АНК-39E. Усиление развития мицелия свидетельствует о том, что основным фактором подавления роста был окислительный взрыв и следующая за ним индукция защитных механизмов.

Цитофизиологическая основа сопряженной эволюции P. triticina с пшеницей была исследована на примере линий с генами Lr19, Lr23, Lr24. Растения раздельно заражали наборами авирулентных (тип реакции «0–2») и вирулентных («3», «4») изолятов, которые в результате микроэволюции в агроценозах в различной степени приобрели патогенные свойства. На примере взаимоотношений P. triticina с линией ТсLr19 показано, что изоляты с типом реакции «0» взаимодействовали с иммунными растениями как с растениями-нехозяевами: образовывали мало аппрессориев, прекращали развитие после образования карликовых гаусториев. Электронно-микроскопические исследования выявили существенные нарушения структуры клеток гриба до проникновения в клетки растения: в ядрах наблюдались крупные агрегаты хроматина, ядрышки были слабо развиты, митохондрии разрушены, метаболизм запасных липидов нарушен. Внедрение гаусториев не стимулировало реорганизацию цитоплазмы и таксис ядер растений. Цитоплазма гаусториев разрушалась до проявления реакции СВЧ. На примере изолятов с типом реакции «1» и «2» установлено, что в процессе микроэволюции у гриба появлялись свойства, способствующие усилению формирования аппрессориев, нормальному развитию гаусториев в клетках. Одновременно снижалась интенсивность реакции СВЧ. Однако даже вирулентные изоляты формировали меньшее число гаусториев, необходимых для биотрофного питания, в клетках линии TcLr19 в сравнении с восприимчивым сортом Тэтчер. По мере адаптации изолятов к растениям линии TcLr19 изменялись комплекс и интенсивность защитных реакций. В иммунных растениях окислительный взрыв на устьицах и при внедрении гаусториев в клетки был основным механизмом защиты. При взаимодействии более адаптированных изолятов (тип реакции «1», «2») с растениями сначала снижалась интенсивность окислительного взрыва на устьицах, затем в мезофилльных клетках. Наиболее интенсивное проявление защитных реакций (синтеза каллозы, реакции СВЧ, накопления фенольных веществ в цитоплазме и апопласте, лигнификации) наблюдалось в комбинации с типом реакции «1». Синтез защитного полисахарида каллозы считают самостоятельным защитным механизмом, приводящим к подавлению развития ржавчинных грибов в иммунных растениях (Heath, 1996; Silva, 2002). Наши исследования впервые показали, что синтез каллозы тесно связан с экстра- и интраклеточной генерацией супероксид-аниона, но проявляется после окислительного взрыва. Поэтому синтез каллозы может быть цитологическим маркером окислительных процессов в тканях.

Синтез фенольных веществ в клетках растений изучали с помощью набора цитохимических методов и исследованием автофлуоресценции. Локализация фенолов, выявленная с помощью разных методов, совпадала. Флороглюциновая реакция показала накопление транскоричного альдегида в зоне колоний только в момент спороношения. Хлор-сульфитная реакция выявила более ранее накопление производных сирингина, кореллирующее с устойчивостью растений. Наблюдение автофлуоресценции позволило выявить накопление фенольных веществ в цитоплазме замыкающих клеток устьиц и мезофилльных клеток на ранних этапах взаимодействия (через 1–2 сут после инокуляции), а также наблюдать фенолы с разными спектральными характеристиками. Вероятно, ранняя автофлуоресценция фенолов в цитоплазме связана с накоплением салициловой кислоты (СК), выполняющей роль посредника в сигнальной трансдукции. Через 3–5 сут после инокуляции на клеточных стенках выявлены отложения лигнина. Интенсивная лигнификация стенок клеток растений, погибших в результате реакции СВЧ, наблюдалась только в комбинации с типом реакции «1». Лигнин имел желтую автофлуоресценцию, характерную для эфиров феруловой кислоты. Сходные отложения выявлены при взаимодействии других авирулентных ржавчинных грибов со злаками, сопровождавшемся реакцией СВЧ. При взаимодействии растений с более приспособленным изолятом («2») интенсивность всех реакций снижалась, на поздних этапах патогенеза гриб был способен их подавлять. В совместимых комбинациях умеренное накопление растворимых фенолов в цитоплазме и каллозы на клеточных стенках наблюдалось преимущественно под пустулами на поздних этапах патогенеза.

Авирулентные изоляты образовывали на листьях линии ТсLr24 больше аппрессориев, чем на линии ТсLr19, размеры гаусториев были нормальными. Развитие наименее адаптированного изолята прекращалось после внедрения в единичные клетки растения, отмиравшие в результате реакции СВЧ. По мере преодоления устойчивости усилилось образование аппрессориев и инфекционных структур внутри листа. Однако даже у вирулентного изолята (тип реакции «4») образование МКГ и гаустории в мицелии было снижено по сравнению сортом Тэтчер. Окислительный взрыв на устьицах линии TcLr24 был менее интенсивным, чем на линии TcLr19, но супероксид-анион накапливался в высоких концентрациях в разрушенных мезофилльных клетках. По мере повышения совместимости изолятов уменьшались интенсивность окислительного взрыва в тканях, каллозных отложений на клеточных стенках, реакции СВЧ и лигнификация. Для взаимодействия растений линии TcLr24 с авирулентными изолятами было характерно образование умеренных лигниновых отложений с желтой автофлуоресценцией. С помощью люминесцентной микроскопии в тканях линии ТсLr24 впервые выявлен механизм устойчивости, приводящий к разрушению гаусториев и межклеточных гиф, при этом структуры приобретали интенсивную желтую автофлуоресценцию, характерную для некротических клеток с окисленными фенолами (Carver, 1996). В комбинации с типом реакции «1» это явление наблюдалось через 5 сут после инокуляции, при взаимодействии с более адаптированным изолятом – в момент спороношения. Комплекс механизмов, проявляющихся в линии TcLr24, представлен на рис. 7.

Исследования показали различия взаимодействия P. triticina с линией ТсLr23 по сравнению с ТсLr19 и TcLr24. Не выявлено отклонений в развитии поверхностных структур авирулентных изолятов и проникновении в устьица, мицелий активно ветвился. Характерным признаком нарушения взаимодействия как авирулентных, так и вирулентных изолятов с растениями был слабый морфогенез МКГ, их образовывали менее 20% инфекционных гиф (в тканях сорта Тэтчер – 75%). Сходное взаимодействие наблюдалось с иммунных растениями ржи. Внедрение гаусториев не вызывало реакции СВЧ. В растениях с типом реакции «1» более 80% колоний погибали, вероятно, в результате голодания. По мере адаптации изолятов к растениям усиливалось ветвление мицелия, но интенсивность образования МКГ оставалась низкой. Лишь у наиболее адаптированного изолята (тип реакции «4») гифы формировали достаточное количество МКГ (52%), при этом образование спор резко усиливалось. При инфицировании всеми изолятами наблюдалось отмирание части колоний на разных стадиях развития, что свидетельствует о нестабильном взаимодействии гриба с растениями. Во всех комбинациях с линией ТсLr23 слабые реакции в форме синтеза каллозы и растворимых фенолов появлялись в зоне отмирающих колоний либо на поздних этапах взаимодействия. Инфекционные структуры гриба разрушались и приобретали желтую автофлуоресценцию. При усилении совместимости изолятов с растениями разрушение инфекционных структур уменьшалось и происходило на более поздних стадиях патогенеза. Поскольку разрушение инфекционных структур проявлялось как в растениях с интенсивным окислительным взрывом и проявлением реакции СВЧ (ТсLr24), так и без них (линия TcLr23), мы предполагаем активацию дополнительного общего механизма защиты. Вероятным механизмом может быть синтез PR-белков, разрушающих оболочки и содержимое клеток грибов.

Таким образом, на примере преодоления трех генов устойчивости установлено, что в ходе сопряженной эволюции у изолятов P. triticina постепенно усиливался морфогенез экто- и эндофитных инфекционных структур. Мы предполагаем, что в процессе микроэволюции изоляты адаптируются к химическим особенностям тканей растений с интрогрессированными генами и начинают воспринимать их в качестве стимулов для морфогенеза структур. При этом даже у вирулентных изолятов способность к формированию структур для биотрофного взаимодействия с тканями линий была снижена по сравнению с восприимчивым сортом Тэтчер, что может быть основой остаточного эффекта генов Lr19, Lr23, Lr24. При преодолении устойчивости генов Lr19 и Lr24 постепенно снижалась интенсивность комплекса защитных реакций. Вероятно, это связано с утратой элиситоров, индуцирующих развитие защитные реакции. В растениях линии TcLr23 защитные реакции индуцировались продуктами клеток отмирающего в результате голодания мицелия. По мере улучшения взаимодействия гриба с растениями линии TcLr23 снижалась доля отмирающих колоний и интенсивность защитных реакций.

Пристальное внимание исследователей направлено на гены возрастной устойчивости, поскольку сорта, созданные на их основе в центре CIMMYT, доказали длительную устойчивость (Singh, 2003). Проведенные нами исследования впервые выявили общие закономерности взаимодействия P. triticina с линиями ТсLr12, ТсLr13, ТсLr22a, ТсLr34, ТсLr35, ТсLr37. Установлено, что на устьицах происходил нестабильный окислительный взрыв, что приводило к частичному ингибированию развития инокулюма (рис. 7). В части инфекционных мест (29-60%) гриб был способен проникать в ткани и формировать колонии различного размера с небольшим числом гаусториев. Типичной реакции СВЧ не наблюдалось, но в зоне отмирающих колоний и вокруг пустул происходило медленное разрушение клеток растений. Через 3–5 сут после инокуляции в зоне колоний наблюдался синтез каллозы – маркера окислительных процессов. В этих же локусах выявлен лигнин, обогащенный сирингином, с зеленой автофлуоресценцией, отличающийся по спектру свечения от лигнина в тканях линий TcLr19 и TcLr24. Подавление развития колоний коррелировало с интенсивностью синтеза каллозы и лигнина в их зоне. В то же время лигниновые отложения не создавали барьера на пути распространения мицелия. Поэтому, вероятно, фунгицидное действие проявляли предшественники лигнина.

Мы полагаем, что стабильная защита линий с генами возрастной устойчивости обеспечивается двумя механизмами: 1) пассивными механизмами, слабо стимулирующими морфогенез, что приводит к отмиранию значительной части инокулюма на поверхности и в тканях растений; 2) индуцированной устойчивостью, развивающейся в тканях вследствие окислительного взрыва на части устьиц, впоследствии она усиливается при выделения элиситоров из отмирающих клеток гриба. В сумме эти механизмы обеспечивают плейотропное действие генов возрастной устойчивости на развитие бурой ржавчины: снижение степени поражения, уменьшение размеров пустул и редукцию спорогенеза.

В целом, полученные результаты показывают, что эффективные гены устойчивости экспрессируются в разных тканях и определяют систему защитных

механизмов на разных этапах патогенеза (рис. 7). В значительной части линий эффективная устойчивость реализуется без реакции СВЧ.
6. Влияние системной приобретенной устойчивости (SAR)

на развитие бурой ржавчины пшеницы

Цитологические аспекты влияния SAR на развитие ржавчинных болезней не изучены. SAR стимулировали индукторами с известными механизмами действия. Салициловая (СК) и янтарная кислоты (ЯК) в использованных концентрациях индуцируют окислительный взрыв, Бион – синтез PR-белков.

В тканях линий ТсLr19 и ТсLr24 SAR приводила к подавлению авирулентных изолятов на ранних этапах развития. При этом СК в большей степени усиливала реакции растений линии TcLr24: реакцию СВЧ, синтез каллозы, лигнификацию, разрушение инфекционных структур гриба. ЯК повышала устойчивость линии ТсLr19, при этом интенсивность реакции СВЧ не усиливалась, но наблюдался синтез каллозы и растворимых фенолов в больших зонах листа. По нашему мнению, в тканях линии TcLr24 усиливалась интраклеточная, а в линии TcLr19 – экстраклеточная генерация активных форм кислорода. Бион ускорял реакцию СВЧ и появление лигнина с зеленой автофлуоресценцией. SAR повышала устойчивость растений к вирулентным изолятам, при этом рост колоний и спорогенез существенно подавлялись. Характерными реакциями были слабый синтез


Время

Механизмы

устойчивости
12 ч

Окислительный взрыв I

TcLr19, TcLr24,

АНК-39D

2–5 сут



5–10 сут

Окислительный взрыв III

Синтез каллозы, фенолов,

PR-белков,

реакция СВЧ.

лигнификация

TcLr24

TcLr23

TcLr12, TcLr13, TcLr22a, TcLr34, TcLr35, TcLr37

Рис. 7. Схема взаимоотношений P. triticina с устойчивыми линиями пшеницы и проявлений защитных механизмов в патогенезе.

Обозначения: АФК – активные формы кислорода; СК – салициловая кислота; я – ядро; PR –PR-белки; – реакция СВЧ; – разрушение клеток на поздних этапах патогенеза; – каллоза; – лигнин с желтой автофлуоресценцией; – лигнин с зеленой автофлуоресценцией

каллозы и лигнина с зеленой автофлуоресценцией. После обработки растений линии ТсLr24 Бионом происходило разрушение инфекционных структур вирулентного изолята, аналогичное наблюдавшемуся в контрольных устойчивых растениях.

Влияние SAR на возрастную устойчивость изучали в полевых и лабораторных условиях. Эффект зависел от генотипа растений и индуктора. Бион приводил к более сильному подавлению ржавчины, чем ЯК, развитие болезни сильнее подавлялось на линии ТсLr34. Цитофизиологические исследования показали, что SAR мало влияла на проникновение в ткани, но подавляла развитие колоний гриба. Наблюдалось усиление реакции СВЧ, синтеза каллозы и лигнина с зеленой автофлуоресценцией. Обработка Бионом стимулировала разрушение инфекционных структур P. triticina в тканях линии TcLr37.

Исследования SAR, стимулированной индукторами с известным механизмом действия, подтвердили ряд выдвинутых предположений: о взаимосвязи синтеза каллозы с окислительным взрывом, об участии PR-белков в разрушении инфекционных структур гриба; о взаимосвязи накопления лигнина с зеленой автофлуоресценцией с развитием индуцированной устойчивости.
заключение

Проведенные исследования выявили характерные цитофизиологические особенности взаимодействия P. triticina с видами-нехозяевами. На примере семейства Poaceae продемонстрирован комплекс механизмов, определяющий видовой иммунитет. На наборе интрогрессивных линий пшеницы доказано, что механизмы устойчивости видов-нехозяев экспрессируются в разных тканях и на разных этапах патогенеза. Полученная нами информация расширяет представления о фундаментальных основах иммунитета растений, а также может быть использована для создания растений с различными механизмами устойчивости.

Результаты исследований позволили сделать выводы об основах видового иммунитета растений к Puccinia triticina Erikss.:

1. В процессе сопряженной эволюции вид Puccinia triticina приобрел способность воспринимать свойства растений семейства Poaceae Barnh. в качестве стимулов для развития инфекционных структур на поверхности и в тканях листа. Иммунитет к P. triticina видов других семейств определяется отсутствием адекватных стимулов для развития инфекционных структур гриба.

2. Впервые продемонстрировано, что устойчивость видов злаков к P. tri-ticina определяется комплексом сходных неспецифических факторов, которые могут комбинироваться в одном генотипе или быть распределены между растениями в популяциях.

3. Впервые экспериментально продемонстрировано, что при интрогрессии генетического материала видов родов Aegilops, Agropyron, Secale, Triticum в геном Triticum aestivum L. гены устойчивости обеспечивают экспрессию набора защитных механизмов видов-нехозяев в эпидермисе и мезофилле листьев линий пшеницы.

4. Впервые проведены системные исследования цитофизиологических механизмов устойчивости к бурой ржавчине, детерминируемых эффективными генами устойчивости изогенных линий сортов Тэтчер и Новосибирская 67. Разработана классификация генов по цитофизиологическим механизмам устойчивости. Выявлены цитологические маркеры механизмов, которые могут быть использованы для создания образцов с различными сочетаниями факторов резистентности к болезни.

5. Впервые продемонстрирован механизм устойчивости в форме окислительного взрыва на устьицах при контакте аппрессориев P. triticina c линиями пшеницы, несущими интрогрессированные гены родов Aegilops, Agropyron и вида T. timopheevii. В тканях линий с генами Lr23, Lr24, Lr37 установлен механизм защиты, приводящий к разрушению инфекционных структур гриба и, вероятно, связанный с накоплением PR-белков.

6. Длительная устойчивость линий пшеницы обеспечивается подавлением образования инфекционных структур гриба на поверхности и тканях растений, а также развитием комплекса защитных реакций: окислительным взрывом на устьицах и в мезофилльных клетках, синтезом фенольных соединений, реакцией сверхчувствительности, индуцированной устойчивостью.

7. Впервые продемонстрировано, что в процессе микроэволюции при преодолении генов устойчивости пшеницы свойства ржавчинного гриба изменяются в двух направлениях: 1) последовательной адаптации к химическим стимулам растений и усиления морфогенеза инфекционных структур; 2) постепенной утраты элиситоров, что приводит к снижению интенсивности комплекса защитных реакций в разных тканях растений.

8. Впервые проведено цитофизиологическое исследование возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине и установлено, что она обеспечивается набором механизмов: подавлением образования инфекционных структур на поверхности и в ткани листьев; окислительным взрывом при контакте части аппрессориев с устьицами; развитием индуцированной устойчивости.

9. Системная приобретенная устойчивость имеет различное влияние на патогенез в несовместимых и совместимых комбинациях. Выявлены дифференцированное взаимодействие индукторов (салициловой, янтарной кислот и Биона) с генотипами растений и активация различных комплексов защитных реакций.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Монографии, учебники

1. Плотникова Л.Я. Иммунитет растений и селекция на устойчивость к болезням и вредителям / Л.Я. Плотникова; под ред. Ю.Т.Дьякова. – М.: КолосС, 2007. – 359 с. – (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

2. Юдкин Л. Ю. Ультраструктура септального аппарата грибов – паразитов растений / Л. Ю. Юдкин, Л. Я. Плотникова // Микология и фитопатология. – 1983. – Т.17. – Вып. 2. – С. 116–121.

3. Рейтер Б. Г. Расоспецифическая устойчивость и эктофитная стадия развития бурой ржавчины пшеницы / Б. Г. Рейтер, Л. Я. Плотникова, Л. Ю. Юдкин // Микология и фитопатология. – 1985. – Т.19. – Вып. 4. – С. 334–337.

4. Плотникова Л. Я. Клеточные механизмы иммунитета к бурой ржавчине видов-нехозяев и устойчивых видов злаков / Л. Я. Плотникова, Ю.К. Кнаус // Микология и фитопатология. – 2007. – Т. 41. – № 5. – С. 461–470.

5. Плотникова Л. Я. Цитофизиологические особенности проявления генов устойчивости к бурой ржавчине, перенесенных в мягкую пшеницу от дикорастущих злаков / Л. Я. Плотникова, Ю.К. Кнаус, Л.В. Мешкова // Микология и фитопатология. – 2007. – Т. 41. – № 4. – С. 362–373.

6. Плотникова Л. Я. Ультраструктурная основа биотрофных взаимоотношений возбудителя бурой ржавчины и мягкой пшеницы / Л. Я. Плотникова // Цитология. – 2007. – Т. 49. – № 10. – C. 881–888.

7. Плотникова Л. Я. Клеточные особенности иммунной реакции пшеницы с геном Lr19 на заражение возбудителем бурой ржавчины / Л. Я. Плотникова // Цитология. – 2008. – Т.50. – № 2. – C. 124–131.

8. Плотникова Л. Я. Влияние поверхностных свойств и физиологических реакций растений-нехозяев на развитие клеточных структур ржавчинных грибов / Л. Я. Плотникова // Цитология. – 2008. – Т.50. – № 5. – C. 439–446.

9. Плотникова Л. Я. Цитологические, молекулярные и генетические основы видового иммунитета растений к грибным патогенам / Л. Я. Плотникова // Микология и фитопатология. – 2008. – Т. 42. – №5. – С. 393–410.

10. Плотникова Л. Я. Влияние салициловой и янтарной кислот на цитофизиологические реакции пшеницы, инфицированной бурой ржавчиной / Л.Я. Плотникова, Т. Ю. Штубей // Цитология. – 2009. – Т. 51. – №1. – С. 41–50.