Эколого-генетические механизмы изменчивости генома хантавирусов и их влияние на микроэволюцию ограниченной по численности вирусной популяции 03. 00. 16 экология
жүктеу/скачать 5.5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Результат анализа консервативности S - сегмента
- (количество нуклеотидов от начала сегмента)
- Добрава/Белград 120-450
- Генотип Координаты консервативных участков М-сегмента (количество нуклеотидов от начала сегмента)
- Пуумала 360 – 660, 1130 – 1320, 1500 – 1880
- 2140-2360, 2500-2800 Добрава/ Белград
|
На правах рукописи ТЮЛЬКО ЖАННА СЕРГЕЕВНА эколого-генетические механизмы изменчивости генома хантавирусов и их влияние на микроэволюцию ограниченной по численности вирусной популяции 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Омск – 2009
Общая характеристика работы Актуальность исследования. Одной из актуальных проблем экологии, в связи с ростом количества заражений хантавирусными инфекциями, является изучение взаимоотношений вирусов с популяциями их хозяев. Хантавирусы относятся к семейству буньявирусов, распространены практически по всему свету, переносятся мышевидными грызунами и способны вызывать у человека опасные заболевания, иногда с летальным исходом: геморрагическую лихорадку с почечным синдромом и хантавирусный пульмонарный синдром. Геном хантавирусов представлен сегментированной РНК отрицательной полярности. Неточность работы РНК-зависимой РНК-полимеразы и отсутствие системы репарации РНК у вирусов приводит к формированию квазивида – множеству генетически не идентичных вирусов одного генотипа, с разной приспособленностью, конкурирующих между собой в процессе микроэволюции в клетках хозяина (Quasispecies structure and persistence of RNA viruses / E.E. Domingo [et al.] // Emerg. Infect. Dis. 1998. Vol. 4. P. 521-527). Иммунная система хозяина, организм которого является средой обитания возбудителя, направляет микроэволюцию вирусов. При изменении среды обитания вирусов - изменении иммунной реакции организма-хозяина или передаче другому хозяину, один квазивид сменяется другим, несколько отличающимся от предыдущего. Таким образом, в группах контактирующих между собой организмов-хозяев, формируются постоянно эволюционирующие и смешивающиеся вирусные популяции, на свойствах которых основана современная классификация вирусов, вводящая для хантавирусов понятие «генотип» аналогичное понятию «вид» у более сложных организмов. Эволюция хантавирусов тесно связана с эволюцией их хозяев-грызунов, что отражается в структуре филогенетических деревьев, построенных по генетическим последовательностям тех и других. Эти деревья имеют звездчатое строение (Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution // J. of General Virology. 1996. Vol. 77. P. 2677-2687), показывающее древнее происхождение хантавирусов, связанное с процессами видообразования у хозяев. Считалось, что генетические расстояния между ветвями этих деревьев у хантавирусов, в пределах одного и того же генотипа, зависят от степени географической удаленности отдельных изолятов. Однако, в последнее время, были обнаружены факты, противоречащие этому мнению, а так же поставлен вопрос об изменении классификационных критериев при выделении вирусных геновариантов (подвидов), в связи с большей изменчивостью нуклеотидных последовательностей в пределах одного и того же генотипа, чем это допускается нормами международного комитета по таксономии вирусов (Plyusnin A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy. Brief Review // Arch. Virol. 2002. Vol. 147. P. 665–682). Большинство таких несоответствий наблюдается при смене вирусом хозяев, что показывает необходимость изучения механизмов изменчивости вирусов, обусловленных особенностями взаимодействия с организмом хозяина. Вирусы гаплоидны и размножаются бесполым путем. При этом типе размножения внутрипопуляционные генетические связи могут отсутствовать. Однако, при наличии способности к рекомбинации, может реализовываться эпизодический внутрипопуляционный генетический обмен, что приводит к образованию новых рекомбинантных клонов. Основным механизмом изменчивости генома хантавирусов считается возникновение точечных замен. Для некоторых хантавирусов, кроме того, предполагается наличие реассортации и обмен фрагментами гомологичных сегментов генома в результате рекомбинации (Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with recombinant S RNA segment / A. Plysnin [et al.] // The EMBO Journal. 2002. Vol. 21. N 6. P. 1479-1503; Sironen T., Vaheri A., Plysnin A. Molecular Evolution of Puumala Hantavirus // J. of virology. 2001. Vol. 75. N 23. P. 11803–11810). К моменту начала исследования, возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов была показана только в пределах S-сегмента для генотипа Тула (Recombination in Tula Hantavirus Evolution: Analysis of Genetic Lineages from Slovakia / C. Sibold [et al.] // J. of Virology. 1999. Vol. 73. N 1. P. 667-675). Поэтому, было целесообразным исследовать распространенность механизма гомологичной рекомбинации и у других хантавирусов. Влияние рекомбинации на внутрипопуляционные процессы может быть разнообразным и приводить к результатам, зависящим от характеристик самой популяции вирусов, от возможности смешанной инфекции, от жизнеспособности мутантных клонов, от действия (или отсутствия) отбора и т.д. Анализ влияния гомологичной рекомбинации на эволюцию вирусов уже проводился (Tajima F. N., Takezaki N. Estimation of Evolutionary Distance for Reconstructing Molecular Phylogenetic Trees // Mol. Biol. Evol. 1994. Vol. 11, N 2. P. 278-286). Однако недостаточная изученность механизмов изменчивости у большинства хантавирусов ограничивала область исследования. Поэтому, возникла необходимость более углубленного изучения проблемы, и построения, по возможности, более точной модели этих процессов. Изучение микроэволюции большинства РНК-вирусов в настоящее время проводится с использованием математических и имитационных моделей (Wilke C.O. Quasispecies theory in the context of population genetics [Электронный ресурс] // BMC Evolutionary Biology. 2005. Vol. 5. N 44. URL: www.biomedcentral.com/1471-2148/5/44 (дата обращения: 04.10.09)), в которых представлена микроэволюция нуклеотидных последовательностей вирусов, формирующих квазивид. К началу нашего исследования, моделирование микроэволюционных процессов у хантавирусов не проводилось, поэтому построение модели было необходимо, так как позволяло оценить роль различных механизмов изменчивости и понять направленность процессов формообразования в данной группе вирусов, а также эволюционные ограничения, накладываемые на вирусную популяцию взаимодействием с организмом хозяина. Соответствие темы диссертации требованиям Паспорта специальностей ВАК Министерства образования и науки РФ. Диссертационное исследование выполнено в рамках специальности 03.00.16 экология и соответствует п.2 «Популяционная экология» Паспорта специальностей ВАК Министерства образования и науки РФ. Цель исследования – Выявить эколого-генетические механизмы изменчивости геномов хантавирусов и исследовать их влияние на процессы микроэволюции в популяциях хантавирусов, ограниченных по численности. Задачи исследования:
Научная новизна. Впервые выполнен сравнительный статистический анализ консервативности первичной структуры S и M сегментов генома хантавирусов генотипов Старого Света. Впервые показана возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов Пуумала и Хантаан. Показано существование коррелированных нуклеотидных замен в S - сегментах генотипов Тула, Пуумала, Хантаан, Добрава/Белград. Разработан алгоритм поиска гомологичных рекомбинаций в массиве выровненных нуклеотидных последовательностей с применением метода вычисления значений взаимной информации. Впервые проведено имитационное моделирование микроэволюции хантавирусных последовательностей, учитывающее возможность осуществления гомологичной рекомбинации и существование связанных нуклеотидных замен в S - сегменте, позволившее охарактеризовать влияние этих механизмов изменчивости на микроэволюцию ограниченной по численности популяции хантавирусов. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные, раскрывают действие некоторых эколого-генетических механизмов микроэволюции хантавирусов Старого Света, влияющих на изменение приспособленности вирусов к организму хозяев-грызунов, расширяют и углубляют представления о процессах, происходящих в вирусных популяциях. Результаты исследования могут быть использованы при уточнении классификационных критериев хантавирусов, создании вакцин, в медицинской практике, в дальнейшей научно – исследовательской работе. Личный вклад автора состоит в самостоятельном отборе и обработке данных о хантавирусах Старого Света и их генетических последовательностях, разработке и тестировании методов анализа нуклеотидных последовательностей хантавирусов (методы поиска случаев гомологичной рекомбинации и наличия коррелированных замен нуклеотидов), создании имитационной модели микроэволюционных процессов в пределах вирусного квазивида, написании компьютерных программ, реализующих эти методы, формировании научных положений и выводов. Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены значительным объемом анализируемого материала, применением современных методов исследований и подтверждением их методами математической статистики. Основные положения работы, выносимые на защиту.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней» (г. Омск: 2001); конференции, посвященной 70-летию изучения хантавирусов на Дальнем Востоке (г. Владивосток, 2003); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири.» (г. Омск, 2008); конференции, посвященной 70-летию медико-профилактического факультета ОГМА (г. Омск, 2008); республиканской конференции, посвященной 70-летию учения Е. Н. Павловского о природной очаговости болезней (г. Омск, 2009). Организация исследований. Работа выполнялась в период с 2001 по 2007 гг. в Омской Государственной Медицинской Академии и ФГУН Омск НИИПОИ Роспотребнадзора. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (235-источников, из них 206 - зарубежных). Материалы изложены на 135 листах компьютерного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 11 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В главе приведен обзор литературных данных относящихся к свойствам генетических последовательностей хантавирусов Старого и Нового Света, скорости их эволюции и зависимости генетических расстояний между нуклеотидными последовательностями одного генотипа от степени географической и экологической изоляции. Рассмотрены основные статистические подходы к анализу свойств генетических последовательностей и математические модели эволюции популяций генетических последовательностей, использующие понятие квазивид. 2. Материалы и методы Объектами исследования являлись нуклеотидные последовательности малого и среднего сегментов генома хантавирусов генотипов Тула (31- изолят, 97 последовательностей), Пуумала (52,516), Хантаан (44,125), Сеул (48, 204), Добрава/Белград (38, 171), хантавирусов Нового Света (26 генотипов, 326 последовательностей), и некоторых неклассифицированных хантавирусов (11 генотипов, 16 последовательностей), полученные из банков данных (GenBank и EMBL) в режиме свободного доступа и в исследованиях, проведенных ФГУН Омск НИИПОИ Роспотребнадзора (г. Омск) совместно с ГУ ИПВЭ РАМН им. акад. М.П.Чумакова (г. Москва).Методы анализа генетических последовательностей. При сравнении нуклеотидных последовательностей в качестве меры подобия использовалось значение взаимной информации - MJ (Кульбак С. Теория информации и статистика. М.: Наука, 1967. 220 с.; Чалей М.Б., Коротков Е.В. Информационный подход к выявлению сходства генов тРНК и их глобальная классификация // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. N 6. С. 915-927). Удвоенное значение MJ распределено как случайная величина 2, что позволяет оценить вероятность случайной взаимосвязи двух последовательностей в одном испытании и выбрать значение минимального уровня взаимной информации MJmin, обеспечивающее обнаружение статистически значимой взаимосвязи последовательностей с заданной вероятностью ошибки. Построение филогенетических деревьев по нуклеотидным последовательностям проводилось с использованием методов максимального правдоподобия и связывания ближайших соседей (Вейр Б. Анализ генетических данных. –М.: Мир, 1995. 400 c). Для подтверждения обнаруженных случаев гомологичной рекомбинации в сегментах строились дендрограммы, в которых объединение в кластеры осуществлялось в соответствии со значениями MJ, рассчитанными при сравнении каждой нуклеотидной последовательности с другими, аналогично алгоритму идентификации сообщений, передаваемых по каналам с помехами (Клюев Н.И. Информационные основы предачи сообщений. - М.: «Советское радио», 1966. 360 c.). В этом случае, кластер можно считать однородным с заранее заданной доверительной вероятностью, а последовательности, входящие в него, одинаково дивергировавшими друг от друга, если отношение максимального значения MJ, из рассчитанных для всех возможных пар последовательностей этого кластера, к сумме этих значений меньше квантиля распределения Кокрена. А      нализ консервативности вирусных нуклеотидных последовательностей проводился путем построения филогенетических профилей (Weiller G.F. Phylogenetic Profiles: A Graphical Method for Detecting Genetic Recombinations in Homologous Sequences // Mol. Biol. Evol. 1998. Vol. 15. N 3. P. 326-335), где по оси абсцисс откладывались координаты правой границы скользящего окна (номер нуклеотида в сегменте, далее н.), а по оси ординат - значения MJ, рассчитанные при сравнении фрагментов выровненных гомологичных последовательностей, попадающих в «скользящее окно» шириной 100 и 150 н., двигающееся вдоль пары сравниваемых последовательностей. Пики, присутствующие на этих графиках в одном и том же месте, показывают наличие и положение консервативного участка в данном массиве последовательностей, а общие для всех кривых спады графиков соответствуют положению вариабельных участков. Рис. 1 Результат сравнения по уровню MJ последовательностей S - сегмента вирусов генотипа Пуумала (изолят Gomselga сравнивается с изолятами Korhumaki, Sotkamo, Evo/12Cg/93, а изолят Opina916 с изолятом Eidsvoll). Серым прямоугольником вдоль горизонтальной оси показано положение кодирующей части сегмента, цифрами в рамках обозначены номера консервативных участков. Случаи гомологичной рекомбинации выявляли после попарного сравнения всех последовательностей одного генотипа по уровню MJ. Наличие разных по составу групп с высоким уровнем подобия внутри группы, обнаруженных для соседних участков последовательности длиной более 150 символов, свидетельствует о наличии гомологичной рекомбинации. На дендрограммах, это проявляется в перемещении последовательности из одного кластера в другой. Для оценки значимости обнаруженных случаев гомологичной рекомбинации задавался уровень отсечки MJL = 130 – 140. Он обеспечивает достаточно малую вероятность ошибки (< 3%) при выделении возможных единиц рекомбинации в составе последовательностей. Поиск корреляций при возникновении нуклеотидных замен: в массивах выровненных нуклеотидных последовательностей S - сегмента каждого вирусного генотипа столбцы с разными координатами (отсчитываемыми от первого нуклеотида в кодирующей части последовательности) сравнивались между собой по уровню взаимной информации. В результате, для всех возможных пар столбцов в массиве выровненных последовательностей был получен набор значений MJ, по которым оценивали связь между заменами нуклеотидов в этих столбах. Для каждого генотипа был рассчитан минимально значимый уровень MJ (заданная величина ошибки ( 5%): Тула - 20, Пуумала - 21, Добрава/Белград - 18; Хантаан и Сеул - 17. Тестирование рассчитанных значений провели в эксперименте со случайным образом сгенерированными текстами. Р Методы моделирования. В имитационной модели эволюции нуклеотидной последовательности S - сегмента был реализован стандартный алгоритм эволюционного моделирования (Каширина И.Л. Введение в эволюционное моделирование. Воронеж: Воронежский государственный университет, 2007. 40 с; Редько В.Г. Оценка скорости эволюции в моделях Эйгена и Куна // Биофизика. 1986. Т. 31. N 3. С. 511-516), в котором были учтены следующие условия: для моделирования использовалась кодирующая часть сегмента; численность моделируемых популяций ограничена действием иммунной системы хозяев до значений ≈106-108 (Temporal and Spatial Analysis of Sin Nombre Virus Quasispecies in Naturally Infected Rodents / R. Feuer [et al.] // J. of virology. 1999. Vol. 73. N 11. P. 9544–9554; Wilke C.O., Novella I.S. Phenotypic mixing and hiding may contribute to memory in viral quasispecies [Электронный ресурс] // BMC Microbiology 2003. Vol. 3, N 11. URL: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/3/11 (дата обращения: 04.10.09)); допускается существование одной или нескольких оптимальных последовательностей, обладающих достаточной приспособленностью для закрепления в популяции; каждая из последовательностей обладает приспособленностью, которая тем больше, чем выше уровень подобия между рассматриваемой и наиболее близкой к ней оптимальной последовательностью; предварительно, по имеющимся подборкам выровненных последовательностей, для каждого генотипа хантавирусов находится вероятность нахождения каждого типа нуклеотида в каждой позиции последовательности, что позволяет определить вероятность существования последовательности и ее приспособленность; наименее приспособленные последовательности и последовательности с нонсенс-мутациями элиминируются, что сохраняет постоянную во времени численность популяции; мутации типа делеций и инсерций не рассматриваются, допускаются гомологичные рекомбинации внутри сегмента; возникновение мутаций, осуществляется случайным образом в соответствии с имеющимися оценками скорости возникновения замен (10-3-10-5 замен на нуклеотид на одну генерацию - шаг моделирования); для моделирования эволюции последовательностей с учетом корреляции при возникновении мутаций, подсчитываются вероятности P(j1,j2, i1,i2) нахождения каждого нуклеотида типа i1, в каждой позиции j1, в зависимости от каждого типа нуклеотида типа i2 в позиции j2, где i1 , i2 = 1, 2, 3, 4 (A, T, C, G), где j1, , j2 меняются от 1 до L, где L-длина кодирующей части S - сегмента. Это позволяет построить матрицу Р каждого генотипа хантавирусов размерностью (L,L,4,4), используемую при моделировании и с ее помощью учесть наличие возможной корреляции при возникновении замен в сегменте. Программное обеспечение. При написании компьютерных программ, подсчитывающих MJ для анализа последовательностей, использовался язык фортран. Для выравнивания последовательностей и построения филогений применялись программы: Clustal X (1.8); Phylip3.5; Njplot и TreeViev 1.6.6; BioEdit 5.0.9. Построение графиков и расчет вероятностей при использовании свойств стандартных статистических распределений проводились с помощью Microsoft Excel. 3. Результаты и обсуждение Анализ филогений вирусов. Исследование показало, что предположение о соответствии генетических расстояний географическим расстояниям между изолятами не всегда подтверждается для хантавирусов Старого Света. Это видно на примере геновариантов хантавирусов Тула и Пуумала из природных очагов в Омской области (рис. 3): геноварианты хантавируса Тула, географически наиболее близкие, но изолированные от разных хозяев (MG22/Omsk, MG23/Omsk - от узкочерепной полевки; LL2\Omsk, LL58\Omsk - от степные пеструшки), показывают большее подобие с геновариантами из европейской части России и Восточной Европы соответственно, чем друг с другом (см. рис. 3а); геноварианты хантавируса Пуумала обнаруживают большее подобие с карельскими и финскими геновариантами, чем с поволжскими, более близкими к ним географически (см. рис. 3б). В пределах генотипов Хантаан и Добрава/Белград также выявляется высокий уровень сходства первичной структуры генома географически удаленных изолятов: изоляты вируса Хантаан из китайской провинции Гуйчжоу оказываются наиболее подобны последовательностям географически удаленных от них изолятов Хабаровского края и Кореи. Как показывают позднее опубликованные работы китайских авторов генетическое разнообразие нуклеотидных последовательностей в этой провинции Китая наибольшее, и предполагается, что именно здесь находился центр, из которого происходила адаптивная радиация хантаан-подобных вирусов (Molecular diversity and phylogeny of Hantaan virus in Guizhou, China: evidence for Guizhou as a radiation center of the present Hantaan virus/ Yang Zou [et. al] // J. of General Virology. 2008. Vol. 89. P. 1987-1997). - Рис.3. Филогенетические деревья, построенные с использованием метода связывания ближайших соседей для гомологичных фрагментов S - сегмента хантавирусов Тула (а, 409 н.) и Пуумала (б, 905 н.) Величина бутстрэп – выборок – 1000. Рядом с каждым кластером указан уровень гомологии его нуклеотидных последовательностей (в %). В качестве внешних групп для укоренения деревьев использованы последовательности генотипа Хантаан (84Fli), Khabarovsk и Topografov. Для геновариантов хантавируса Добрава/Белград наибольшее влияние оказывает принадлежность разным хозяевам: Apodemus flavicolis или A. agrarius: так нуклеотидные последовательности из Словакии и России обнаруженные у A. agrarius более схожи, чем последовательности из одного и того же района Словакии от вирусов, принадлежавших разным хозяевам. Следовательно, предположение о строгой зависимости генетических расстояний от географических в пределах генотипа, нельзя считать справедливым во всех случаях. В тех местах, где возникает несоответствие данному предположению, наблюдается перекрывание ареалов обитания разных видов, которые являются хозяевами для одного и того же вирусного генотипа: у хантавирусов Тула - Microtus arvalis, M. gregalis, Lagurus lagurus, ареалы обитания, которых перекрываются на юге Западной Сибири; у Пуумала - Myodes rufocanus и M. glareolus, ареалы обитания, которых перекрываются от юга Западной Сибири, далее - через Урал, по северу европейской России до Карелии; у Хантаан – перекрытие ареалов обитания полевых мышей и крыс; у Добрава/Белград – A. flavicolis и A. agrarius, ареалы которых перекрываются на территории Европы. Вероятнее всего, генетические расстояния между отдельными геновариантами формируются в ходе двух процессов: миграции хозяев и распространения хантавирусов в их популяциях, которое может происходить с переключением вируса с одного хозяина на другого. Грызуны – хозяева хантавирусов, в течение своей жизни обычно не совершают больших миграций, и площадь их обитания часто ограничена несколькими квадратными километрами. Однако, в прошлом, в связи с природными процессами, приводящими к изменению климатических условий и ландшафтов (чередование оледенений и межледниковых периодов, имевших место в северном полушарии или горообразование) происходило периодическое расселение всех видов грызунов из неких рефугиумов на территории современного обитания. И вместе с ними расселялись их паразиты, в т.ч. - хантавирусы. В Китае и Корее эти два процесса имеют место и в настоящее время из-за высокой мобильности крыс – основных хозяев вирусов генотипа Хантаан. Анализ консервативности нуклеотидных последовательностей S - и М - сегментов хантавирусов. При анализе полученных филогенетических профилей, построенных для S - сегментов разных генотипов, обнаруживается похожая картина (табл. 1): в кодирующей части сегмента выделяются четыре наиболее консервативных участка последовательности со схожими координатами, превышающими критические значения MJ = 135 – 140. Ширина участков у разных генотипов может отличаться. Наиболее консервативными оказываются участки 1 и 4; внутренние участки с номерами 2 и 3, расположенные в центре кодирующей части (≈300 - 790 н., ≈680 - 1030 н.), менее выражены, и при сравнении некоторых геновариантов одного генотипа могут отсутствовать. Кроме концевых (3’- и 5’-) консервативных участков в не кодирующей части типичных для всех буньявирусов (The 5’ Ends of Hantaan Virus (Bunyaviridae) RNAs Suggest a Prime-and-Realign Mechanism for the Initiation of RNA Synthesis/ D. Garcin [et al.]. J. of virology. -1995. -Vol. 69, № 9. -P. 5754-5762), иногда обнаруживается дополнительный консервативный фрагмент в некодирующей части на 3’- конце (участок 5, см. табл. 1) Таблица 1 Результат анализа консервативности S - сегмента
Таблица 2 Результат анализа консервативности М-сегмента
Примечание: «―» отсутствие консервативного участка; «*» – невозможность точно определить координаты участка; консервативный участок выделяется только при сравнении сильно дистанцированных геновариантов. Анализ М-сегмента выявляет большую вариабельность последовательности гена G1 и несколько большую консервативность – гена G2, что согласуется с литературными данными (Schmalion C.S., Schmalion A.L., Dalryple J. M. Hantaan Virus M RNA: Coding Strategy, nucleotide Sequence, and Gene Order // Virologi. 1987. Vol. 157. P. 31-39). Для М-сегмента хантавирусов, также как и для S-сегмента, характерно сохраняющееся чередование консервативных и вариабельных участков в пределах генотипа (табл.2). Филогенетические отношения и потенциальные участки рекомбинации. Генетические расстояния при сравнении гомологичных фрагментов нуклеотидных последовательностей S и М - сегментов хантавирусов обычно сохраняются, но в некоторых случаях наблюдается их изменение в зависимости от того, какие фрагменты сегмента взяты для сравнения. Чтобы определить, что явилось причиной таких различий – накопление точечных мутаций или возникновение гомологичной рекомбинации - был проведен анализ консервативности нуклеотидных последовательностей, после чего, случаи резкого изменения уровня подобия, обнаруженные при сравнении консервативных участков, проверялись для выявления возможной гомологичной рекомбинации. В результате, у хантавирусов генотипов Тула, Пуумала, Хантаан и Добрава/Белград выявлены изоляты, M и S - сегменты которых являются результатом возникновения гомологичной рекомбинации внутри сегмента: У генотипа Тула рекомбинантными являются S - сегменты изолятов D5-98, D17-98 и D63-98 из Германии, имеющие соседствующие участки, гомологичные географически дистанцированным вариантам: участки 1, 3 и фрагмент на 3’-конце имеют наибольшее подобие с вариантами из Моравии и Восточной Словакии (Kosice), а участки 4 и 2 - с сибирскими MG23/Omsk и Omsk/LL2. В S - сегменте хантавируса Добрава/Белград в средней части кодирующей последовательности (участки 2 и 3) выявляется высокий уровень подобия всех изолятов, полученных от A. flavicolis и A. sylvaticus, независимо от их географического происхождения (MJ = 150 - 175). В то же время, на краевых консервативных участках 1 и 4 в кодирующей части последовательностей, может иметь место достаточно высокий уровень подобия с изолятами от A. agrarius: российским геновариантом Куркино и, в меньшей степени, с эстонским - Сааремаа (MJ = 145 - 165). По-видимому, в эволюционной истории этих групп имела место гомологичная рекомбинация, в которую вовлекались последовательности вышеупомянутых геновариантов хантавируса Добрава\Белград. У хантавирусов генотипа Хантаан также выявлены рекомбинантные формы S - сегмента. При сравнении последовательностей изолятов A16, TJJ16В между консервативными участками 3 и 4 наблюдается резкое падение значения MJ от 205 до 140, что можно рассматривать, как следствие гомологичной рекомбинации с участием неизвестной последовательности. Рекомбинантной является последовательность S - сегмента китайского изолята Hu (провинция Хубэй): на участке 2 наибольшее подобие (MJ = 160 - 170) - с геновариантом Q32 из провинции Гуйчжоу, а на участках 1, 3, 4 - с геновариантами из провинции Аньхой - Chen4, RG9, E142, 84Fli, hv84Fli (MJ = 158 – 170). Если рассматривать их географическое расположение, то геновариант Hu (провинция Хубэй) занимает промежуточное положение между геновариантами 84Fli, hv84Fli и Chen4 (провинция Аньхой) и геновариантом Q32 (Гуйчжоу). Таким образом, фрагменты последовательности S - сегмента с высоким уровнем подобия могут сохраняться у географически отдаленных друг от друга геновариантов и отсутствовать у более близких. М-сегмент вируса Хантаан изолята A16 также следует рассматривать как результат рекомбинации: часть последовательности (1-1870 н.) кодирующая G1 слева от точки рекомбинации почти идентична (MJ180-205) геноварианту H8205, а часть справа (1885-1300 н.), приходящаяся на G2 идентична М - сегменту геноварианта 84Fli. Этот случай подтвержден и другими методами исследований (Chare E.R. Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses / E.R. Chare, E.A. Gould, E.C. Holmes // J. Gen. Virol. 2003. Vol. 84. P. 2691-2703). Из хантавирусов генотипа Пуумала к рекомбинантным можно отнести геновариант Ufa97.11, имеющий мозаичную структуру гена G1: на участках с координатами 201 - 400, 540 – 600 н., характерный для географически близких последовательностей из одного кластера, наблюдается высокий уровень подобия с башкирскими и удмуртскими вариантами (MJ = 170 – 190) и, одновременно, низкий, характерный для сравнения геновариантов из разных кластеров (MJ 130), на участке с координатами 400 – 540 н. Это может быть следствием включения в М - сегмент фрагмента из другой, не рассматривавшейся в данном обзоре последовательности. Следствием гомологичной рекомбинации у предковых по отношению к последовательности М - сегмента геновариантов Vindeln и Vranica может быть более высокое подобие (MJ = 140 - 150) с геновариантом Sotkamo на участках с координатами 1245-1449 н. (G1) и 2260-2320 н. (G2) н. для Vindeln; и 2590-2650 н. (G2) для Vranica в то время как для остальных участков их последовательностей этого не наблюдается. Корреляции замен в нуклеотидных последовательностях S -сегментов хантавирусов. В дальнейшем изложении без скобок указывается номер нуклеотида в последовательности, в скобках указан номер аминокислоты (а.к.), нуклеотидная замена в триплете которой является связанной с заменами в других нуклеотидах кодирующей последовательности. Генотип Тула. Узловыми точками в последовательности, с которыми связано большинство значимых корреляций, являются нуклеотиды с координатами 817 (258 а.к.), 805 (254 а.к.) и 556 (171 а.к.). Генотип Хантаан. Узловой точкой является нуклеотид с координатой 547 (170 а.к.). Число значимых корреляций намного меньше, чем для генотипа Тула (16 и 46 соответственно), при этом число нуклеотидных замен в расчете на 100 позиций у этих генотипов отличается незначительно (максимальные значения - 65 и 67 соответственно), это говорит о меньшей согласованности возникающих здесь мутаций по сравнению с геномом вирусов Тула. Генотип Пуумала. Здесь обнаруживается наибольшее количество коррелированных замен нуклеотидов (359). Узловыми точками являются нукледотиды с координатами: 654 (204 а.к.) – с ним связано 25 коррелированных замен, 687 (215 а.к.) – 24, 804 (254 а.к.) – 23, а также нуклеотиды в интервале 590-850, между которыми наблюдается значительное число корреляций. Видимо мутации, возникающие в S - сегменте вирусов Пуумала, более согласованы между собой и, возможно, с мутациями в некодирующей части (3’- конец). Генотип Добрава/Белград. Значимые корреляции отмечаются в 26 аминокислотных позициях. Количество нуклеотидных замен в расчете на сто позиций (≤ 38) было наименьшим среди рассмотренных генотипов, но так же, как и в случае вирусов Пуумала, сильно возрастало по направлению к 3’- концу последовательности. Наибольшее количество значимых коррелированных нуклеотидных замен зафиксировано для нуклеотида с координатой 208 (56 а.к.). Генотип Сеул. Значимых корреляций не обнаружено. Наличие коррелированных замен нуклеотидов в триплетах основной рамки считывания S - сегмента генома хантавирусов различных генотипов позволяет говорить о том, что отбор мутаций идет связанно по нескольким позициям в последовательности сегмента. Это может быть одним из механизмов, приводящих к дивергенции вирусов. Непосредственные причины существования корреляций не выявлены, но известно, что особенности вторичной структуры РНК влияют на замены, происходящие в нуклеотидной последовательности (например, при формировании шпилек РНК и третичных взаимодействиях). Есть также вероятность того, что обнаруженные корреляции являются результатом существования ограничений для третичной структуры белка нуклеокапсида у хантавирусов. N-протеин, кодируемый S - сегментом, выполняет несколько функций в процессе жизнедеятельности хантавирусов (Characterization of the Hantaan Nucleocapsid Protein-Ribonucleic Acid Interaction / W. Severson [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274. N 47. P. 33732–33739; The RNA Binding Domain of the Hantaan Virus N Protein Maps to a Central, Conserved Region / X.Xu [et al.] // J. Virol. 2002. Vol. 76. N 7. P. 3301-3308). Он взаимодействует с тремя видами вирусных РНК: геномной РНК, антигеномной РНК и матричной РНК. Следовательно, можно ожидать наличие связи между изменениями, возникающими в аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида, и изменениями, возникающими в местах связывания (или рядом с ними) на нуклеотидной последовательности вирусных РНК. В пользу этого говорит обнаружение многочисленных корреляций нуклеотидных замен в S - сегменте генотипа Пуумала, для которого предполагается существование множества связывающих сайтов для белка нуклеокапсида (Characterization of the Hantaan Nucleocapsid Protein-Ribonucleic Acid Interaction / W. Severson [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274. N 47. P. 33732–33739), действующих кооперативно, а не 1-2 консервативных участка на 5’ конце, как предполагается в случае с вирусами Хантаан и Тула. Таблица 3. Количество обнаруженных корреляций.
Как видно (см. табл. 3), наличие большого числа корреляций (как у генотипа Пуумала) возможно ведет к ограничению числа хозяев, в то время как генотип Хантаан, у которого выявлено наименьшее число корреляций, связан с наибольшим числом хозяев-грызунов. Это можно объяснить тем, что наличие корреляций препятствует возникновению быстрых изменений в генетических последовательностях за счет дополнительного направленного отбора мутаций, которые должны соответствовать схеме корреляций. А при переключении вируса на другого хозяина быстрые изменения генома часто являются условием выживания вируса в новой среде. Результаты моделирования микроэволюции хантавирусных популяций. Популяции, полученные в результате моделирования, по своему составу соответствуют понятию “квазивид”, и являются устойчивым состоянием, к которому стремится данная система при наличии постоянных условий. Численный рост популяции наиболее приспособленных последовательностей, получаемый при работе предложенной имитационной модели, может изменяться в соответствии с классическими вариантами (Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных процессов. М.: Изд. МГУ, 1993. 301 С.), наблюдаемыми при решении дискретного аналога уравнения Ферхюльста: 1) при небольших скоростях роста популяции возрастать по логистическому закону до максимально возможного; 2) при средних скоростях роста популяции меняться периодически; 3) при больших скоростях роста популяции изменяться стохастически. Проводились следующие варианты моделирования: - без учета корреляций замен нуклеотидов, наблюдался: а) рост максимального значения приспособленности внутри популяции в случаях монотонного возрастания и (или) наличии периодических колебаний численности группы наиболее приспособленных последовательностей (при устанавливаемой скорости возникновения замен 10-4-10-5 замен на нуклеотид на одну генерацию); б) беспорядочные колебания максимального значения приспособленности или его снижение в случае стохастических изменений численности при большей скорости возникновения замен (≥10-3) замен на нуклеотид на одну генерацию. - с учетом корреляции замен нуклеотидов: а) при наличии многочисленных, интенсивных корреляций, выявляемых со значениями MJ > 20, например, как у хантавирусов генотипа Тула, может проявиться режим хаотических колебаний численности в группе наиболее приспособленных последовательностей (приспособленность при этом остается на одном уровне или падает) даже при сравнительно низкой скорости возникновения замен (5•10-5); б) при малом числе корреляций, например, как у генотипа Хантаан или их отсутствии, как у генотипа Сеул, в процессе моделирования реализуются пути, описанные для случаев без корреляций. Это может быть объяснено нарушением схемы корреляций нуклеотидных замен и, соответственно, уменьшением значения приспособленности и полной элиминацией мутировавших последовательностей и их потомков, даже при высоком уровне гомологии внутри группы. Тогда, место группы наиболее приспособленных последовательностей занимает другая субпопуляция с достаточно большим значением приспособленности у каждой последовательности. Такой режим быстрого восстановления при режиме хаотических колебаний численности группы наиболее приспособленных последовательностей возможен при наличии высокого уровня гомологии (>94%) внутри всей популяции. Наличие корреляций в процессе моделирования ведет также к снижению значения максимальной достигаемой приспособленности в популяции и большему генетическому разнообразию последовательностей, полученных в результате моделирования.
1. Генетические расстояния внутри генотипов хантавирусов определяются не только географическим расстоянием и видовой принадлежностью хозяев, но в большей мере историей расселения хозяев и вирусов включающей переключения на нового хозяина при перекрывании ареалов обитания хозяев. 2. В кодирующих частях последовательностей М и S - сегментов генома хантавирусов Старого Света имеет место устойчивое чередование консервативных и вариабельных участков, эволюционирующих с различной скоростью, а также действует механизм гомологичной рекомбинации 3. Наличие в кодирующих частях последовательностей S - сегмента генома хантавирусов Тула, Пуумала, Хантаан и Добрава/Белград корреляций в возникновении нуклеотидных замен является механизмом, лимитирующим генетический дрейф и ограничивающим возможности приспособления хантавирусов к новым хозяевам. 4. Имитационное моделирование демонстрирует, что:
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1. Тюлько Ж.С. Филогенетические отношения хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации. Вирусы генотипа Тула/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Вопр. вирусологии. -2006. - №3. - С. 37- 42. 2. Тюлько Ж.С. Изучение филогенетических отношений хантавирусов генотипа Пуумала с применением метода вычисления взаимной информации/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Вопр. вирусологии. -2007. - №2. - С. 20 - 24. 3. Тюлько Ж.С. К вопросу о темпах эволюции хантавирусов генотипа Пуумала/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Тихоокеанский медицинский журнал. -2008. - №2. - С. 28 - 32. 4. Тюлько Ж.С. Связанные замены в малом сегменте генома хантавирусов Старого света/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Вопр. вирусологии. -2008. - №3. - С. 28 - 34.
1. Тюлько Ж.С. Применение метода весовых функций к анализу рапространенности SINES в генетических последовательностях/ Ж.С.Тюлько, Е.В.Коротков //Новые информационные технологии в медицине и экологии. –Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 1997. –С. 75-76. 2. Тюлько Ж.С. Изучение филогенетических отношений хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации (на примере Хантаан-подобных вирусов)/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко //Хантавирусы и хантавирусные инфекции. – Владивосток, 2003.-С. 173-181. 3. Тюлько Ж.С. О существовании зон рекомбинации у хантавирусов/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко, А.Е.Деконенко //Актуальные аспекты природноочаговых болезней. – Омск, 2001. –С. 85-86. 4. Якименко В.В. Филогенетические отношения западно-сибирских хантавирусов генотипов Тула и Пуумала/ В.В.Якименко, Ж.С.Тюлько, А.Е.Деконенко //Хантавирусы и хантавирусные инфекции. – Владивосток, 2003.-С. 161-172. 5. Korotkov E.V. Latent sequence periodicity of some oncogenes and DNA-binding protein genes/ E.V.Korotkov, M.A. Korotkova, J.S.Tulko // CABIOS.-1997. –Vol.13, №1. -P.37-44. 6. Korotkov E.V., MIRs are present in coding regions of human genes/ E.V.Korotkov, J.S.Tulko, D.A.Phoenix // DNA Sequence. – 1998. –Vol.8, -P.31-38. 7. Tulko J.S. Distribution of MB1 repetitive elements in different genomes and discovery MB1 in exons/ J.S.Tulko, E.V.Korotkov // Moskow: preprint/MEPhi, 004-97, 1997. –20p. жүктеу/скачать 5.5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
