Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm

УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор ООО «ИнтерЛабСервис»

И. А. Гущина __________ «____» 2011 г.

Соответствует требованиям национальных стандартов

и технической документации изготовителя

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. НАЗНАЧЕНИЕ

QIAGEN устанавливает стандарты в следующих областях:

• 
  Очистка РНК, ДНК и белков
  
• 
  Исследование нуклеиновых кислот и белков
  
• 
  Исследование микроРНК и РНК-интерференции
  
• 
  Выявление генетических и эпигенетических факторов онкологических заболеваний
  
• 
  Автоматизация технологий пробоподготовки и исследований
  

Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM предназначены для качественной оценки мутационного статуса в генах EGFR, KRAS, BRAF из ДНК человека, выделенной из зафиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолевой ткани.

Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для выявления соматических мутаций в кодоне V600E в гене BRAF методом ПЦР в реальном времени, используя комбинацию двух технологий – аллель специфичную ПЦР с праймерами Scorpions и обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен применяться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории с пробами ДНК, извлеченными из фиксированной формалином и залитой парафином опухолевой ткани.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

   1. Принцип метода

Аллель-специфичная или специфичная для данной мутации амплификация достигается с помощью ARMS (Amplification Refractory Mutation System, рефракторная мутационная система амплификации). Taq ДНК-полимераза (Taq) эффективна для различения соответствий и несоответствий на 3'-конце ПЦР-праймера. Специфические последовательности, несущие мутации, селективно амплифицируются даже в пробах, где большинство последовательностей не имеют данной мутации. Когда праймер полностью соответствует, амплификация проходит в полном объеме. В случае несоответствия 3'-конца последовательности геномной ДНК, происходит лишь незначительная фоновая амплификация.

Регистрация продуктов амплификации происходит с использованием праймеров Scorpions. Scorpions - это бифункциональные молекулы, содержащие ПЦР-праймер, ковалентно связанный с зондом. Флуорофор в этом зонде взаимодействует со снижающим флуоресценцию гасителем, также встроенным в зонд. В ходе ПЦР, когда зонд связывается с ампликоном, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к повышению флуоресценции в реакционной пробирке.

Работа с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» проходит в два этапа. На первом этапе выполняется контрольное измерение для определения суммарной ДНК в пробе. На втором этапе определяется наличие или отсутствие мутантной ДНК.

1. 
   Формат набора
   

- мутационных система для анализа мутаций

Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 3 гена BRAF. Праймеры и зонд разработаны так, чтобы избежать любых известных полиморфизмов BRAF.

Мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется ПЦР - анализом в реальном времени.

2. 
   Определение исходного материала для анализа
   

Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолей. Образцы должны транспортироваться в соответствии со стандартными требованиями работы с патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов.

Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)».

3. 
   Выделение ДНК
   

• 
  Поместите срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные стекла
  
• 
  Соскребите избыток парафина вокруг срезов ткани, используя стерильный скальпель.
  
• 
  Соскребите срезы тканей в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель для каждой предназначенной для выделения пробы.
  
• 
  Расщепление протеиназой К должно проводиться в течение 1 часа.
  
• 
  Очищенную геномную ДНК растворяют в 200 мкл буфера ATE (поставляемого в наборе для тканей QIAamp DNA FFPE).
  
• 
  Храните очищенную геномную ДНК при 15–25°C.
  

4. 
   Внутренние контроли.
   

Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Тем не менее, набор для ПЦР не будет работать с тяжелыми фрагментами ДНК.

Пробы в дополнение к интересующей реакции содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если оба анализа оказались неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку присутствовавшие ингибиторы могли привести к ложным отрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это также разбавит ДНК.

Все экспериментальные анализы должны содержать контроли.

5. 
   Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе.
   

Для оптимального использования реактивов в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» пробы следует обрабатывать партиями. Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего количества реактивов и снижает количество проб, которые можно протестировать данным набором.

6. 
   Анализ данных
   

Значения ∆C_T пробы вычисляются как разница между определением мутации C_T и контрольным измерением C_T от той же пробы. Пробы классифицируются как положительные (наличие мутации), если они дают ∆C_T меньше, чем пороговое значение ∆C_T для этого анализа.

Выше этого значения проба либо может содержать процент мутантной ДНК ниже необходимого для обнаружения с помощью набора (за аналитическим пределом), либо проба отрицательна по мутациям.

Значения C_T мутационных, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или находящимися за пределами чувствительности набора.

При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное праймирование, давая очень запоздалый фоновый C_T от ДНК, не содержащей мутации. Все значения ∆C_T, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше пороговых значений ∆C_T, и проба будет классифицироваться как отрицательная по мутациям.

Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации в реальном времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата.

7. 
   Контроль качества
   

В соответствии с сертифицированной по ISO Системой контроля качества QIAGEN, каждая партия наборов реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» тестируется в соответствии с утвержденными техническими условиями для обеспечения постоянного качества продукта.

2. 
   
   жүктеу/скачать 3.31 Mb.
   
   Достарыңызбен бөлісу: