Инструкция 10-15-21-2006 микробиологические методы выделения и идентификации возбудителей

Инструкция 4.2.10-15-21-2006

ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ

Минск – 2006

УТВЕРЖДЕНО

Постановление

Главного государственного

санитарного врача

Республики Беларусь

09 октября 2006 г. № 120

«МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И

ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ»

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Настоящая Инструкция предназначена для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор.

Настоящая Инструкция является обязательной к применению в ходе проведения микробиологических исследований по реализации санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий при пищевых отравлениях.

Перечень объектов, которые по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования связаны с предполагаемой этиологией отравления, сроки забора материала, объем микробиологических исследований, определяются лечащим врачом или врачом эпидемиологом.

Пищевые отравления, вызванные микроорганизмами, представляют актуальную проблему здравоохранения. Большинство стран отмечают существенные увеличения на протяжении последних десятилетий значительной распространенности заболеваний, связанных с содержанием условно-патогенных микроорганизмов в продуктах питания. К числу этих микроорганизмов относятся сальмонеллы, кампилобактерии, энтеропатогенные кишечные палочки. Своей актуальности не теряют и другие возбудители: Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Вasillus cereus, бактерии рода Shigella и др. Различные виды патогенных и условно патогенных микроорганизмов могут явиться причиной пищевого отравления при определенных условиях и массивности дозы.

ГЛАВА 2
ОТБОР, НАПРАВЛЕНИЕ И ПОДГОТОВКА ПРОБ

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
На исследование направляются те материалы, которые по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования связаны с предполагаемой этиологией отравления.

Объектами исследования могут быть: остатки подозреваемой пищи, употребленной заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовались при ее приготовлении; суточные пробы готовой пищи (если установлен порядок обязательного их хранения); испражнения, рвотные массы, промывные воды, моча пострадавших; кровь для получения гемокультур и для постановки серологических реакций (при подозрении на ботулизм кровь берут до введения лечебной противоботулинической сыворотки); слизь из зева и носа, выделения гнойничковых поражений кожи персонала, занятого приготовлением готовой пищи; смывы и соскобы с инвентаря, оборудования, тары, рук персонала; вода питьевая, в том числе из графинов, питьевых бачков; содержимое желудка, отрезок тонкого кишечника, паренхиматозные органы (печень, селезенка), кровь из сердца, костный мозг, мезентериальные лимфатические узлы, желчь - при летальных исходах заболевания.

Общим требованием к процедуре отбора проб является обеспечение условий, исключающих контаминацию посторонней микрофлорой.

Клинический материал, подлежащий бактериологическому исследованию собирают в стерильную посуду, которую хорошо укупоривают, снабжают этикеткой с фамилией обследуемого и наименованием материала, пробы нумеруют и опечатывают. В сопроводительном документе (направлении) указывают какое учреждение направляет материал, фамилию, имя, отчество и возраст обследуемого; адрес; место работы, учебы, пребывания в организованном коллективе, закрытом учреждении и др.; дату и время заболевания; предполагаемый диагноз; дату и время взятия пробы; фамилию и должность лица, направляющего материал.

Пересылку проб в лабораторию производят в кратчайший срок, если взятые на бактериологическое исследование пробы не могут быть доставлены в лабораторию немедленно, их разрешается хранить в холодильнике при температуре 4-6⁰С не более суток.

Испражнения, получают при естественной дефекации или с помощью ректальных тампонов (петель). Для сбора материала путем естественной дефекации используют тщательно вымытые и лишенные следов дезинфицирующих средств судна или горшки. На дно судна, для защиты материала от следов дезинфектанта, можно поместить лист чистой бумаги. Пробу испражнений отбирают сразу после дефекации с помощью стерильной стеклянной палочки, проволочной петли или деревянного шпателя. При наличии патологических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но свободные от крови.

Получение материала из прямой кишки с помощью ректальных тампонов (петель) осуществляется средним медицинским персоналом. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы. Петля (тампон) вводится в задний проход на глубину 5-6 см.

Для забора материала используют петли из алюминиевой проволоки (отрезок проволоки длинной около 50 см сгибается пополам) или ватные тампоны на проволочной ручке. Ряд фирм выпускает специальные устройства для этих целей.

Если планируется проведение исследований на ОКИ, обусловленные условно-патогенными бактериями, то материал может быть получен только путем естественной дефекации. Получение материала путем естественной дефекации является также предпочтительным при проведении исследований на кампилобактеры и энтеропатогенные кишечные палочки.

Перед обследованием взрослых на бактерионосительство рекомендуется предварительное назначение солевого слабительного - 25-30 г сульфата магния.

Материал собирают в пустую стерильную посуду или в пробирки с консервантом. При исследовании на ОКИ, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами консервант не используется. Время до начала бактериологического исследования, если консервант не применяется, не должно превышать 2 часов.

В качестве консервантов (транспортных сред) используют глицериновую смесь, боратно-буферный раствор, фосфатную буферную смесь, а при исследовании на кампилобактериоз - физиологический раствор, 0,1% пептонную воду, тиогликолевую среду. Наиболее универсальным консервантом является транспортная среда Кэри-Блер.

Применение транспортных сред обязательно, если материал забирается с помощью ректального тампона (петли). Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальная петля должна упаковываться отдельно и погружаться в транспортную среду только после взятия материала.

Объем испражнений, вносимых в транспортную среду не должен превышать 1/3 её объема. После внесения пробу перемешивают со средой. Время хранения образцов до начала исследования может составлять до 1 суток в холодильнике, однако оптимальным является проведение посева через 1-2 часа после забора.

Взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода, до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата. Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики. Кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл., у новорожденных - 1-2 мл. Кровь берут у постели больного или в перевязочной и тут же засевают на питательные среды в соотношении 1:10 во флаконы со средой.

Кровь для постановки серологических реакций забирают из локтевой вены в стерильную сухую пробирку в количестве не менее 8-10 мл. Постановку серологических реакций производят с сывороткой крови. С целью формирования сгустка кровь выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре или в термостате при 37⁰С, после чего стерильной пипеткой отделяют сгусток от стенок пробирки и помещают в холодильник при температуре 5-8⁰С для окончательного формирования сгустка; сыворотку отсасывают и используют для постановки серологических реакций.

Рвотные массы отбирают в количестве 50-100 мл, промывные воды — в количестве 100-200 мл. При кислой реакции рвотные массы перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором натрия гидрокарбоната (NaHCO₃).

Желчь (дуоденальное содержимое) получают путем зондирования, реже, во время операции при пункции желчного пузыря. При зондировании желчь собирают в 3 стерильные пробирки раздельно по порциям А, В, С. Пробы должны быть доставлены в лабораторию в течение 1-2 часов.

Среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду. Перед взятием материала больной должен совершить тщательный туалет наружных половых органов. Пробы мочи могут храниться до начала исследования не более 1-2 часов при комнатной температуре и не более суток в холодильнике. Мочу перед посевом центрифугируют и засевают осадок, или используют для посева нативную мочу.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут с помощью стерильного шприца или тампона и помещают в стерильные пробирки.

Спинномозговую жидкость получают при люмбальной пункции, в количестве 5-10 мл и помещают в стерильную пробирку.

Слизь из зева и носа забирают стерильным ватным тампоном и непосредственно засевают на питательные среды или помещают в стерильную пробирку.

Секционный материал забирают из каждого органа или ткани, в стерильных условиях: поверхность органа прижигают раскаленным шпателем, кусочки вырезают из глубины стерильными ножницами. Из желудка и кишечника содержимое забирают пастеровской пипеткой путем прокола их стенки. Место прокола предварительно прижигают раскаленным шпателем. Пробы от каждого органа помещают в отдельные стерильные банки.

Отбор проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые методы отбора проб для микробиологических анализов», и другими нормативными документами на конкретный вид продукции. Масса (объем) пробы устанавливается в соответствии с нормативным документом. В тех случаях, когда это невыполнимо, отбор проб производят в количествах менее установленных.

Пробы отбирают асептическим способом в стерильную посуду. Продукты заводского изготовления отбирают в оригинальной упаковке.

Отбор проб продуктов плотной консистенции и сыпучих можно выполнять путем затаривания в несколько слоев стерильной пергаментной бумаги. Остатки консервов направляют на исследование непосредственно в той емкости, из которой они использовались в пищу. При отсутствии остатков консервов, исследованию подлежит содержимое нескольких невскрытых банок, с маркировкой, полностью идентичной маркировке вскрытой банки. Если в партии консервов одноименной маркировки имеются бомбажные банки, их отбирают и исследуют в первую очередь. Маркировочные знаки, поставленные на донышке и крышке банок, регистрируют в лабораторном журнале.

Мясо отбирают для анализа в количестве 500 г, при этом проба отбирается из различных мест туши с обязательным взятием мезентериальных лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости. Если возможно, то следует от животных отбирать кровь из сердца, содержимое кишечника, желчь и стенки желчного пузыря. Для исследования могут быть ис­пользованы также смывы с поверхности туши. Птицу берут целой тушкой или ее остатки, включая анальное отверстие. Мелкую рыбу отбирают в количестве 2-3 штук, от крупной рыбы — 2—3 куска, в том числе из спинки, ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия.

Продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. B отдельную посуду набирают 100-200 мл рассола.

Пробы жидких и полужидких объектов (супы, соусы, кремы, салаты, молоч­ные продукты) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 г. Для вторых блюд норма выемки 1-2 порции. Остатки фактически употребленной пищи отбирают для анализа непосредственно в тех емкостях, в которых они были обнаружены. Допускается доставка также в стерильной посуде, куда остатки пищи должны быть перемещены с соблюдением правил асептики. Суточные пробы направляют для исследования непосредственно в той емкости, в которой они хранились в холодильнике.

В лабораторию пробы пищевых продуктов доставляют в опечатанном виде. В сопроводительном документе указывают: наименование предприятия или учреждения, где произведены выемки проб, его адрес, перечень проб с указанием их веса, характера тары и упаковки (стерильность посуды, охлаждение проб, наличие печати и т. д.), дату и время выемки и отправления в лабораторию; дата и время заболеваниия, срок появления первых клинических симптомов заболевания после употребления подозреваемой пищи, число пострадавших, госпитализированных, наличие случаев со смертельным исходом, предварительный диагноз; при направлении проб нескольких продуктов необходимо отметить, какой из них подозревается как фактор передачи пищевого отравления; цель исследования; должность и подпись лица, произведшего выемку и направившего пробы в лабораторию.

Подготовку проб пищевых продуктов для микробиологических исследований проводят согласно ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

Исследование материалов, доставленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления, производится немедленно по их получении. Во время регистрации доставленного в лабораторию материала, последний хранится в холодильнике.

Непосредственно перед посевом исполнителю необходимо ознакомиться с состоянием упаковки всего материала и каждой отдельной пробы, при этом обратить внимание на целостность упаковки, наличие пломб и печатей, отметить количество доставленного материала. В связи с тем, что большинство проб направляют в лабораторию для бактериологического и для химического исследования, указанный выше осмотр можно проводить совместно с химической лабораторией.

Необходимо перед анализом отметить органолептические качества доставленных проб: внешний вид, запах, консистенцию.

Продукты подвергают бактериологическому исследованию независимо от признаков порчи. Бактериологические исследования пробы начинают с подготовки навески, которая должна охарактеризовать всю доставленную пробу. Материал для навески продуктов плотной консистенции (мясо, колбаса и др.) отбирают берут из разных мест доставленной пробы: с поверхности и из глубины. Если это тушка птицы - из мест, прилегающих к кишечнику; если рыба - вблизи жаберных дужек и анального отверстия.

Возможно использование для приготовления навески всей доставлен­ной пробы, если даже ее вес достигает 500-800 г. Имеет определенное значение исследование навески, состоящей из кусочков, отобранных толь­ко из глубины доставленной пробы. В этом случае при отборе материала для навески производят стерилизацию поверхности металлическим шпа­телем или ножом.

Возможно исследование навески продукта, состоящей из кусочков, отобранных только из поверхностных слоев пробы, т. к. это позволяет установить вторичное загрязнение продукта. В этом случае небольшие кусочки пищевых продуктов засевают непосредственно, при этом поверхность пробы не обжигают раскаленным шпателем или ножом, т. к. это может привести к уничтожению патогенной флоры.

Навеска продукта должна быть не менее 25-30 г.

Стерильно взятую навеску продукта плотной консистенции перед посевом гомогенизируют с небольшим количеством 0,1% пептонной воды или питательной среды (в соотношении от 1:2 до 1:5, в зависимости от консистенции исследуемого продукта). Для получения однородного гомогенизированного посевного материала необходимо пользоваться гомогенизатором. При отсутствии гомогенизатора навеску продукта нарезают мелкими кусочками, помещают в стерильную банку, добавляют необходимое количество 0,1% пептонной воды и подвергают встряхиванию в течение 10-15 минут в аппарате для встряхивания.

Крем, масло сливочное, мороженое и т.п. перед посевом подвергают расплавлению. Для этого навеску в количестве 25-30 г отбирают в стерильную стеклянную банку и помещают либо в термостат при температуре 43⁰С, либо в водяную баню при той же температуре.

После расплавления производят посев, причем при посевах масла и сливочного крема необходимо использовать нижний слой.

Костный мозг перед посевом извлекают из трубчатых костей и эмульгируют в подогретом до 43⁰С физиологическом растворе.

Жидкие объекты (молоко, напитки, супы) засевают без предварительной обработки. Пищевые продукты, имеющие кислую реакцию, а также рвотные массы, перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором натрия гидрокарбоната (NaHCO₃) до рН 7,2-7,4. Реакцию среды проверяют по универсальной индикаторной или лакмусовой бумажке.

Невскрытые консервы в банках перед посевом осматривают, отмечают внешний вид, наличие бомбажа, ржавчины и т. п., затем обмывают теплой водой с мылом и проверяют на герметичность по ГОСТ 30425-97 «Консервы, методы определения промышленной стерильности». Непосредственно перед посевом банки протирают спиртом, а крышки обжигают.

Отбор проб воды производят согласно СТБ ГОСТ Р 51592-2001 «Вода. Общие требования к отбору проб», СТБ ГОСТ Р51593-2001 «Вода питьевая. Отбор проб», МУК РБ 11-10-1-2002. Выемку проб воды производят в количестве не менее 1 литра. При необходимости исследования воды из графинов, ее можно доставлять в лабораторию непосредственно в графинах. Пробы маркируют и сопровождают документом с указанием объема, места отбора, даты и времени отбора, фамилии специалиста отбиравшего пробу.

Техника взятия смывов описана в главе 15 настоящей Инструкции.

При взятии смывов в направлении записывается номер образца по порядку, место взятия смыва, с какого объекта взят смыв (оборудованиие. инвентарь, посуда и др.). При взятии смывов с рук записывается: номер образца по порядку, фамилия, имя, отчество обследуемого, выполняемая работа (профессия и участок работы).

Соскобы производят стерильным или прокаленным в пламени горелки ножом или скальпелем. Их собирают в стерильную банку или чашку Петри с небольшим количеством (2-3 мл) ИХН.

Необходимо отметить, что направление бактериологических исследований определяется клинической картиной заболевания и данными эпидемиологических расследований с учетом возможного выявления других, не приведенных в настоящей инструкции, возбудителей пищевых отравлений.
ГЛАВА 3

БАКТЕРИИ РОДА SALMONELLA

Сальмонеллы - прямые грамотрицательные палочки (0,7-1,5х2-5 мкм), подвижны (перитрихи), факультативные анаэробы, хемоорганотрофы.

Сальмонеллы - оксидазонегативные, каталазопозитивные, индол и Фогес-Проскауэра негативные, метиловый красный и цитрат позитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину. Биохимические свойства бактерий рода Salmonellа согласно приложению 1 к настоящей Инструкции.

Основным резервуаром сальмонелл и источником инфекции являются животные (свиньи, крупный и мелкий рогатый скот и др.) и птицы (куры, гуси, утки и др.). Механизм заражения – фекально-оральный, ведущий путь передачи – пищевой: факторами передачи являются яйца птиц, мясо животных и птиц. Наибольшую опасность представляют продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке, и особенно, если они длительно хранятся при комнатной температуре. Даже при интенсивном размножении сальмонелл в пищевых продуктах, они не изменяют ни вкуса, ни запаха, ни их внешнего вида.

Сальмонеллы долго сохраняют жизнеспособность во внешней среде: в воде открытых водоемов и питьевой воде они переживают от 11 до 120 дней, в морской воде - от 15 до 27 дней, в почве - от 1 до 9 месяцев, в комнатной пыли – от 80 дней до 18 месяцев, в колбасных изделиях – от 60 до 130 дней, в замороженном мясе - от 6 до 13 месяцев, в яйцах - до 13 месяцев, в яичном порошке от 3 до 9 месяцев, в замороженных овощах и фруктах - 0,5-2,5 месяца. Границы температурного режима для роста сальмонелл находятся между + 7⁰С и + 45⁰С, оптимальной температурой для роста сальмонелл является +37⁰С. Они могут расти при значениях рН не ниже 4,1 и не выше 9,0, оптимальная рН для роста 6,5-7,5. Сальмонеллы чувствительны к воздействию высоких температур, при +57⁰С (в жидкой среде) большинство из них погибают в течение 1-3 мин, кипячение убивает мгновенно.

Сальмонеллы вида S.еnteriсa обозначаются следующими символами: I – или название серовара для сероваров вида S. еnteriсa подвида еnteriсa. Для представителей других подвидов вида S. еnteriсa введены следующие обозначения: II - для сероваров S.еnteriсa subsp. Salamae; IIIа - для сероваров S. еnteriсa subsp. Аrizonae; IIIb - для сероваров S. еnteriсa subsp. Diarizonae; IV - для сероваров S. еnteriсa subsp. Houtenae; VI - для сероваров S. еnteriсa subsp. Indiсa; V - Вид S. bongori – для 21 серовара S. bongori subsp. bongori. Деление на подвиды имеет определенное эпидемиологическое значение, так как основным естественным резервуаром сальмонелл подвида I служат теплокровные животные, для представителей остальных подвидов (II, IIIа, IIIb, IV, VI) и вида S. bongori (V) – холоднокровные животные и окружающая среда. Число сероваров сальмонелл, входящих в каждый подвид: S. еnteriсa subsp. Еnteriсa 1478 (59,1%), S. еnteriсa subsp. Salamae 498 (19,9%), S.еnteriсa subsp. Аrizonae 94 (3,8%), S. еnteriсa subsp. Diarizonae 327 (13,1%), S.еnteriсa subsp. Houtenae 71 (2,8%), S.еnteriсa subsp. Indiсa 12 (0,5%), S.bongori subsp. Bongori 21 (0,8%).

Определение и название подвидов не является обязательными в клинической микробиологической практике. Необходимым для идентификации является только название серовара подвида Еnteriсa.

Серовары других подвидов вида S.еnteriсa и вида S.bongori обозначаются № подвида и их антигенной формулой II – О 1,6,14 Н z₁₀, е, n, x, z₁₅. Это значит, что штамм с такой антигенной характеристикой относится к виду Еnteriсa subsp. Salamae. Подвиды включают около 2500 сероваров (серотипов) сальмонелл. Сокращенное название сероваров пишется с заглавной буквы, например: S.typhi (вместо – “Salmonella enterica subs. enterica serovar Typhi”).

Антигенная структура сальмонелл:

термостабильные О-антигены, сохраняющиеся при кипячении культуры в течение 2-5 часов, расположены на поверхности тела клетки, представляют собой липополисахаридно-пептидные комплексы. Серовары сальмонелл, имеющие общий компонент О-антигена, объединены в одну группу. Таких групп по Кауфману-Уайту насчитывается около 70;

термолабильные Н-антигены, жгутиковые, имеют белковую природу, разрушаются нагреванием при температуре 75-100⁰С. Состав Н–антигенов обуславливает разделение сальмонелл на серовары. Выделяют антигены I (специфические) фазы и II (не специфические) фазы. Сальмонеллы, в которых Н-антигены представлены двумя фазами называют двухфазными (в отличие от монофазных, имеющих антигенные факторы только I фазы);

одним из компонентов О-антигена является Vi-антиген. Vi-антиген - соматический антиген, принадлежащий к группе К-антигенов. Исследователи, впервые открывшие его у S.typhi назвали его «антиген вирулентности», считая что этот антиген обуславливает вирулентность возбудителей брюшного тифа, теперь доказано, что он не является прямым носителем вирулентности микроба и обнаружен у других серологических типов сальмонелл - S.typhi, S.paratyphi С, S.dublin. Структурно Vi-антиген представляет собой полимер N-ацетиламино-гексуроновой кислоты. Присутствие его на поверхности тела бактерий препятствует агглютинабельности их в О-сыворотке, т.е. делает бактерии «О-инагглютинабельными»

термолабильный поверхностный К-антиген;

М-антиген (слизистый) обнаружен у слизистых штамов S. paratyphi В, S. dublin и некоторых других.