Изучить устройство светооптического микроскопа Усвоить основные показатели микроскопа Усвоить правила работы с микроскопом

• 
  Изучить устройство светооптического микроскопа
  
• 
  Усвоить основные показатели микроскопа
  
• 
  Усвоить правила работы с микроскопом
  

Микроскоп – это оптический прибор, дающий увеличенное изображение объекта двумя самостоятельными оптическими системами – объективом и окуляром. Микроскоп состоит из оптической, механической частей и осветительной системы. К первой относятся объективы и окуляры. Механические части состоят из ножки (башмак), тубуса, предметного столика, штатива, включающего макро- и микровинты. К осветительной системе относятся зеркало и конденсор с диафрагмой.

Обычные биологические микроскопы (МБИ-I, МБР-I, БИОЛАМ и другие) в наборе имеют три объектива и столько же окуляров, в то время как у исследовательских число их намного больше. Увеличение объективов бывает 8, 40 и 90-кратным, а окуляров, соответственно 7, 10 15-кратным. Объективы являются важнейшими частями микроскопа, дающими увеличенное обратное действительное изображение. Объективы состоят из шлифованных стекол – линз. Последние в некоторой степени дают искажения изображения, которые называются абберациями. Они выражаются в появлении нечеткости и цветности изображения. Обычно различают три возможных вида абберации: хроматической, сферической и по кривизне поля зрения.

Хроматическая абберация появляется потому, что лучи белого света, проходя через линзу объектива, частично разлагаются на составные части. Поэтому получается частично цветное изображение объекта. Сферическая абберация появляются потому, что лучи света, падающие на различные поверхности линзы объектива, преломляются неодинаково и поэтому получается нечеткое изображение изучаемого объекта.

Кривизна поля зрения заключается в том, что центр и края поля зрения одновременно не получаются резкими из-за искривления поверхности изучаемого объекта.

Абберации в значительной степени устраняются при изготовлении объективов из нескольких линз, поэтому объективы особенно большого увеличения являются многолинзовыми системами.

Объективы современных микроскопов по качеству изображения, т.е. по степени устранения аббераций, подразделяются на несколько типов. Объективы ахроматы имеют простое устройство, частично лишены хроматической абберации по двум цветовым волнам и имеют остаточную окраску изображения. Они характеризуются вполне удовлетворительным качеством изображения и поэтому, используется для проведения повседневных работ. Объективы полуапохроматы или флюориты имеют меньше абберации, чем ахроматы. Самыми сложными и лучшими считаются объективы апохроматы, лишенные по существу хроматической абберации. Объективы полуапохроматы и апохроматы используются при проведении научно-исследовательских работ.

Вышеописанные объективы имеют существенный недостаток, который заключается в кривизне изображения, т.е. примерно от одной трети до половины радиуса поля зрения изображение становится размытым. Для устранения этого используются планахроматические и планапохроматические объективы. Они дают плоское изображение поля зрения. Поэтому изображение получается одинаковым на всем поле зрения. Такие объективы незаменимы для микрофотографирования изучаемых объектов.

Кроме того, объективы подразделяются на сухие и иммерсионные. В сухих – между объективом и изучаемым объектом находится воздушная среда. К ним относятся, в основном, объективы малого и среднего увеличения (8× и 40×).

В объективах большого увеличения – 60× (имеется в научно-исследовательских микроскопах) и 90× пространство между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняется иммерсионной средой – водой, водным раствором глицерина или кедровым маслом. Иммерсионные системы обладают большей преломляющей способностью лучей свет, чем воздушная среда и поэтому в объектив попадает больше лучей света.

Для научно-исследовательской работы часто используются объективы специального назначения: фазово-контрастные, эпиобъективы и другие.

Второй оптической системой микроскопа являются окуляры, которые увеличивают изображение, проецированные объективом. Наиболее простым и широко используемыми являются окуляры Гюйгенса. Они применяются с ахроматическими объективами.

Для работы с планахроматическими и апохроматическими объективами больших увеличений применяются компенсационные окуляры. Они более сложно устроенные и в значительной степени исправляют абберации и, тем самым, улучшают качество изображения. Кроме того, для специальных целей применяются фотоокуляры и гомали. Фотоокуляры служат для проецирования изображения на фоточувствительные материалы или же на экран.

Известно, что ахроматические и апохроматические объективы имеют значительную кривизну изображения. Гомали устраняют этот недостаток и поэтому могут быть использованы для фотографирования объекта. В то же время они до одной трети уменьшают поле зрения.

На объективах и окулярах имеются гравировки. С одной стороны обоймы объектива фигуры или написано «ЛОМО» (Ленинградское оптико-механическое объединение), здесь же указывается номер объектива. На противоположной стороне обоймы объектива указывается его увеличение, численная апертура, а иногда и максимально допустимая толщина покровного стекла (0,17мм). В объективах большого увеличения (90×) гравировано «МИ» (масляная иммерсия).

Кроме того, в объективах планахроматах, полуапохроматах и апохроматах гравированы слова «планахромат», «полуапохромат», и «апохромат». В окулярах обычно имеется гравировка увеличения, а в компенсационных буква «К».

На занятиях по самостоятельной работе студенты берут закрепленные за ними на ЛПЗ микроскопы. Каждый студент должен определить общее увеличение микроскопа и разрешающую способность его объективов. Для их определения необходимо знать численную апертуру объектива. Численная апертура – это произведение показателя преломления среды на половину апертурного угла и определяется по формуле:
А = n*sin

Где n – показатель преломления среды, находящегося между препаратом и фронтальной линзой объектива; u – половина апертурного угла. Он образуется коническим пучком света, попадающим в объектив из точки препаратов.

Показатель преломления сред различный:
N n_{воздуха} = 1,0, n_воды =1,33 и n_масла = 1,51
Таким образом, используя иммерсионные среды, можно увеличить апертуру объектива. В современных микроскопах апертуры определена и выгравированы на объективах. У объективов с увеличением 8 численная апертура равна 0,20 и соответственно 40=0,65, 90=1,25.

Человеческий глаз при нормальной остроте зрения на расстоянии наилучшего видения (250мм) способен различить две линии или точки, отстоящие друг от друга на расстоянии не меньше, чем на 0,08мм. Эта величина называется разрешающей способностью глаза.

Под разрешающей способностью микроскопа понимается то наименьшее расстояние между двумя деталями изучаемого объекта, когда они видны раздельно. Чем меньше это расстояние, тем выше разрешающая способность микроскопа.

Если изучаемый объект будет равным или большим разрешающей способности, то он будет виден в действительной форме, т.е. таким каким он является. Если же изучаемый объект будет меньше разрешающей способности, но не меньше ее половины, то он будет округлым независимо от его истинной формы, равным величине разрешающей способности. Если объект меньше половины разрешающей способности он не будет виден.

Разрешающая способность светооптического микроскопа определяется по формуле:
e = λ / -А,

где е – разрешающая способность объектива;

При работе со светооптическим микроскопом нужно учитывать полезное увеличение, которое не должно превышать тысячекратной численной апертуры (1000 А). Можно добиться увеличения, превышающего 1000 А, используя сильные окуляры. Однако при этом заметно ухудшается освещенность и качество изображения. В то же время иногда используется увеличение микроскопа превышающее 1000 А при микрофотографии, микропроекции и в целях измерения.

Задачей самостоятельной работы заключается в подробном изучении устройства и показателей микроскопа. Нужно уяснить, что означает гравировка на объективах и окулярах микроскопа. Используя настоящее пособие, в тетрадях для самостоятельной работы сделать краткие конспекты, определить общее увеличение микроскопа при разных объективах и окулярах по формуле:
β_м = β_об * β_ок
где β_м – общее увеличение микроскопа;

β_об – увеличение объектива;

β_ок – увеличение окуляра.
Задание:

• 
  Определить разрешающую способность разных объективов микроскопа
  
• 
  Полученные расчеты записать в тетрадь по самостоятельной работе.
  

Литература

1. 
   Александровская О.В., Радостина Т.Н., Козлов Н.А. Цитология, гистология и эмбриология, 1987. М.:Агропромиздат
   
2. 
   Иванов И.Ф., Ковальский П.А. – Цитология, гистология и эмбриология. М.: Колос. 1976
   
3. 
   Кацнельсон З.С., Рихтер И.Д. – Практикум по цитологии, гистологии и эмбриологии. Л.: Колос. 1976
   
4. 
   Меркулов Г.А. – Курс патологической техники. М.: Медицина, 1969
   
5. 
   Сиразиев Р.З., Игумнов Г.А., Цыдыпов Р.Ц. и др. Руководство к практическим занятиям по цитологии, гистологии и эмбриологии. – Улан-Удэ: Изд-во Бурятской ГСХА , 2006. – 152 с.
   

• 
  Изучить методы взятия материала и приготовления гистологических препаратов
  
• 
  Усвоить приемы и методы гистологической техники
  

Приемы и методы приготовления гистологических препаратов называются гистологической техникой. Она состоит из нескольких последовательных приемов:

1. 
   взятие материала;
   
2. 
   его фиксация;
   
3. 
   отмывания от фиксатора;
   
4. 
   замораживания или заключения в уплотняющие среды;
   
5. 
   приготовления срезов;
   
6. 
   их окрашивания;
   
7. 
   и их заключения.
   

1. 
   Взятие материала. Оно производится острым режущим инструментом от убитого животного или от трупа (не более 1 часа после смерти), иногда биопсией при жизни животных. Величина взятого кусочка не должна превышать 1 см³.
   
2. 
   Фиксация. Взятый кусочек помещается в фиксатор. При этом происходит быстрая коагуляция (осаждение, свертывание) белков. Однако, имеются фиксаторы, в которых происходит сильное обезвоживание коллоидов. При фиксации прекращаются процессы разложения, и тем самым, сохраняются в большей или меньшей степени прижизненные структуры материала. Наиболее часто в качестве фиксатора используется формалин, этиловый спирт, ацетон и другие вещества. Часто фиксаторы бывают сложного химического состава.
   
3. 
   Промывка. Извлечение (удаление) фиксатора. Кроме некоторых фиксаторов производится промывание сначала обычной (водопроводной), а затем дистиллированной водой.
   

4. 
   Обезвоживание и заключение в плотные среды. Для заключения в целлоидин или парафин материал проводят через спирты возрастающей концентрации для обезвоживания.
   

5. 
   Приготовление срезов из целлоидиновых и парафиновых блоков. Готовятся срезы с помощью особых приборов – микротомов.
   

При установке ножа нужно соблюдать угол резания, образуемый при пересечении верхней плоскости объекта с нижней стороной лезвия ножа. Считается наиболее лучшим угол резания около 15 градусов.

При гистохимических исследованиях иногда производится приготовление срезов из нефиксированной ткани для этой цели наиболее приемлемым является криостат. Он представляет холодильную установку с помещенным в ней микротомом. После включения прибора через 1-1,5 часа устанавливается автоматически поддерживаемая температура до 30ºС. При низкой температуре под контролем через иллюминатор готовятся замороженные срезы.

6. 
   Окрашивание срезов. Перед окрашиванием срезы подвергаются предварительной обработке в зависимости от фиксации и заключения материала.
   

Целлоидиновые срезы, полученные из блоков, хрнящихся в 70º спирте, помещают сначала в 50º спирт, а затем в воду.

Срезы из криостата сразу помещают на предметные стекла. Замороженные срезы, приготовленные на микротоме или замораживающем столике, сразу опускают в воду.

Окрашиванию подвергаются наклеенные на предметные стекла и ненаклеенные срезы. В первом случае для крашения используются биологические стаканчики, высокие бюксы и кюветы. Ненаклеенные срезы помещаются в низкие бюксы, часовые стекла. При этом перенос срезов производится с помощью стеклянных крючков.

При переносе срезов из одного раствора в другой нужно избегать загрязнения последующих реактивов. При переносе предметных стекол с наклеенными срезами надо давать возможность стекать жидкости, но не допуская их подсыхания. При окрашивании срезов необходимо чаще менять растворы, не допуская их загрязнения.

В гистологии применяется много различных красок. Они по химическому составу делятся на основные, кислые, нейтральные и индиферентные. Основные краски являются красящими основаниями и их солями. Гистологические структуры, окрашивающиеся основными красками называются базофильными. Кислые краски – это красящие кислоты и их соли. Гистологические структуры, окрашивающиеся кислыми красками называются оксофильными или ацидофильными.

Нейтральные краски – это солеобразные соединения, у которых анионы и катионы являются красящими радикалами. В нейтральных красках базофильные структуры окрашиваются основными компонентами красителя, а кислые – соответственно кислыми радикалами краски.

Индиферентные краски – это не красители, а окрашенные вещества. В гистологии они используются для окрашивания жировой ткани. Индиферентные краски (суданы разных марок) хорошо растворяются в жировой ткани и тем самым окрашивают ее.

Также красители делятся на субстактивные и аджективые. Первые окрашивают срезы без какой-либо дополнительной обработки, а вторые для окрашивания нуждаются в дополнительной обработке – протравливании. Протравами служат окислы двух – и трехвалентных металлов (железа, алюминия, хрома и других). При окрашивании протравы с красителями образуют хелатный комплекс (лак), который заметно отличается от взятого красителя. Протрава в отдельных случаях может превратить вещество в краситель. Так, например, гематоксилин в чистом виде почти не обладает красящими свойствами, так как его лаки становятся сильными красителями.

В гистологии применяются прогрессивные и регрессивные метод окрашивания. При прогрессивном методе срезы окрашивают до желательной интенсивности, когда все необходимые детали среза четко выявляются. При работе регрессивным методом срезы специально перекрашиваются, а затем избыток красителя извлекается соответствующими реактивами.

Самым распространенным классическим гистологическим методом является окрашивание гематоксилин – эозином.

Гематоксилин – экстракт кампшрого дерева. Имеется много рецептов приготовления гематоксилина. В нашей лаборатории часто применяются гематоксилины Каррачи, Гейденгайна и Вейгерта. Гематоксилин Каррачи имеет следующий химический состав:

1. 
   Вода дистиллированная – 400,0 мл
   
2. 
   Квасцы алюмо – калиевые – 25,0 г.
   
3. 
   Гематоксилин – кристаллический – 0,5 г.
   
4. 
   Глицерин – 100,0 мл.
   
5. 
   Йозноватокислый калий (КО₃) – 0,03 г.
   

1. 
   10% раствор железоаммиачных квасцов (кристаллы их должны быть только светло – фиолетового цвета).
   
2. 
   Растворяют 1,0 г гематоксилина в 10мл 96º спирта и затем добавляют 90мл дистиллированной воды.
   

Готовят два раствора:

1. 
   1,0г гематоксилина растворяют в 100мл 96º спирта. Раствор созревает на свету около месяца.
   
2. 
   Официальный раствор полуторахлористого железа 4,0мл, соляная кислота (удельный вес 1,15-1,17) 1,0мл, вода дистиллированная 95,0мл. Официальный раствор полуторахлористого железа представляет собой 50% водный раствор хлористого железа (FeCI₃ ˟ 6H₂O – желто-бурая масса).
   

Схема окрашивания гематоксилин – эозином прогрессивным методом.

1. 
   Срезы помещают в раствор гематоксилина (Карраччи и другие) на 3-5 минут.
   
2. 
   Срезы переносят в обычную воду до приготовления синеватого цвета. При этом ядра клеток, окрашенные в красновато-фиолетовый цвет в щелочной среде воды, приобретают сине-фиолетовый цвет. Синие ядра клеток становятся более контрастными. Затем срезы переносят в дистиллированную воду на 3-5 минут.
   
3. 
   Срезы помещают в 1% раствор эозина на 1-3 минуты.
   
4. 
   Отмывают краситель 1-2 и более минут дистиллированной водой.
   

Схема окрашивания гематоксилин – эозином регрессивным методом.

1. 
   Окраска срезов в растворе гематоксилина 2-5 минут.
   
2. 
   Промывка в дистиллированной воде 1-6 секунд.
   
3. 
   Срезы переносят в 0,5-1% раствор соляной кислоты на 70º спирте 3-30 секунд.
   

Метод окрашивания под ван Гизон дает много цветное окрашивание разных гистоструктур. Перед окраской растворы Вайгерта1 и 2 смешивают поровну. Получается густая темно-фиолетовая жидкость. Нужно иметь в виду, что в готовом виде краска быстро портится из-за наличия сильных окислителей.

Вторую краску – опикрофуксин готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1% водного раствора кислого фуксина.

Берут 100,0 мл пикриновой кислоты и смешивают с 10 мл фуксина. Образуется стойкая смесь гранатового цвета, сохраняющаяся месяцами.

1. 
   Срезы окрашиваются в гематоксилине Вейгерта в течение 3-5 минут.
   
2. 
   Срезы быстро ополаскивают в 2 порциях обычной воды.
   
3. 
   окрашивают пикрофуксином 1-3 минуты.
   
4. 
   Срезы быстро ополаскивают в обычной воды.
   

Прежде чем приступить к приготовлению гистологических препаратов, студенты, пользуясь учебным пособием, на тетрадях делают краткие конспекты. Они делятся на 3 подгруппы. Первая подгруппа готовит замороженные, вторая – целлоидиновые и третья – парафиновые срезы. Срезы окрашивают гематоксилин – эозином прогрессивным и регрессивными методами, а также по ван Гизон и готовят гистологические препараты. Только вполне удовлетворительного приготовления препараты могут служить критерием зачета занятия.

• 
  Ознакомиться с клеточными включениями
  
• 
  Научиться определять эти структуры по микроскопом
  
• 
  Уметь дать определение этим включениям
  

Для гистохимического выявления гликогена применяется реакция Шиффа с фуксинсернистой кислотой после окисления периодатами натрия или калия. Метод основан на окислительном расщеплении 1,2 – гликоля гликогена на альдегиды. Контролем реакции является предварительная обработка материала в амилазе слюны.

Для определения нуклеиновых кислот в качестве фиксатора обычно используется жидкость (смесь) Карнуа. Окрашивание срезов производится методами Браше и Эйнарсона. При использовании метода Браше срезы обрабатываются двумя основными красителями метиловым зеленым и пиронином. При этом метиловый зеленый окрашивает ДНК, локализованные в хроматиде ядра, а пиронин соединяется с РНК, находящейся как в ядре, так и в цитоплазме. Таким образом, одновременно окрашиваются обе нуклеиновые кислоты.

При использовании метода Эйнарсона (1951) красителем является галлоцианин, который взаимодействуя с хромовокалиевыми квасцами, образует краплак-катион. При низших значениях среды (рН=0,8-1,75) краситель связывается с нуклеиновыми кислотами. Эта реакция считается высокоспецифичной и поэтому применяется для количественного анализа нуклеиновых кислот. Основным недостатком метода является невозможность визуальной дифференцировки ДНК и РНК.

Для выявления белков, содержащих три важнейших аминокислоты – тирозин, триптофан, гистидин применяется метод тетразониевого азосочетания по Даниели (1947). Он основан на двух реакциях, следующих одна за другой. Первая реакция азосочетания происходит между тетразосоединением и аминокислотами. Затем свободная диазогруппа реагирует амино- и оксигруппами. В результате получается окраска серо-голубого цвета разной интенсивности.

В гистохимии белков можно применять метод сулема – бромфеноловый синий. Он был предложен Деррамом (1950) для определения белка при хромотографии на бумаге. В настоящее время его модификация используется для гистохимического выявления общего белка. Установлено, что на препаратах количество связанного красителя пропорционально количеству белка в соответствии с законом Ламберта – Бера.

Печень имеет дольчатое строение. В центре дольки имеется центральная вена, от которой радиальными тяжами направляются печеночные балки, состоящие из печеночных клеток – гепатоцитов. Они имеют многогранную форму и иногда двухядерные. Надо просмотреть гепатоциты, в которых находятся включения гликогена. Они в виде глыбок различной величины находятся в цитоплазме гепатоцитов. Иногда гликоген располагается на одном полюсе клеток, особенно выраженные на краях препарата.

Препарат окрашен по Браше. В спинномозговых узлах находятся чувствительные нервные клетки различной величины: крупные, средние и мелкие. Они окружены глиальными клетками – сателлитами. Хроматин ядра нейронов и сателлитов, содержащий ДНК окрашивается в сине-зеленый цвет. В ядрышках и хроматофильном веществе нервных клеток много пиронинофильной РНК, окрашенной в малиново-красный цвет.

Спинной мозг состоит из белого и серого вещества. Белое вещество находится по периферии, а серое – в центральной части органа. Серое вещество имеет вид бабочки или буквы Н и образует парные вентральные, дорсальные и боковые рога. В белом веществе проходят нервные волокна в продольном направлении, образуя проводящие пути. В сером веществе обнаруживаются нервные клетки.

Крупные мультиполярные мотонейроны находятся в вентральных рогах. В них в виде зерен или глыбок, а иногда диффузно выявляются белковые включения.

Препарат 4. Включения липидов в клетках коры надпочечников. Препарат окрашен Суданом. В надпочечнике различают корковое и мозговое вещества. В корковом веществе в цитоплазме эндокриноцитов содержатся включения липидов в виде мелких капелек.

Препарат 5. Жировые клетки в языке кролика.

Препарат окрашен гематоксилин – эозином. Материал при заключении проведен через сильные жирорастворители (спирт, ксилол, хлороформ). В препарате между мышечными волокнами находятся жировые клетки – липоциты. В них жир растворяется, поэтому клетки имеют крупные вакуоли (пустоты). Жировые клетки имеют относительно крупные, по периферии их располагается тонкая прослойка цитоплазмы. Там, где находится интенсивно окрашенное ядро, образуется небольшой бугорок. На препарате жировые клетки становятся похожими на перстень.

• 
  Найти, рассмотреть и обозначить распределение этих включений в фотоальбом;
  
• 
  Ознакомиться с электронограммами включений в фотоальбоме.