Лабораторияда жұмыс iстеудi техника. Қоректендiргiш орталар үшiн жатырлық ерiтiндiлердiң даярлауы. Қоректік орта дайындау

Шоғырланған жасушалар мен ұлпаларды өсіруге арналған қоректік орталарда өсімдіктерге қажетті барлық макроэлементтер, дәрумендер, көмірсулар, фитогормондар болуы тиіс. Кейбір қоректік орталарда гидролизат казеині мен белгілі бір аминқышқылдар болады. Осыдан басқа қорктік орталардың құрамына ЭДТА (этилендиаминтетрасірке қышқылы) немесе оның натрий тұзы жасушаларға темірді жеткізуге белгілі бір рН болады. Шоғырланған ұлпалар мен жасушаларды өсіру кезінде қоректік орталарда қажетті компоненттің бірі көмірсулар болып саналады, себебі олар автотрофты қоректенуге қабілетсіз болады. Әдетте көмірсулар көзі ретінде сахароза немесе глюкозаны 20 – 40 г/л концентрациясында қолданады. Жасушалар дифференциясы және жасушалық бөліну индукциялары үшін өсу реттеушілер қажет. Сондықтан да калустық ұлпаларды алу үшін қоректік орталардың құрамына жасушаның дедифференцировканы тудыратын аусиндер мен цитокиндер кіруі керек.

Әдетте қоректік орталарда ауксиндердің көзі ретінде 2,4 дихлрфиноксисірке қышқылын (2,4-Д), 1 – 10 мг/л; индолилсірке қышқылын (ИСҚ) (ИУК) 1 – 30мг/л және нафтилсірке қышқылын (НСҚ) – 0,1 – 2 мг/лпайдалынады (ИСҚ) 2,4 Д қарағанда 30 есе аздау болады. Каллус пайда болу индукциясына әдетте ауксиндердің жоғары концентрациясын пайдаланады, ал кейінгі көшіріліп отырғызу кезінде ұлпа өседі де ортадағы ауксиндердің құрамы бірнеше есе азайтлады.

Жасанды қоректіе қоспаларда цитокиндердің көзі ретінде кинетин 6 – бензилалинопурин (6-БАП),зеатин (0,001 – 10 мг/л) кинетинге қарағанда зеатин мен БАП шоғырланған ұлпалардың өсуін және органогенез индукциясын реттеуде белсендірек болады. Кейбір қорктік қоспалардың құрамына аденин кіреді.

Жеке қоректік орталарда ауксин мен цитокиндерден басқа гибберел қышқылы да (ГҚ) болады. Кейбір жағдайларда қорктік орталарға өсімдік экстрактылары мен шырындарын қосады. Өсуін ең белсендіргіш қасиеттке кокос мен сұйық кокос жаңғағының сұйық эндоспермі ие

Қатты қоректік орталарды дайындау үшін теңіз балдырлардан алатын агар – агар полисарид пайдалынады. Әдетте қатты қоректік қоспаны алу үшін ортаға 5 – 8 % қосады.

Макротұздардың микротұздардың және дәрумендердің ерітінділерін концентрленген түрде дайындау ыңғайлы. Маточный ерітінділерді тоңазытқышта, ал дәрумендерді теріс температурада сақтау керек.

Макротұздардың ерітінділерін 10 – 20 есе концентірленген, микротұздардың 100 – 1000 есе болса, ал дәрумендердің ерітінділері 1000 есе концентрленген болып дайындау керек.

Жасушаларды, ұлпаларды және өсімдіктердің белгілі бір мүшелерін өсіру үшін қоректік орталардың әр түрлі құрамын қолданады.

1, 2 кестедегі Мурасиге – Скуганың 3,4 .

Тұқымдар, түйнектер, бұталар, өсімдік сабақтары. 500 – 700 мл-лік химиялық стакандар, 1 литрлік колбадағы тазартылған дистилленген су, скальпелдер, пинцеттер, инелер, заттық шынылар, стерилизаторлар, пробиркалар, қоректік ортасы бар шыны ыдыстар, суық зарасыздандыруға арналған «Миллипор» немесе Зейц фильтерлары. Автоклав, сушильдік шкаф.

Тұқымдарды, өсімдіктің кез келген жерінен алынған ұлпаларды залалсыздандыру үшін алуан түрлі залалсыздандырғаш ерітінділерді қолданады: сулеманың сулы ерітінділерін немесе 2 хлор сынап (0,1%), (1%) бром, пергидроль (20-30%), хлорамин (3-6%), диацид, гипохлорит натрийі (10%).

Зертханалық жұмысты орындау тәртібі мен мазмұны

Ламинар – бокс. Ламинардың жұмыс кеңестігін 70 % - ды спиртпен сүрту керек. Содан кейін ламинарға спирттік горелканы, сіріңкелерді, 96 % - ды спирті бар ыдыс, зарасыздандырылған су мен инструменттер, зарасыздандырылған суы бар колба. Меристеманы бөліп алу жұмысы кезінде ланинарға бинокулярлы үлкейіткіш әйнек қояды.Ламинар боксты бактеридцидты ультрокүлгін лампалармен 10 – 12 сағат бойы сәулелендіреді.

Автоклафта қысым арқылы қатал зарасыздандыру өткізуге болады, себебі ылғалды ыстық микроорганизмдер мен олардың спораларын құрғақ ыстыққа қарағанда тиімдірек өлтіреді. Автоклавтан қақпағы бар стакандар, Петри ыдыстары, пипеткалар, тазартылған суы бар колбалар сияқты заттар өткізуге болады. Ыдыстарды фольгаға немесе қаптама қағазға орап, 2 атм автоклавтан 25 – 30 минут бойы өткізеді. Пипеткалардың жоғарғы бөлігін мақтамен жауып, пипеткаларды 10 данаман қағазға орайды.

1. Биотехнология зертханасында жұмыс істейтін барлық студенттер қауіпсіздік техника ережелерімен танысу керек.

2. Ыдыстарды детергент ерінділерде мұқият жуу (кір жуу ұнтағы,сабынды су).

3. Детергенттерден 8 – 10 рет жуу

4. Хромпикке 4 – 6 сағатқа салып, 10 рет жылы сумен жуып, одан кейін 5 дистелденген сумен рет шайып алу.

5. Таза ыдысты 2 сағат бойы 130-170°С кептіргіш шкафқа (сушильный шкаф) қояды.

6. Металл құрал – саймандарды өте тығыз орап қағазға салып, 170-200°С температурада 2 сағат бойы құрғақ ыстықпен заласыздандырады.

7. Құрғақ ыдыстарды, құрал заттарды целлофан немесе қағазға орап зертханалық сүрмелерде сақталуы тиіс.

8. Мурасиге-Скуга қоректік орта үшін маточный ерітіндіні дайындау. Ең алдымен макро-, микроэлементтердің және дәрумендерді маточный ерітінділерін жасау тиіс. Мурасиге және Скуга орталарға мынадай құрамды маточный ерітіндін жасаймыз: - NH₄NO₃, KNO₃, KH₂PO₄, MgSO₄ ^.7H₂O (MgSO₄ ^. 7H₂O соңғы құяды қыздырусыз соңғы құяды ол тұмбаның түсуін алдын алады.

- CaCl₂ ерітіндісі;

- темір хелат ерітіндісі ( FeSO₄ ерітіндісі және ЭДТА-Na₂, темір хелат түзілу үшін қайнағанша қыздыру керек.);

- микроэлементтер ерітнділері

Маточный ерітіндіні дайындау үшін тұз мөлшерін, сонымен қатар қоректік ортаны дайындау үшін қажетті маточный ерітіндінің мөлшерін келтірілген 1 таблицада көруге болады.

Алған ерітінділерді шыны ыдыстарда жабылатын пробкасы және этикеткасы бар тоңазытқыштарда сақтайды. Темір хелатын қараңғы шыныда сақтайды.

Концентірленген дәрумендер ерітінділерін флакондарда тоңазытқыштарда сақтайды. 1 мл бұл ерітіндіде 1 литр Мурасиге – Скуганың ерітіндіге қажетті мөлшерде дәрумен болады.

9. 
   Макро- және микроэлементтер, витаминдер, өсу реттеуіштерінің маточный ерітінділерін дайындау.
   
10. 
    1л орта дайындау үшін 1л стаканға, бастапқы ерітінділерден пипеткамен керекті мөлшерлері тасымалданады.
    
11. 
    Біраз мөлшер дистилденген суда (әрбіреуін) мезоинозит, глицин, сахарозаны еріту және маточный ерітіндісі бар стаканға енгізу.
    
12. 
    Стаканнан сұйық қоректік ортаны алып өлшеуіш цилиндрге құю және дистилденген сумен 950мл мөлшерге жеткізу.
    
13. 
    Ортаның pH деңгейін келтіру. Егер pH жоғары болса, онда 1H HCl бірнеше тамшысын қосады. Егер төмен болса – өлшеуіш цилиндрге 1H NaOH(KOH) бірнеше тамы қосып, жақсылап араластыру. Ортаның біраз мөлшерін стаканға құйып, керекті өлшемге келтіру үшін pH ортаны өлшеу.
    
14. 
    Пластиналы агарды (6-7г) ортасы бар стаканда үнемі араластырып плиткада қыздыру (қайнатпай) арқылы еріту.
    
15. 
    Қоректік ортаны 50-60⁰C қыздыру, ыстық агар ерітіндісін қосу. Ұнтақ тектес агарды тікелей қосуғаболады.
    
16. 
    Орта мөлшерін 1л-ге жылытылған дистилденген сумен араластыру арқылы жеткізу.
    
17. 
    Дайын қоректік ортаны 1/4 мөлшерінде пробиркаларға құйып, мақта немесе фальга тығындарымен жабу.пробиркаларды металл штативтерге орналастыру.
    
18. 
    
    
19. 
    
    
20. 
    
    
21. 
    Штативтерді автоклавқа орналастырып, 15 мин 0,7-1атм қысыммен автоклавтау
    

Таблица 1 - Мурасиге – Скуга бойынша маточный ерітінділердің құрамы 1 кесте

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.

Бақылау сұрақтары :

1. Залалсыздандыру дегеніміз не?

2. Ыдыстарды, құрал – саймандарды қалай залалсыздандырады?

3. Өсімдік объектілерін қандай әдістермен залалсыздандырады

4. Жекелеген жасушалар мен ұлпаларда қоректік орталардың құрамы қандай?

5. Қоректік орталарда ауксиедер ретінде қандай заттар қолданады?

6. Маткалық ерітінділер дегеніміз не және оларды қалай дайындайды?
№ 2 зертханалық жұмыс - Пісіп жетілмеген ұрықтың каллустық ұлпаларын алу. Каллустарды субкультивирлеу
Жұмыстың мақсаты. Пісіп жетілмеген ұрықтың каллустық ұлпаларын алу. Каллустарды субкультивирлеу

Теориялық дәлелдеу .Өндіру циклінде каллус клеткалары бөліну үрдісінен кейін қарапайым онтогенезден өтеді: созылмалы түрде өседі, дифференциалданады және деградатацияланады. Каллустың өсу бойы ішкі жағынан қарағанда қисық тәрізді көріністі көрсетеді. Өсу циклі эксплантты ортаға отырғызудан басталады (культивирлеу бастамасы), ал керісінше митоз тоқтағанда аяқталады (стационарлық фаза).

Лакфазада клеткалар бөлінбейді, өлшемі бойынша үлкеймейді, тек төменгі метаболиттік активтілікті қажет етеді. Экспоненциалдық фазада клеткалар митозбен белсенді бөлінеді. Бастапқы ерте кезеңде экспонентте митохондрия мөлшері көбейеді ( АТФ синтезі), рибосомалар, РНҚ-ның барлық түрі, ақуыздар синтезделеді, метаболизм активтенеді. Ал стационарлық фазада клеткалар өлшемі көбейе беріп жалғасады, бірақ олардың бөлінуі тоқтатылады.Әрі стационарлық фазада, тым кешіректеу кезеңінде клеткалар қартайып, өлуге әкеліп соғады.

Каллус клеткаларының өсу циклінің ұзақтығы 21-28 күн. Культивирлеу поцесінде каллусты жаңа қоректік ортаға әрбір 4-6 апта сайын отырғызады. Трасплант массасы 60-100 мг-нан 20-40 мл ортаны құрайды

Материалдар мен құрал-жабдықтар

Пісіп жетілмеген бидай ұрығы, стерилденген өсімдігі бар пробиркалар,

Мурасиге-Скуг ортасы, 2,4-Д, 6 %-дық хлорамин ерітіндісі, этил спирті, пробиркалар, препаровальдық инелер, пинцеттер, скальпелдер.

Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі

1. Пісіп жетілмеген дәнді-дақылдарды 6 %-дық хлорамин ерітіндісіне 5 мин. қою.

2. Стерильдік дистилденген сумен 3 рет шаю.

3. Стерилденген дәнді-дақылдарды стерильдік Петри тостағаншасына салып қою.

4. Препаровальдық инемен ұрықты вычленить және 4 мг/л 2,4-Д қосымшасы бар Мурасиге-Скугтың қоректік орталарын пробиркаға көшіру. Қараңғы жерде каллустардың шығуына дейін 25-27 ⁰С температурада инкубациялау.

5. Ұрығы бар пробиркаларды тығынмен жауып, штативке қою.

6. Бидай өсімдігі бар пробиркаларды стерильдік Петри тостағаншасына ақтару, содан 5-10 мм аралық өлшеммен кесіп алу.

7. Концентрациясы 4 мг/л болатын, құрамында 2,4-Д бар Мурасиге-Скугтың қоректік орталарына экспланттарды көшіру. Каллустардың жетілуіне дейін қараңғы жерде 25-27 ⁰С температурада инкубациялау.

8. Каллустық клеткаларды микроскопта қарастырып, морфологиясын сипаттау.

Зертханалық жұмыстың есеп беру талаптары

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.

Бақылау сұрақтары :

1. Каллусты культивирлеудің негізгі тәсілдерін атаңыз?

2. Дедифференциация және пролиферация клеткалары дегеніміз не?

3. Каллустың өсу циклінің негізгі фазасы немен сипатталады?

4. Әр түрлі өсімдік түрлерінің каллустары морфологиясы бойынша ерекшеленеді ме?

№ 3 зертханалық жұмыс Өсімдіктердің клондық микрокөбеюі және сауықтырылған отығызу материалын алу. Өсімдіктерді клондық микрокөбейту. In vitro жағдайында стахис өсінділерін қалемшелеу

Вегететивті көбеюге қарағанда микроклонды көбейтудің ерекшеліктері:

• 
  Бастапқы материалдан көптеген өсімдік алу
  
• 
  Пайдалы қасиетке ие өсімдікті in vitro өсіріп алу
  
• 
  Вируссыз отығызу материалын алу
  
• 
  Көбейтуді сезонға тәуелсіз, жыл бойы жүргізе алу
  
• 
  Вегетативті қиын көбейтетін не мүлде көбейе алмайтын өсімдікті өсіру, мысалы пальма.
  

1. 
   Асептикалық культураны индукциялау;
   
2. 
   Қолтық бүрщік дамуын индукциялау;
   
3. 
   Қалыптасқан in vitro өсімдікті ашық топыраққа отырғызуға дайындау.
   

Микроклондық көбейту жылдамдығы өсімдік түріне және бір бүршіктен милиондаған өсімдік алуға негізделеді.

Микроклонды көбейту процесіне әсер етуші ең негізгі фактор алынатын өсімдік генотипіне, оның физиологиялық жағдайына, қоректік орта құрамына жіне кукльтивирлеу шарттарына байланысты болады.

Негізгі материал ретінде жоғарғы және қолтық меристемалары, жас жапырақтар, гүлшоғыр және гүл элементтері, баданалар бола алады. Ең тиімді сәйкес материал ретінде сау және белсенді өсіп жатқан апикальды және қолтық бүршіктері болып табылады.

Прибордағы өсімдіктерді микроклонды көбейту кезңнде қалемшелеу арқылы жүзеге асырады. Мұндай көбейту апикальды басымдылықты бәсеңдету және өркеннің жоғары бөлігін жою кезінде қолтық меристемасының белсенділігін арттыру үшін қажет. Қолтық бүршіктері бар сабақ кесінділерін лайықты ортада өсіріп өркен алуға болады, оны құрамы басқа ортада тамырландырып бүтін өсімдік шығарады. 5-6 жапырақ пайда болған өсімдікті стерильді жағдайда пробиркадан алып кеседі. Қалемшелерді гормонсыз немесе ауксиндер қосылған қоректік ортада белгілі тереңдікте отырғызады.

Қалемшелермен меристемаларды бірдей жағдайда культивирлейді: күндіз 20-24⁰С түнде 19-20 ⁰С, жарықтығы 5-6 және фотопериод ұзақтыы 16 сағат.

Сабақ пен тамырдың өсуі қоректік ортаға отырғызылғаннан кейін 3-4 күннен кейін басталады, ал толық өсімдік 12-15 күнде қалыптасады. Келесі қалемгелеу мерзімі 20 күннен кейін іске асырылады.

Бір өсімдіктен 5-8 қалемше, ал 2-3 айдан кейін 3-5 мың қалемше алуға болады.

Өсімдіктің төменгі жақ бөлігін ИФД-ға қолданады. Вируспен зақымдалған бөлігін бракқа шығарып, сауларын мериклондауға береді.

Бүршік пен қалемшелерді цитокенинді ортаға отырғызады. Қоректік ортадағы цитокениндер жанама бүршіктердің жандануына әсер етеді және толып жатқан қолтық өркендерінің дамуына әкеледі. Алынған өркендерді жеке-жеке бөліп алып тамырландырады не әрі қарай дамытады.

Қоректік орта ретінде көп жағдайда Мурасиге Скуга ортасын пайдаланады. Дегенмен кейбір өсімдік түрлері ерекше орта түрлерін қажет етеді. Культивирлеуді қатты және сұйық қоректік орталарда жүргізуге болады.

Негізігі ұлпаны өсіру шарттарына байланысты( қоректік орта құрамы, температура, жарық түсімі) эксплант не каллустан қолтық бүршіктерін дамытуға, сабақ дамуын жүзеге асыруға болады.

In vitro жағдайында өркен алу үшін эксплант ретінде жоғары және қолтық бүршіктер қолданылады. Сонымен қатар апикальды меристеманы пайдалану ауқымды қолданысқа ие. «Апикальды меристема» және «сабақтық апекс» терминдерін ажырата білу керек, апикальды меристема сабақтық апекстің бір бөлігі болып табылады. Жұмыстардағы кейбір қиындықтарға қарамастан апикальды меристема культуралары сауықтырылған отырғызу материалын алуда кеңінен қолданылады. Апекстерді культивирлеу кезінде вирустың өсуі тежеледі, ол өткізгіш жүйенің жоқ болуымен сипатталады. Негізінде қоректік ортаға меристеманың азғантай бқлігін отырғызады, меристема бөлігі 0,5ммге дейін болады.

Жалпы заңдылық мындай: меристема көлемі аз болған сайын вируссыз өсімдік алу мүмкіндігі де жоғары.

Биотехнология сауықтырылған отырғызу материалын бүкіл ауыл шаруашылық өсімдіктерінен алуға мүмкіндік туғызып отыр. Қазіргі кезде вируссыз картоп алу технологиясы неғұрлым терең зерттелген болып отыр. Алғашқа өнім алу және отырғызыланатын картоп материалын сауықтыру келесі этаптардан құралады: апикальды меристеманы анықтауға картоп түйнектерін дайындау, апикальды меристеманы анықтау, меристемадан өсімдікті регенерациялау, өсімдік-рецепиенттерді қорғалған топырақта бейімдеу, ашық топырақтағы вируссыз картоп материалынан алынған өнімді анықтау, тұқым енгізудің алғашқы кезеңінде вируссыз отырғызу материалын өсіру, сорт түрлерін сақтап қалу.

Ұлпа культурасында жоғарғы және қолтық бүршік апекстері қолданылады. Өсуге түйнек метаболиті әсер етпес үшін және негізгі материалдың регенерациялануын арттыру үшін түйнектің ортаңғы бөлігінен паренхима қабатымен қоса көзшелер кесіп алады(1,5см). Көзшелерді алдын ала құрғақ ыстықпен өңделген топырақта өсіреді. Этилирленген өскіндерді 25+2⁰С температурада қараңғыда өсіреді. Ауа ылғалдығы 70-80%. Топырақты күніне екі рет ылғалдандырады, 7-10 күннен кейін Кноп ерітіндісімен жемдейді.

Апикальды меристемаларды 10-12 ажыратады. Ажыратылған меристемаларды асептикалық жағдайда макро- микротұздарға бай, цитокенинің жоғары концентрациясы бар ортада культивирлейді. Культивирленген бөлмедетемператураны 25⁰С температурада ұстайды, жарық 5, фотопериод 16 сағат.

Орташа алғанда өскіндердің қалыптасуына, 5-6 жапырақ пайда болғанға дейін, 30-45 күн кейбір жағдайларда 2-8 ай уақыт кетеді. Орталарды уақыт өтумен жаңартып отырады, өскіндерді периодты түрде стерильді жағдайда жаңа орталарға көшіреді.

Қалемшелеу арқылы алынған өсімдік өсуін жылдамдату үшін оларды жаңа қоректік ортаға ауыстырып отыру қажет. Қалемшелер аралас қоректік ортада тез тамырланады( Мурасиге Скуга ортасы мен Уайт қоретік ортасы) немесе ауксинге бай орталарда-ИУК, ПУК, ИМК.

Пробиркада қалыптасқан өскіндерді қалыпты жағдайға бейімдеуге болатын тамырланған өсімдік ретінде қарастыруға болады. Мұндай өсімдіктерді топыраққа тамыры жеткілікті түрде жетілгенде және 5-6 жапырақ қалыптасқан кезінде отырғызған жөн. Дегенмен әртүрге жататын өсімдіктер қоретік орта өзгерісіне түрлі бейімделеді. Әр өсімдік түрін эксперимент ретінде топыраққа бейімделуін бақылап барып, отырғызу керек.

Стахис өсінділері, Мурасиге –Скуг ортасы, ИУК, этил спирті, хлорамин, дистилденген су, термостат, пинцет, скальпель, Эрленмейер колбасы(250мл), пробирка, мембраналы фильтр.

1. 
   Жоғарыда көрсетілгендей қоректік орта мен өсімді материалды стерилдеу.
   
2. 
   Стеррилденген стахис өсінділерін 2-4 смден бірнеше жапырақтары бар бөліктерге бөлу.
   
3. 
   Қатты Мурасиге-Скуга қоректік ортасына Эрленмейер пробиркасына не колбасына отырғызады. Культивирлеудің 1 этабында зақымджанудың алдын алу үшін ортаға антибиотиктер енгізуге болады. Мысалы, канамецин. Антибиотик ерітіндісін алдын ала мембраналы фильтрден өткізіп, 40⁰С температурага дейін салқындатылған ортаға енгізеді.
   
4. 
   Культивирлеу жарықта 20-25⁰С температурада 12 сағат фотопериодта жүргізеді.
   
5. 
   Культивирлеуден 2-3 аптадан соң микроқалемшелер тамырланады және өскін бере бастайды. Алынған өскінді микроқалемшелеу және гормонсыз ортада өсіру арқылы көбейтуге болады.
   

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.

Бақылау сұрақтары :

1. 
   Өсімдікті микроклональды көбейту дегеніміз не? Негізгі этаптары
   
2. 
   Микроклонды көбейтудің негізгі тәсілдері
   
3. 
   Вируссыз отырғызу материалын қалай алуға болады?
   
4. 
   Өз жұмысыңызда вируссыз отырғызу материалын алу үшін кай тәсілді қолданар едіңіз.
   

№ 4 зертханалық жұмыс - Вируссыз отырғызу материалын алу. Картоптың апикальды меристема культурасы

Микроклоналды көбейтуi патогендiк микроорганизмнен сауықтырылған өсiмдiктердi көбейтуi үшiн үлкен мәнге ие. Көптеген микроорганиздер мәдени өсiмдiктердің түсімін жыл сайын жоғалтуына 20% ке жоғалуына әкеп соқтырады.

Бұл аурулармен дәстүрлі химиялық әдістермен күресу мүмкін емес себебі көптеген патогендердің тіршілілік циклі олардың өсімдік-қожайындарының метоболизімен тікелей байланысты. Соңғы кездері сауықтырылған көшет алу үшін апикальды меристеманы тестен өткізу арқылы зерттеу жиі қолданылуда.

( ИФА ) талдауды иммуноферментті талдау әдiсiнiң қағидасы төмендегiдей болады: қарсы геннiң компоненттердiң бiреуiне - қарсы дене ферменттерін қосады, басқа компонент қатты фазаларда сорбциялайды. Содан соны бейтараптау реакцияларын өткiзедi, субстраттарға толықсытады және кешеннiң белсендiлiктерiн анықтайды. Демек, қарсы геннiң пайда болған кешендер санывирустар санына пропорционалды дегенді білдіреді.

Талдау үшiн лункалар қолданылады, онда сүтқоректіден алынған қанға сарысу мен антиденелерді қосады.

Антиденелер төлемнiң ұяшықтарының бетiнде 6 сағат iшiнде сiңiрiп алады. Сарсудың қалдықтары арнайы буферлермен алып тастайды. Содан соң қуыстарда өсiмдiк жапырақтар шырынының зерттелетiн сығындыларын кiргiзедi. Вирус анықталған жағдайда вирус-антидене кешені құрылады. Міндетті түрде бақылау платаларын дайындайды. Буфермен жуғаннан кейін, ұяшықтарға фосфотаза және пероксида ферменттері бар антиденелер қосады. Вирусболған жағдайда антиген-антидене-фермент кешені түзіледі. Егер материал стерилді болса, кешен түзілмейді, фермент қалдықтары буфермен шайылады. Айтылған зерттеулерден кейін плата лункаларына субстрат құяды, Бұл субстратқа фермент ісер етеді.

Реакция нәтижесінде вируспен зақымдалуына байланысты лункадағы ерітінді түсі өзгереді: бояу болмаған жағдайда - вирус жоқ-«-«;ашық қоңыр –«+»-орташа зақымдылған; тым ашық қоңыр-«++» жоғары дәрежелі вируспен зақымдану.

Вирусқа нәтижелі тестілеу жүргізу үшін жоғары сапалы антиденелер, ферменттер, платалар қолдану керек.

Отырғызатывн материал вируспен зақымдалған жағдайда термотерапия немесе химиятерапия әдістерін қолданады.

Термотерапия кезінде бактериальды және саңырауқұлақсыз картоп түйнектерін ИФАдан өткізеді. Кейін оларды трпырақ бар кюветтерге 1-2 аптаға 20-30⁰С температурада,4 апта 37-38 ⁰С 70-80 % ылғалдылықта өсіреді. Күніне 2 рет топырақты ылғалдандырады, 7-10 күн сайын Кноп ерітіндісі мен Мурасиге – Скуг микроэлементтерімен азықтандырады: 5 мл маточный растворға 1 л Кноп ерітіндісі қатысында. Жоғары температураға төзімді түйнек сорттарын бірден 37-38 ⁰С температурада 70 % ылғалдықта өңдейді.

Қыздыру өңдеуi әшекейлi, ұршық тәрiздi, жiп тәрiздi, таяқ тәрiздi вирустермен зақымдалған өсiмдiктерге қолдану тиімсіздеу. Сондықтан қосымша биотехнологиялықтәсілдер қолданылады: апикальды меристема тәсілі. Ол үшін қыздырып өңдеу алдында картоптің жоғары бөлігін кесіп, гетерауксин крітіндісіне 6 сағатқа қояды. Қысқыртылған өскіндерді культуралы камераларға енгізеді немесе 37 ⁰С температуралы бөлме температурасында, топырақ 30-32 ⁰С, 16 сағат фотопериодта 4-6 апта сақтайды.

Қыздыру өңдеуін негізінде күз және қыс айларында өткізеді. Көктемде өсімдіктен 0,3 мм ден 1ммге дейін қолтыө бүршіктерін ажыратады. Жылу режимін әрбір өсімдік түріне эксперимент ретінде алдын ала жүргізіп алады.

Химиятерапия үшін арнайы вирус нигибиторларын пайдаланады: ферменттер, РНК-азалар. Үздіксіз өңдеуді инфильтрация әдісімен де жүргізіге болады, оны вакуумды камерада 20 минут бойына ұстайды.

РНК-азалар өсімдіктің өсуін жылдамдатады. Нәтижесінде қоректік ортада меристема өсуін 30-35% ке дейін жоғарлатады. 30-40% ға дейін регенрант өсімдік өсуі көбейеді

Картоптың апикальды меристемалары, Мурасиге-Скуг ортасы, Миллер, Уайторталары. БАП, ИУК, кальций гиплохлориті, этил спирті, стерильденген дистильденген су.

Ламинар,термостат, бинокулярлы лупа, пинцет скальпель препоральды инелер, лезвия, петри тостағаншасы,250 мл Эрленмейер колбасы, пробиркалар, мақта, фольга.

Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі

1. 
   Алдын –ала картоп түйнектерін өсіру.
   
2. 
   Картоп түйнектерінен өскіндерін анықтап, 1 мин 70% этил спиртіне салу, содан 15 мин 15% гипохлорит кальций ерітіндісіне салу және 3 рет дистилденген сумен шаю
   
3. 
   Ламинар-боксте бинокулярлы лупа көмегімен жоғары бүршіктерден 1 мм болатын меристемаларды анықтау. Ажыратылған меристемаоарды 5 мл сұйық не қатты сахароза мен фитогормонның крнцентрациясы 2 есе азайған Миллер ортасы бар Петри тостағаншасына отырғызу.
   
4. 
   Меритеманы бір ай бойы 20-25⁰С температурада 12 сағаттық фотопериодта, 1500 лк жарықта культивирлейді. 3-4 аптадан соң каллус пайда болады.
   
5. 
   Каллусты 1-2 мг/л БАП бар Мурасиге-Скуг ортасына көшіру, культивирледің екінші айында12 сағат жарықта интенсивті 5000лк жарықта культивирлейміз.
   
6. 
   3 мл ұзындықта қалыптасқан каллусты Уайт ортасына көшіру. 2 аптадан кейін топыраққа отырғызуға болатын өсімдік анықталады.
   

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.

Бақылау сұрақтары :

1. 
   Вируссыз отырғызу материалын қалай алуға болады?
   
2. 
   Өз жұмысыңызда вируссыз отырғызу материалын алу үшін кай тәсілді қолданар едіңіз.
   

№ 5 зертханалық жұмыс - Гаплойдты жасушалардың культурасы. Арпа мен сұлының тозаңқаптары мен микроспораларының даму сатыларын анықтау

Бірінші рет 1973 жылы сасық меңдуананың тозаңын өсіріп, оларда эмбриоидогенез процесі жүруін байқаған К.Нич пен Б.Норел болды. Көбіінесе тозаңқапты өсіріп, регенерант өсімдіктеріналу тиімді. Бірақ астық тұқымдастарында тозаңды тозаңқаптан бөліп алу өте қиын. Ол үшін тозаңқаптарды сұйық ортада қалқытып, шайқап өсіру әдісі қолайлы. Тозаңқаптар жарылып ашылады да, тозаң өздігінен шашылып, қалқып ортаның бетіне шығады. Сұйық ортада қалқып жүрген тозаңқаптарды алып тастайды, ал олардан шыққан микроспораларды одан әрі өсіре береді.Тозаңқаптардан биологиялық активтілігі бар заттар шайылып шығып, қоректік ортаның құнарлығы артады, яғни тозаңның өсуіне барынша қолайлы физиологиялық жағдай туады.

Кейбір өсімдіктердің тозаңқаптарын сұйық ортаға саларда оларды өткір скальпельдің ұшымен екіге бөліп жібереді. Ш.Тивари арпамен өткізген тәжірибесінде бүтін тозаңқаптарды сұйық ортада үш тәулік бойы өсіргенде, олардың 60-70% микроспоралары өз бетімен ортаға шыққан. Ал кесілген тозаңқаптарды сұйық ортаға 4 сағат бойы шайқап өсіргенде, олардың 90% микроспоралары сыртқа шыққан. Алдынала тозақаптарды кесіп тіліп сұйық ортада өсірген соң, ортаны сүзіп жіберіп, центрифугадан өткізіп, микросоралары көп фракцияны алған. In vitro жағдайында эксерименттік жолмен гаплойдтарды шығару әдісінің кең таралуына екі ірі кемшілік тегеурін болады:

1. 
   гаплойдтық өсімдіктердің аз алынуы;
   
2. 
   олардың арасында альбиностардың көп кездесуі;
   

Андрогенездің тиімділігі (көп гаплоид алу) бірімен бірі өзара байланысты көп факторларға тәуелді: донорлық өсімдіктердің генотипі; олардың өскен жағдайлары; микроспоралардың дамуы кезеңі; эксплантты алдын-ала өңдеу; қоректік ортаның құрамы; гүл тозаңдарын өсіру әдістері, т.б.

In vitro жағдайындағы андрогензді шектейтін негізгі фактор-донорлық өсімдіктің генотипі. Туыстар ішіндегі түрлер тұрмақ, тіпті бір түрге жататын сорттардың регенерацияға қабілеті бірдей болмайды. Мысалы, күріштің жапон түртармағының сорттары тозаңқаптан регенерант өсімдіктерін үнді түртармағымен салыстырғанда артық шығарады. Арпа мен бидайдың көптеген генотиптерінің андрогенездік қабілеті сыналған. Мұндай қабілет арпада 0 мен 31,6 % арасында, бидайда- 0 мен 14,7 % дейін байқалған. Көптеген зерттеулердің нәтижелері көрсеткендей, генотип пен in vitro жағдайында өтетін морфогенездік өзара байланысы өте күрделі, әсіресе бұл даражарнақты өсімдіктерде байқалады. И.Василдің пікірінше экспланттың морфогенезге қабілеті донорлық өсімдіктің генотипіне қарағанда көбінесе оның физиологиялық күйіне байланысты. Тіпті физологиялық күйіне сәйкес өсіру жағдайын жақсартып, генотиптің андрогенезге көрсететін ықпалын төмендетуге болады. Донорлық өсімдіктерді өсіру жағдайы андрогенездің тиімділігіне әсері бар екендігі айқын анықталған. Мысалы егістік жерде өскен өсімдіктердің тозаңқаптары теплицада өскен өсімдіктермен салыстырғанда регенерант өсімдіктерін артық шығара алады. Шамасы, бұл сыртқы факторлардың комплекстік әсерінің нәтижесі болар.

Микроспоралардан каллустар мен эмбриоидтар түзілу жиілігіне донорлық өсімдіктерге ықпал еткен әр түрлі физикалық және химиялық факторлардың әсері көрсетілген. Осы факторлардың ішінде ең мәндісі- температура. Донор өсімдіктерді алдын-ала суықпен өңдеу арқасында эмбриоидтардың түзілу жиілігі артады. Бірақ температура және оның ықпалының ұзақтығы өсімдік түріне, тозаңның даму кезеңіне, оның бөлініп алынған уақытына сәйкес болуы қажет.

Түтікшелеудің ақырғы фазасындағы өсімдіктер,тозаңқаптар.Фиксатор ФАА, 3% ацетокрмин ерітіндісі, 5% сірке қышқылы ерітіндісі .Бинокулярлы лупа МБС-10, микроскоп, қайшы, скальпельдер, лезвия, пинцеттер, инелер, көлемі 25 мл шыны стакандар, пенициллиннің банкалары.

1. 
   Түтікшеленудің ақырғы фазасындағы өсімдіктердің негізгі сабақтың жоғарғы жағынан ту тәрізді жапырақ шыққанда арпа мен сұлының масақтарын кесіп алу.
   
2. 
   Масақтардан, пинцет арқылы ортаңғы жағында орналасқан масақтарын бинокулярлы лупа арқылы кесу, арнайы ине арқылы тозаңқаптарын бөліп алу.
   
3. 
   Бөліп алған тозаңқаптарды 2-4 сағатқа ФАА фиксаторына қою
   
4. 
   Фиксациялп болған соң материалды сірке қышқылыныңиісі кеткенше бірнеше порциялы суда жуу
   
5. 
   Тозаңқаптарды арнайы ине арқылы заттық шыныға орналастырып, бояу үшін 1-2 тамшы 3%-тік ацетокармин ерітіндісін құю. Егер препараттың түсі қаныққан болса, онда 5% сірке қышқылының 1-2 тамшысымен ашық түске жеткізеді.
   
6. 
   Тозаңқаптан микроспораның босатылуы үшін скальпельдің үшкір ұшымен оны екі жартыға кесіп және тозаңқаптың қабырғасына дәнді сыртқа сығу.
   
7. 
   Микроспораның даму сатыларын микроскоп арқылы 10-20 есе үлкейтіп анықтайды.
   

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

1. 
   Селекция мен генетикада гаплойдтардың маңызы.
   
2. 
   Еркек гаметофит культурасында морфогенді каллусты алу тәсілдері.
   
3. 
   Регенеранттар –гаплойдты, диплойдты өсімдіктердің негізгі алу әдістерін атау.
   
4. 
   Еркек гаметофитінің даму кезеңдерін анықтау.