МөЖ. Белковая комплементация как инструмент для изучения межбелковых взаимодействий в живой клетке
жүктеу/скачать 1.5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- (1а-сурет). а – белокты комплементацияның әсер ету принципі.
|
Әл- Фараби атындағы Қазақ Ұлттық университеті Биология және биотехнология факультеті МӨЖ. Белковая комплементация как инструмент для изучения межбелковых взаимодействий в живой клетке Алматы - 2022 жыл Орындағандар: БТ М 21-02 магистранттары Мукажанова А. Мырзахметова Г.М. Тортай М.К. Шакирова А. Шисенбаева Н. Қабылдаған: Бишимбаева Н.К. In vitro ақуыздардың өзара әрекеттесуін анықтау және талдаудың көптеген әдістері бар. Әдетте, олар белоктардың күйіне және олардың өзара әрекеттесуіне әсер етуі мүмкін белок экстрактыларын дайындауға және тазартуға негізделген, сондықтан нақтырақ деректерді тірі жүйеде in vivo алуға болады. Мұндай әдістер өзара әрекеттесулерді сандық бағалауға қабілетті болуы керек. Мұндай тәсілдердің бірі репортер фрагменттерін толықтыру эффектісін пайдаланады. Репортер жүйелерінің жұмыс істеу принципі репортер ақуыз фрагменттері арасындағы функционалды комплементацияны анықтауды қамтуы мүмкін, яғни. репортер ақуызының екі белсенді емес бөлігінің жақындау және белсенділікті қалпына келтіру кезінде өздігінен өзара әрекеттесу қабілеті (1а-сурет). а – белокты комплементацияның әсер ету принципі. Субстратты (S) ыдыратуға қабілетті фермент екі белсенді емес бөлікке жасанды түрде бөлінеді. Егер екі белсенді емес бөлік өзара әрекеттессе, онда ферменттің белсенділігі қалпына келеді. б - Екі ақуыздың өзара әрекеттесуін тіркеу үшін сплит-убиквитин комплементациясын қолданатын репортер жүйесі. А протеині ХА эпитопымен таңбаланған дигидрофолатредуктаза (DHFR) қосылған убиквитиннің С-терминал фрагментімен байланысқан. В протеині убиквитиннің N-терминалды фрагментімен байланысқан. А және В протеиндері байланысса, убиквиттің жартысы да қайта жиналады, бұл олардың убиквитин протеазасы (UBP) арқылы танылуына және HA-DHFR-ден бөлінуіне әкеледі. Бұл процесс Western blotting және HA-ға антиденелер арқылы жазылады. Ең жиі қолданылатын репортер ақуыздарына убиквитин, жасыл (GFP) немесе қызыл (dsRED) флуоресцентті ақуыз нұсқалары, дигидрофолатредуктаза (DHFR), β-лактамаза, β-галактозидаза, TEV-протеаза, люцифераза және т.б. Хабарлаушы ақуызға байланысты белсенділікті флуоресценция, люминесценция және түсті бояу қарқындылығымен, цитотоксикалық агентпен өңдеуден кейін аман қалған жасушалар санының өзгеруімен және басқа оңай анықталатын көріністермен анықтауға болады. Убиквитин белоктардағы лизин қалдықтарына ковалентті түрде қосыла алады және олардың убиквитинді конъюгациялаушы ферменттердің көмегімен жүзеге асыра алады. Белгіленген ақуыз молекулаларынан убиквитин қалдықтары убиквитинге тән протеазалар (UBPs) арқылы жойылады. Зерттелетін белоктарға қосылған убиквитин молекуласының жартысы, олардың өзара жақындығын төмендету үшін қосымша мутациялар енгізілген, тек маңызды тәсілмен немесе оларға қосылған белоктар арасындағы жақындыққа байланысты қайта қосылуы мүмкін. Бұл жағдайда убиквитин конформацияны қабылдайды, оны UBP арқылы тануға және ажыратуға болады. Убиквитин қалдықтарын жою нәтижесінде репортер ақуызының қозғалғыштығы өзгереді, оны вестерн блотинг арқылы анықтауға болады. Бастапқыда дигидрофолатредуктаза (DHFR) қосылған HA эпитопы қолданылды (1б-сурет). жүктеу/скачать 1.5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|