– начинается с 24 ч и снижается после 72 ч наблюдения в группах 1 и 3 при сохранении высокой продукции О2–

* ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Увеличение концентрации клеток на сроках 1-3 ч в ответ на введение ЭЧ было стереотипным ответом вне зависимости от месяца иммунизации. Особенно высокий прирост числа циркулирующих целомоцитов отмечался у животных в июне. Другой общей чертой было наличие как минимум трех приростов числа клеток на сроках 9-120 ч, однако в августе наблюдали только первый пик численности клеток, два других не были выраженными. В контрольных группах также наблюдали сходные флюктуации концентрации клеток, которые имели наибольшую амплитуду в июне. Спонтанный НСТ-тест выявил повышенную способность к продукции О₂^– целомоцитами животных интактной группы до иммунизации в августе, что свидетельствует об увеличении удельной ферментативной активности целомоцитов на фоне снижения их общего числа в циркуляции. Несмотря на это, после иммунизации ЭЧ на всех сроках наблюдения показатели августовской группы были в 1,5-4 раз ниже аналогичных показателей июньской группы. В июне и июле наблюдали повышение спонтанной продукции О₂^– на сроках свыше 48 ч после иммунизации ЭЧ, что совпадало с приростом метаболической активности клеток (МТТ-тест) на этих сроках. Для стимулированной продукции О₂^– вне зависимости от месяца иммунизации характерно усиление синтеза О₂^– на сроках 1 и 48 ч, последнее может быть связано с пополнением пула НСТ-позитивных клеток за счет выхода новых клеток в циркуляцию. При исследовании титров гемагглютининов было показано, что максимальная концентрация этих факторов наблюдается в июне, в то время как в августе эти факторы представлены в целомической жидкости не более чем 10% обследованных животных. Следует отметить, что если в динамике клеточных факторов удается выявить некоторые общие закономерности между разными месяцами, то динамика гуморальных факторов в опыте и контроле почти совпадала в каждом месяце в отдельности, но отличалась от других месяцев иммунизации. Это косвенно подтверждает наши данные предыдущих лет, указывавших на связь гуморальных факторов целомической жидкости скорее с реакцией на повреждение покровов, чем с ответом на введение ЭЧ. Полученные данные свидетельствуют о том, что сезонные факторы оказывают прямое влияние на клеточные защитные реакции A.rubens. Максимальные амплитуды изменений показателей активности клеток в июне могут быть связаны с подготовкой животных к размножению. Снижение температуры окружающей среды ведет к снижению титра агглютининов и уменьшению числа циркулирующих клеток на фоне повышения их удельной ферментативной активности. Работа поддержана грантами РФФИ №04-04-49069 и 04-04-49342.

Была проанализирована экспрессия Нох гена Nvi-lox5 в ларвальном развитии Nereis virens. Основным методом изучения являлся метод гибридизации in situ на тотальных препаратах (WMISH). Принцип метода заключается в выявлении зоны экспрессии гена в личинке Nereis virens посредством гибридизации мРНК гена с РНК-зондом, содержащим дигоксигениновую метку. Локализация двунитевых гибридов детектируется антителами к дигоксигенину. Сбор и фиксация личинок осуществлялись в июне-июле 2003 года на МБС СПбГУ, о. Средний.

Экспрессия Nvi-lox5 детектируется уже на стадии ранней трохофоры (54 часа) в двух клетках на дорзальной стороне личинки. Несколько позднее домены экспрессии расширяются в антериорном направлении и, по-видимому, охватывают зону формирующегося третьего сегмента. В это же время на вентральной стороне возникает экспрессия в нескольких клетках, локализованных по срединной линии. Этот домен исчезает через несколько часов.

На стадии поздней трохофоры экспрессия Nvi-lox5 охватывает всю область будущего третьего сегмента. В метатрохофоре экспрессия детектируется также на вентральной стороне второго ларвального сегмента. На стадии поздней нектохеты Nvi-lox5 продолжает экспрессироваться в вентральной части третьего ларвального сегмента и кольцевой домен экспрессии появляется в зоне роста.

Судя по характеру экспрессии, Nvi-lox5 принимает участие в спецификации третьего ларвального сегмента личинки Nereis virens. Начало его экспрессии соответствует моменту закладки материала для формирования третьего сегмента. На более поздних стадиях область экспрессии охватывает весь третий сегмент. Более поздняя экспрессия во втором и третьем сегментах, по-видимому, связана со спецификацией нервных ганглиев CNS.

Харин А.В., Костюченко Р.П. Регенерация у Nais communis
Для большинства беспозвоночных, размножающихся поперечным делением характерны высокие способности к регенерации. Часто отмечается значительное морфологическое сходство этих двух процессов и высказывается предположение о том, что они имеют общие клеточные источники.

Объектом наших исследований является Nais communis (Oligochaeta). Ранее для этого вида нами было описано бесполое размножение по типу паратомии. Гистологические и ультраструктурные данные позволяют предполагать, что дедифференцирующиеся клетки покровного эпителия являются основным источником развития недостающих структур. Проверка этого предположения требует применения методов избирательного выявления ДНК делящихся клеток на разных стадиях восстановительных процессов. Однако ранние стадии бесполого размножения плохо различимы внешне и, следовательно, труднодоступны. В качестве объекта данного исследования целесообразно использовать регенерирующих червей Nais communis. Однако сначала необходимо охарактеризовать в целом регенерацию у данного вида.

Нами показано, что данный вид обладает хорошо выраженной способностью как к передней, так и задней регенерации. При передней регенерации через 1.5 - 2 ч. после операции (при температуре 19 – 22^оС) происходит эпителизация раны. Раневой эпителий состоит из клеток, лежащих более плотно по сравнению с обычным эпителием. Одновременно происходит процесс замыкания кишечника. Спустя 3 - 4 ч. после операции начинается выселение отдельных клеток под раневой эпителий. Значительное увеличение числа этих клеток происходит спустя 19 - 22 ч. после начала эксперимента, при этом образуется типичная регенерационная бластема. Одновременно клетки раневого эпителия из уплощенных становятся столбчатыми, количество ядер на единицу поверхности сильно увеличивается. За первые – вторые сутки бластема достигает размеров двух головных сегментов. На третьи сутки происходит обособление зачатков головного ганглия, глотки и ротового отверстия. На четвёртые - шестые сутки происходит дальнейшая дифференцировка этих структур и обособление новых зачатков. На 8-й день регенерат одновременно подразделяется на несколько сегментов. При удалении головных сегментов и одного – трёх сегментов тела или только головных сегментов всегда восстанавливаются только головные сегменты, причём в количестве трёх, то есть регенерация является гипоморфной (видоспецифичное число головных сегментов – четыре). При удалении трёх и меньше головных сегментов общее число головных сегментов после завершения регенерации составляет четыре или три.

При задней регенерации заживление раны с образованием раневого эпителия, замыкание кишки и образование бластемы происходжит также, как и при передней. У фрагментов, содержащих более 10 старых сегментов тела спустя 8 - 10 дней полностью формируется пигидиальная область, и начинают последовательно образовываться сегменты, неотличимые от старых. У более коротких фрагментов образование новых сегментов может происходить быстрее, но они отличаются меньшими размерами и недоразвитием хлорагогенной ткани.

Работа поддержана грантом КЦФЕ № A04 2.12-195.

Шапошникова Т.Г., Павлов А.Е. Получение фракции тестальных клеток, окружающих ооциты, у асцидии Styela rustica
Ооцит асцидии окружен двумя слоями клеток: слоем фолликулярных клеток, крепящихся к яйцевой оболочке, и слоем тестальных клеток. Тестальные клетки, или калиммоциты, обнаружены только лишь у представителей класса асцидий. Мнения специалистов относительно выполняемых ими функций расходятся. Одна из гипотез предполагает, что они выделяют продукты, участвующие в формировании личиночной туники, создающей надежную защиту самой уязвимой стадии жизненного цикла асцидии. Ранее нами были получены антитела против двух мажорных белков 26 и 47 кДа морулярных клеток (одного из типов клеток крови, участвующих в задубливании туники) асцидии Styela rustica (Stolidobranchia, Tunicata). При окрашивании срезов тела этими антителами обнаружилось, что помимо самих морулярных клеток метятся и антигены, находящиеся в тестальных клетках яйца в гонаде. Т.о., возникла потребность в получении чистой фракции тестальных клеток, что и явилось задачей настоящей работы. Было опробовано несколько вариантов выделения. Наиболее удачным оказалось механическое отделение фолликулярных клеток в результате мягкого пипетирования с последующим разрушением хориона в гомогенизаторе и разделением полученной суспензии клеток и желточных гранул в трехступенчатом градиенте Перколла. В результате удалось получить достаточно чистую фракцию тестальных клеток с незначтельными вкраплениями желтка. Проведено разделение белков тестальных клеток в условиях SDS-электрофореза. В белковом спектре присутствуют несколько групп белков с молекулярными массами в пределах от 30 до 180 кДа. Белки, сходные по молекулярным массам с мажорными белками морулярных клеток, не выявлены.

Эрлих Г.*, Ересковский А.В. Современные методы исследования губок в качестве потенциальных моделей для создания новых биоматериалов

*Max-Bergmann-Center of Biomaterials, Institute of Material Science, Dresden University of Technology, D-1069 Dresden, Germany

К наиболее перспективным в этом отношении представителям Porifera авторы относят «роговых» (Verongidae) и стеклянных (Hexanellidae) губок. Результаты предварительных исследований отчетливо показали, что в основе скелетного каркаса этих губок лежат фибриллярные коллагеноподобные белки. У «роговых» губок фибриллярный белок находится внутри органического цилиндра, который в свою очередь, покрыт нанослоем хитина. Для типичного представителя стеклянных губок – Hyalonema sp. характерно наличие сложноорганизованного фибриллярного белкового каркаса, являющегося темплатом для синтеза биосиликатов, детерминирующих прочностные свойства губочных стекловолокон. Авторами предлагается следующая схема применения различных физических и физико-химических методов анализа структурных компонентов губок, которую можно эффективно использовать на всех этапах онтогенеза исследуемого организма.

1) Анализ фрагмента натуральной губки (геммула, личинка, взрослая особь): взвешивание образца на микровесах; оптическая, электронная сканирующая (SEM, ESEM), конфокальная лазерная (LSM), трансмиссионная (TEM) и голографическая (FEG/TEM) микроскопии, совмещенные с элементорганическим анализом (EDX). Для исследования природы минеральных составляющих применяется инфракрасная спектроскопия (FTIR) и рентгеноструктурный анализ (XRD).

2) Деминерализация исследуемого фрагмента губки: эффективным реагентом, приводящим к постепенному выщелачиванию минеральной фазы на фоне сохранения органического скелета, является 2.5 М раствор NaOH (при 37°C в течение 7 суток).

3) Экстракция и выделение минерально-щелочной фазы: фильтрование, центрифугирование, диализ, лиофилизация. Качественный и количественный мониторинг исследуемых компонентов проводится с помощью спектрального (UV/VIS) и инфракрасного (FTIR) анализов и тонкослойной хроматографии (TLC).

4) Анализ фрагмента деминерализованной губки: сравнительные аналитические процедуры проводится аналогично п. 1.

Предлагаемый авторами аналитический подход к исследованию губок как биоматериалов позволяет получить обширную научную информацию по нано- и микроморфологии скелетообразующих структур на различных стадиях развития исследуемого организма, может быть эффективно применен при конструировании, синтезе и нанодизайне моделей фибриллярных биоматериалов для биомедицины и имплантологии.

Эрлих Г.*, Ересковский А.В, Дроздов А.Л.** Исследование глубоководных кораллов семейства Isididae в качестве потенциальных моделей для создания новых биоматериалов

*Max-Bergmann-Center of Biomaterials, Institute of Material Science, Dresden University of Technology, D-01062 Dresden, Germany;

**Институт биологии моря ДВО РАН (Владивосток)
Глубоководные кораллы семейства Isididae (Anthozoa: Gorgonacea) представляют большой интерес в связи с особенностями строения их минерального скелета. В морфологическом отношении сегменты тела этих кораллов (диаметром от 0.5 до 3 см и длиной от 4 до 8 см) напоминают кости фаланг пальцев руки человека, а гибкие сочленения отдельных ответвлений в функциональном отношении аналогичны суставам. Актуальность изучения особенностей развития, морфологии и наноструктуры Isididae обусловлена тем, что, полученные результаты можно было бы применить в биотехнологии выращивания этих кораллов, что связано с культивированием компонентов биоимплантатов и отказом от применения синтетических материалов.

В работе исследовались различные образцы представителей Isididae из экспедиционных материалов, добытых в Атлантическом океане, Охотском и Южно-Китайском морях.

Ультраструктура поверхности, продольных и поперечных срезов коралловых сегментов исследовалась методами электронной сканирующей (ESEM, SEM), трансмиссионной (TEM) и конфокальной лазерной (LSM) микроскопии. Дисперсионный элементарный микроанализ (EDX) проводился одновременно с электронно-микроскопическими исследованиями. Анализ поверхностей исследуемых образцов проводился при помощи метода атомной силовой микроскопии (AFM, Bioscope DI/Veeco, Nanosensors-SSS). Идентификацию минеральных компонентов осуществляли методами инфракрасной (FTIR), Раман (FT-Raman) спектроскопии и при помощи рентгеноструктурного анализа (XRD). Деминерализацию образцов проводили в течение 7 суток при 37°C в стандартном растворе Osteosoft (Merck). Прочностные характеристики образцов как биоматериалов исследовались с помощью TIRA-test (Mettler AT261 Delta Range). Сравнительные аналитические исследования образцов кораллов, осуществленные вышеуказанными методами, позволили получить следующие результаты. Органический матрикс представляет собой сетчатую цилиндрическую трубку, состоящую из поперечносшитых коллагеноподобных протеиновых фибрилл диаметром от 30 до 500 нм. Типичными для Isididae минеральными компонентами являются арагонит (на ранних стадиях развития) и кальцит.

Обнаруженное нами ранее явление межмембранной наноминерализации на уровне каликобластического (calicoblastic) эпителия наблюдалось во всех исследуемых образцах. Эластичность сочленений коралловых фрагментов обусловлена наличием окрашенных в коричневый цвет биополимеров полифенольной (меланины) природы, не подвергающихся минерализации. Результаты материаловедческой экспертизы позволяют отнести эти кораллы к категории материалов, применяемых в ортопедической хирургии. В связи с этим проведение дальнейших исследований специфики биоминерализации у кораллов Isididae на различных стадиях онтогенеза представляется крайне актуальным и своевременным.

*ИЭФБ РАН

Целью настоящей работы является исследование гемограммы морского переднежаберного моллюска Littorina littorea в норме и при заражении трематодой Himasthla elongata (Echinostomatidae). На основании данных световой микроскопии, ультраструктурных и цитохимических исследований в гемолимфе литторины обнаружены три морфологических типа клеток: ювенильные круглые клетки, крупные зрелые гемоциты и клетки, обладающие промежуточным фенотипом. Три обнаруженных типа клеток различаются в основном ядерно-цитоплазматическим соотношением, формой и расположением ядра, а также количеством гликогена в цитоплазме. Согласно данным, полученным при исследовании популяции гемоцитов L. littorea при помощи бромодеоксиуридина (БрДУ), все три типа клеток представляют собой различные стадии одной линии дифференцировки – от круглого гемоцита к зрелому. Обновление популяции гемоцитов, по-видимому, происходит в основном за счет делений круглых клеток, которые являются единственным типом клеток, включающим БрДУ.

Обнаружены существенное межиндивидуальное варьирование параметров гемограммы а также сезонные изменения гемограммы и пролиферативной активности клеток гемолимфы литторин. В течение летнего сезона доля зрелых клеток в гемолимфе L. littorea возрастала, в то же время отмечено снижение доли промежуточных клеток, количество ювенильных гемоцитов в крови литторин оставалось постоянным. Наибольшая интенсивность включения БрДУ была отмечена в июне, тогда как в июле и в августе пролиферативная активность клеток гемолимфы существенно снижалась. Однако, максимальные значения общей концентрация клеток в гемолимфе L. littorea были зарегистрированы дважды за сезон – в июне и в августе. Первый пик совпадал с повышенной пролиферативной активностью клеток гемолимфы, второй предположительно связан с выходом клеток из тканей после резорбции гонад по окончании сезона размножения.