Ооо «Лаборатория Изоген»



Дата13.06.2016
өлшемі116.5 Kb.
#132366




ООО «Лаборатория Изоген»

Мы рекомендуем Вам прочесть

эту Инструкцию, даже если Вы

использовали набор ранее.

Информация могла измениться.

GenePak® DNA PCR test


набор реагентов для обнаружения ДНК возбудителей



инфекционных заболеваний методом

полимеразной цепной реакции


И н с т р у к ц и я

НАЗНАЧЕНИЕ


1.1. Наборы реагентов GenePak DNA PCR test предназначены для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в пробах человека и животных методом полимеразной цепной реакции (PCR).
1.2. Наборы реагентов GenePak DNA PCR test могут быть использованы в клинической лаборатории для обнаружения ДНК бактериальной, вирусной, грибковой или другой природы и оценки эффективности проводимой терапии.

1.3. Время проводимого анализа составляет не более 4 ч.

1.4. Наборы рассчитаны на проведение 100 реакций, из них 10 положительных и 10 отрицательных контрольных образцов.

2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ


2.1. Наборы реагентов GenePak DNA PCR test основаны на использовании процесса амплификации ДНК методом PCR, с помощью которого можно размножить и выделить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем в 109 раз и выше по сравнению с исходной матрицей ДНК.

2.2. Наборы реагентов GenePak DNA PCR test представляют собой лиофилизованные сухие реакционные смеси, готовые для амплификации выделенной ДНК.



    1. Выделение ДНК рекомендуется проводить двумя способами по выбору: с помощью пробопоготовки Ускоренной или Универсальной, в зависимости от природы анализируемой биологической пробы.

    2. Детекцию PCR продукта проводят элеткрофорезом в агарозном геле

с бромистым этидием под УФ светом с длиной волны 310 нм. По нали-

чию специфического фрагмента амплификации определенного размера

судят о присутствии ДНК возбудителя в анализируемом материале. Реги-

страцию результатов можно проводить визуально, с помощью фотогра-

фиирования или сканирования видеосистемой.

3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ


  1. При использовании в качестве исходного материала нативной ДНК возбудителя (положительный контрольный образец) на агарозном геле после проведения электрофореза продуктов амплификации под УФ-светом должнана появиться полоса желтого цвета, соответствующая определенному размеру (табл. 2).

3.2. При использовании в качестве исходного материала отрицательного контрольного образца после проведения электрофореза на агарозном геле полоса желтого цвета должна отсутствовать.

3.3. Чувствительность реакции составляет около 10 копий матрицы ДНК в 10 мкл реакционной смеси.



4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ


4.1. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

4.2. При работе с набором и с анализируемыми образцами человека следует надевать одноразовые резиновые перчатки, так как анализируемые пробы человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В, С или другой возбудитель вирусной или другой инфекции.

4.3. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.

4.4. Запрещается снимать крышку с электрофоретической камеры, если она подключена к источнику питания, так как высокое напряжение опасно для жизни.



  1. Для предотвращения контаминации основные виды работ при использовании PCR-наборов (подготовка анализируемых проб, проведение PCR и электрофорез) должны быть физически изолированы друг от друга, т.е. размещены в разных помещениях.

  2. Постановку PCR следует проводить в ламинарном шкафу.

  3. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда и др., а также рабочие растворы, должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое.

  4. Перемещение персонала или перенос оборудования из комнаты для электрофореза в другие помещения должны проходить под строгим контролем.

  5. Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза.

  6. Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых проводится постановка PCR, должны обязательно облучаться 25-30 мин. ультрафиолетовым светом до начала и после окончания работ.

4.11. Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе с набором реагентов, должны быть соответствующим образом маркированы и должны храниться отдельно.

5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА


  1. Комплект реактивов для Универсальнoй пробоподготовки:

  • Lysis reagent (Лизирующий реагент), готов к применению - 1 флакона, 30 мл;

  • Saline buffer (Солевой буфер) - 10-кратный буфер, 1 флакон, 10 мл;

  • ExtraGeneтм (ЭкстраГентм, суспензия смеси гранул ионообменников), готов к применению - 1 флакон, 10 мл;

  • NucleoSтм (Нуклеос™, суспензия сорбента), готов к применению - 2 пробирки по 1,0 мл.

  1. Комплект реактивов для Ускоренной пробоподготовки, включающий:

  • ЕxtraGene (ЭкстраГен™, суспензия смеси гранул ионообменников), - 1 флакон, 10 мл;

  • EnzyMix (ЭнзиМикс™, протеолитический комплекс), 1 пробирка с лиофолизованным сухим содержимым желтого цвета.

  • EnzyMixDiluent (Растворитель ЭнзиМикса™),1 пробика,100мкл

5.3. Комплект реактивов для Магнитной пробоподготовки:

    Lysis reagent (Лизирующий реагент), готов к применению -1 фла-

    кон, 30 мл,

    Saline buffer (Cолевой буфер) - 10-кратный, 1 флакон, 10 мл.

    Magnetic (Суспензия сорбента), готов к применению – 2 пробирки

    по 1 мл,

    ЕxtraGeneтм (ЭкстраГенTM, суспензия смеси ионообменников), -

    1 флакон, 10 мл;


5.4. Комплект реактивов для постановки PCR:

  • (+) control (положительный контрольный образец), готов к применению - красные пробирки с лиофолизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.;

  • (-) сontrol (отрицательный контрольный образец), готов к применению - синие пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.;

  • MasterMix (МастерМикс), готов к применению - бесцветные пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета для анализа клинических проб, 80 шт;

  • PCR Diluent (Растворитель ПЦР), 1 пробирка, 1,0 мл;

  • PCR Oil (Масло для ПЦР), 1 пробирка, 2,0 мл.

5.5. Комплект реактивов для детекции ДНК, включающий:

  • TBE buffer (буфер для электрофореза) - 1 флакон, 10 г;

  • Agarose ( агароза), - 1 флакон, 3г;

  • BE Dye (этидиум бромид, краска), готова к применению - 1 пробирка, 150 мкл.

6. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ


6.1. Программируемый термостат (амплификатор);

  1. Термостат для микропробирок, поддерживающий температуру

от комнатной до 100+20 С;

6.3. Микроцентрифуга, развивающая ускорение до 10000 об/мин;

6.4. Вортекс;

6.5. Электрофоретическая камера;

6.6. Источник постоянного тока;

6.7. УФ-трансиллюминатор;

6.8. Холодильник бытовой;

6.9. Пипетки автоматические одноканальные с переменным объемом;

6.10. Плитка электрическая или СВЧ-печь;

6.11. Водоструйный или аналогичный насос;

6.12. Микропробирки (1,5 мл);

6.13. Наконечники для пипеток (от 10 до 200 мкл);

6.14. Наконечники для пипеток (от 200 до 1000 мкл);

6.15. Колба коническая (500 мл);

6.16. Цилиндр мерный (1000 мл);

6.17. Перчатки резиновые медицинские;

6.18. Спирт этиловый 96%;

6.19. Вода бидистиллированная и дистиллированная.


7а. УСКОРЕННАЯ ПРОБОПОДГОТОВКА


Пробоподготовка Ускоренная рекомендуется использовать в случае проб с малым содержанием биологического материала (слюна, моча, слеза, смыв из носоглотки, соскоб слизистой и т.д.). Для отбора пробы соскоба слизистой, мазка или смыва от слизистой используется стерильный физраствор объемом 0,5-1,0 мл и одноразовые специальные щеточки или зонды. Плазма, сыворотка крови, спинномозговая жидкость и моча используются без разбавления физраствором. Моча для анализа должна быть прозрачной без солевого осадка. В случае появления помутнения мочу рекомендуется термостатировать при 370С 15-20 мин. Пробы, готовые к обработке, не должны содержать мукуса (слизи). Для обработки проб мокроты, богатых мукусом, рекомендуется использовать специальный Муколитический реагент. При наличии большого количества биологического материала в пробе (соскоб слизистой и т.д.), следует перенести в чистый эппендорф 100-500 мкл надосадка, полученного после оседания грубого осадка, и использовать в Ускоренной пробоподготовке.

7а.1 Подготовка рабочего ЭнзиМикса™. В пробирку с ЭнзиМиксом™ добавить весь объем (100 мкл) Растворителя ЭнзиМикса™ и перемешать до

полного растворения сухого содержимого, энегично встряхивая и смывая со

стенок пробирки. Полное растворение может продлиться до 15 мин.

Далее готовый ЭнзиМикс™ хранить при -200С в течение года.

7а.2. Подготовка рабочего ЭкстраГенаTM. В пробирку с 1 мл ЭкстраГе-



натм добавить 10 мкл EnzyMixTM, перемешать и перенести в холодильник до

использования. Готовый рабочий ЭкстраГентм можно хранить при 2-80С в

течение недели. При необходимости можно приготовить аналогичным

образом рабочий ЭкстраГентм нужного объема, соблюдая объемные соот-

ношения компонентов.

7а.3. Центрифугировать анализируемые пробы (суспензия биологического мате-

рала в физрастворе объемом до 1 мл) 2 мин при 10 000 об/мин для сбора

клеточного материала.

7а.4. Осторожно, не задевая еле заметный осадок, удалить суперна-

тант, используя водоструйный насос.

7а.5. Добавить к осадку от 50 до 200 мкл готового ЭкстраГенатм, в зависимости

от объема полученного осадка, и суспендировать осадок на вортексе.

Внимание! ЭкстраГентм следует отбирать от общего объема при

постоянном перемешивании! (7а.2 и 7а.5).

7а.6. Инкубировать пробирки при 560С 30 мин, а затем 10 мин при 1000С.

7а.7. Центрифугировать пробирки 10-15 сек при 10000 об/мин. для сбора

конденсата и осаждения несолюбилизированного дебриса. Для поста-

новки реакции использовать 10 мкл. прозрачного, без гранул ЭксраГе-

натм, супернатанта. При попадании гранул ЭкстраГена в реакционную про-

бирку происходит ингибирование реакции и приводит к появлению ложноот-

рицательных результатов.

7б. УНИВЕРСАЛЬНАЯ ПРОБОПОДГОТОВКА


Универсальная пробоподготовка рекомендуется использовать при вы-

делении чистой ДНК из биологических жидкостей и тканей, богатых ДНК

(крови, гомогената ткани, клеточной суспензии, соскоба слизистой и т.д.).

7б.1. Приготовление рабочего раствора Солевого буфера. Содержимое флако-

на с Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести биди

стиллированной водой до метки 100 мл, затем 96% этанолом до метки 300 мл и

перемешать. Полученный раствор следует хранить в герметично закрытой

посуде при температуре 2-80С в течение одного года.

7б.2. В 1,5 мл пробирку добавить 100 мкл. пробы (кровь, плазма, сыворотка, со-

скоб слизистой в физрастворе, моча и др.), добавить 300 мкл Лизирующего



реагента и перемешать, переворачивая пробирку.

8. ПОСТАНОВКА PCR.


8.1. Достать нужное количество бесцветных пробирок МастерМикса для анализа проб, одну пробирку синего цвета (-) контроля для амплификации отрицательного контроля и одну пробирку красного цвета (+) контроля для амплификации положительного контроля. Промаркировать соответствующим образом отобранные пробирки.

  1. Добавить во все пробирки, в том числе в (-) и (+) контроли, по 10 мкл ПЦР Растворителя. Сбросить использованный наконечник с пипетки.

8.3. Добавить в бесцветные пробирки МастерМикса по 10 мкл готовой для анализа ДНК проб (см. Пробоподготовку 7а.7 или 7б.16).

    1. Добавить в синюю пробирку (-) контроля и красную пробирку (+) контроля по 10 мкл бидистиллированной воды. Растворение содержимого пробирки не обязательно.

  1. Добавить во все пробирки по капле Масла (по 20 мкл).

Внимание: 1. Для предотвращения контаминации следует строго



соблюдать последовательность внесения образцов:

сначала в анализируемые пробы, затем в (-) контроль и в

конце в (+) контроль. Обязательно менять наконечник.

2. При работе с анализируемыми пробами рекомендуется

использовать специальные наконечники с антиаэрзоль

ными фильтрами.


    1. Провести амплификацию по следующей программе.

Таблица 1





№№
про-


Контроль температуры по

Активное регулирование температуры


Про-

грам.

block, матрица

Внутри пробиррки, (tube, точный) пробирки (tube,точн

Рассчитанное по (30 мкл)

алгоритму (sim., быстрый)




время температура

время температура

время температура

1

2 мин 950С

1 цикл

2 мин 950С

1 цикл

2 мин 950С

1 цикл

2

60 сек 950С

40 сек 580С

60 сек 740С

45 циклов

20 сек 950С

20 сек 580С

40 сек 740С

45 циклов

20 сек 950С

20 сек 580С

40 сек 740С

45 циклов

2

60 сек 950С

40 сек 580С

60 сек 740С

45 циклов

20 сек 950С

20 сек 580С

40 сек 740С

45 циклов

20 сек 950С

20 сек 580С

40 сек 740С

45 циклов

3

120 сек 740С

1 цикл

120 сек 740С

1 цикл

120 сек 740С

1 цикл

8.7. После окончания амплификации все пробирки перенести в комнату

для проведения детекции ДНК.


9. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА


    9.1. Приготовление рабочего раствора буфера для электрофореза (ТВЕ).

    В мерную колбу (цилиндр) на 1000 мл внести содержимое флакона с бу-

    фером для электрофореза (ТВЕ), довести до метки дистиллированной во-

    дой и перемешать до полного растворения порошка. ТВЕ буфер использу-

    ется также и для приготовления агарозного геля. Готовый ТВЕ буфер

    может храниться при комнатной температуре в течение 2 месяцев.



9.2. Приготовление агарозного геля. В коническую колбу на 500 мл внести содержимое флакона с агарозой, добавить 200 мл готового ТВЕ буфера и поместить колбу на электрическую ппитку. Довести содержимое колбы до кипения и после того, как агароза полностью расплавится, колбу с агарозой снять с плитки. Готовая агароза должна быть прозрачной и не должна содержать нерасплавленных частиц.

* Примечание: Для быстрого приготовления агарозы можно исполь-

зовать микроволновую печь (2 мин при “высокой мощности”).

9.3. Подготовка электрофоретической камеры к заливке агарозного геля. Установить крышку с ванночкой на камеру, а платформу для заливки геля поместить в ванночку. Установить гребенку на платформу.

9.4. Расплавленную агарозу охладить приблизительно до 500С в теплой воде или на столе при комнатной температуре. Затем в колбу с готовой агарозой внести 15 мкл этидиума бромида и осторожно перемешать содержимое колбы равномерными вращательными движениями.

9.5. Агарозу налить на платформу. Толщина слоя агарозы должна быть около 4 мм.

9.6. После застывания агарозы (примерно через 20-25 мин) осторожно, чтобы не порвать карманы, вынуть гребенку, а платформу с застывшим агарозным гелем перенести из ванночки в электрофоретическую камеру.

9.7. Добавить ТВЕ буфер в электрофоретическую камеру так, чтобы буфер покрывал агарозный гель слоем приблизительно 2-3 мм.

9.8. Отобрать 10 мкл продукта амплификации из-под Масла и добавить в соответствующую лунку агарозного геля, осторожно, чтобы предотвратить перетекание из одного кармана в другой.

9.9. Установить крышку на камеру, подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и установить на источнике питания напряжение 100-200 В (не более 15 В/см).

9.10. Через 20 - 30 мин (примерно 0,5 см прогона синей краски) электрофоре-

тическую камеру отключить от источника питания, отсоединить провода

от камеры, снять крышку с электрофоретической камеры.

9.11. Вынуть платформу с агарозным гелем из электрофоретической камe-

ры, дать жидкости стечь с геля и осторожно промыть агарозный гель водой.

Внимание! При работе с арагозным гелем и бромистым этидием



следует обязательно надевать резиновые перчатки!

9.12. Осторожно перенести гель на экран УФ трансиллюминатора.

9.13. Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА


10.1. В пробе из пробирки маркированной (+) должна быть видна специфическая полоса ДНК определенного размера (табл. 2) и соотвествующая внутреннему контролю вторая полоса размером 100 пн

10.2. В пробирке маркированной (-) специфическая полоса ДНК определенного размера должна отсутствовать, а полоса внутреннего контроля размером 100 пн должна быть видна.

10.3. В пробирке маркированной для анализируемых проб наличие полосы строго на уровне полосы положительного контрольного образца свидетельствует о положительной реакции образца на возбудитель. Полоса внутреннего контроля размером 100 пн также должна быть видна.

10.4. Результаты анализа должны быть отменены:

а) в случае наличия полосы в отрицательном контрольном образце на уровне полосы положительного контроля (результат контаминации),

б) при отсутствии полосы внутреннего контроля размером 100 пн в в анализируемых пробах и контролях (свидетельство наличия ингибирования PCR или же потерь ДНК при пробоподготовке).

10.5. Наличие слабых полос выше или ниже полосы положительного контрольного образца может быть результатом неспецифической амплификации, которые не должны быть приняты во внимание.
11. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА.

11.1. Все компоненты наборов реагентов GenePakPCR test можно транспортировать при температуре окружающей среды, от -20до +300С.

11.1. Все компоненты наборов реагентов можно хранить при температуре 2-250С в течение 1 года со дня выпуска.

11.2. Готовый рабочий раствор протеолитического комплекса EnzyMixследует хранить при -200С в течение 1 года со дня разведения.

11.3. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при 2-80 С 1 год со дня разведения.

11.4. Готовый рабочий раствор TBE буфера для электрофореза можно хранить при комнатной температуре в течение двух месяцев.

11.5. Для получения воспроизводимых результатов необходимо строгое соблюдение объемов добавляемых PCR Растворителя и исследуемой ДНК.
ООО «Лаборатория Изоген»

Для справок тел/факс: (095) 132 67 95, e.mail: shaikhaev@vigg.ru



Шайхаев Гаджи Омарович


Gardnerella vaginalis

Gva.

580С

424

Escherichia coli,CFT07, uropathogenic

Eco

580С

606

Mobiluncus curtisii

Mcu

580C

224

Morganella morganii

Mmo

580C

356

Bacteroides fragilis

Bfr

580C

535

Proteus mirabilis

Pmi

580C

448

Prevotella bivia

Pbi

580C

279

Pseudomonas aeruginosa

Pae

580C

254

Peotostreptococcus anaerobius

Pan

580C

396

Leptospira interrogans

Lin.

580С

668

Treponema pallidum

Tpa.

580С

325

Borrelia burgdorferi

Bbu

580С

445

Borrelia garinii

Bga

580С

445

Borrelia afzelii

Baf

580C

445

Borrelia spp.(burgdof.+garinii+afzelii)

Bor

580C

445

Toxoplasma gondii

Tgo

580С

523

Lactobacillus spp.

Lac

580С

239

Trichomonas vaginalis

Tva.

580С

771

Candida albicans

Cal

580С

490

Candida glabrata

Cgl

580С

295

Aspergilus fumigatus

Afu

580С

456

Pneumocystis carinii

Pca.

580С

396

Cryptococcus neoformans

Cne

580C

307

Clostridium difficile

Cdi

580C

517

Yersinia enterocolitica

Yen

580C

373

Yersinia pseudotuberculesis

Yps

580C

272

Yersinia pestis

Ype

580C

351

Enterococcus faecalis

Efal

580C

499

Enterococcus faecium

Efam

580C

541

Cryptosporidium parvum

Cpa

580C

475

Campylobacter jejuni

Cje

580C

364

Entamoeba histolitica

Ehi

580C

887

Giardia lamblia

Gla

580C

318

Ehrlichia (chaffeensis+HGE agent)

Ehr

580C

337

Rickettsia spp.

Ric

580C

259

Brucella melitensis.

Bme.

620С

442

Francisella tularensis

Ftu

580С

333

Vibrio cholerae (tox R)

Vcho (toxR)

580С

624

Vibrio cholerae (оmр W)

Vcho (оmpW)

580С

441

Tetracycline resistance gene, tetM

tetM

580C

430

Tetracycline resistance gene, tetQ

tetQ

580C

392

Erythromycin resistance gene, ermF

ermF

580C

492

Hepatitis B virus

HBV

580С

473

Transfusion transmit.virus,general

TTVgen.

580С

276

Transfusion transmitted.virus, types

TTV 1a,1b,2,3

600C

415, …

Parvovirus B19

B19

580С

743

SEN virus D

SENV-D

580С

346

SEN virus H

SENV-H

580С

346

SEN virus D/H

SENV-D/H

580С

346

Herpes simplex virus 1 type

HSV 1

580С

331

Herpes simplex virus 2 type

HSV 2

580С

432

Herpes simplex virus 1/2 types

HSV 1/2

580С

360

Varicella-zoster virus

VZV

580C

381

Epstein-Barr virus

EBV

580С

558

Human cytomegalovirus

HCMV

580С

451

Human herpes virus 6 type

HHV 6

580С

371

Human herpes virus 7 type

HHV 7

580С

437

Human herpes virus 8 type

HHV 8

580С

272

Adeno-associated virus, type 2

AAV-2

580С

450

Human papillomavirus, general

HPVgen.

560С

450

Human papillomavirus, 16 type

HPV 16

600С

692

Human papillomavirus, 18 type

HPV 18

600С

692

Human papillomavirus, 16/18 types

HPV16/18

600С

692

Human papillomavirus, high risk

HPV h.r.

580С

450

Human papillomavirus, high risk-plus

HPV h.r.+

580С

692

Human papillomavirus, low risk

HPV l.r.

580С

450

Human papillomavirus,genotypes

HPV types

600С

….

Adenovirus, general

AdV gen

560C

272

Adenovirus, genotypes

AdV types

600C

….

Human immunodeficiency virus 1

proHIV I

580С

376

HumanT-lymphocytotropic virus 1/II

proHTLV I/II

600С

598

Poliomavirusis (JCV, BKV, SV40)

JCV,BKV,SV

580С

232

Bovine leukemia virus (gag)

proBLV

580С

347

Aleutian mink disease parvovirus

AMDV

580C

298

Bovine herpes virus,I type

BHV I

580С

355

     в зависимости от типа используемого апмплификатора, рекомендуется оптимизировать

температуру отжига в пределах 20С от базового 580С.
Только для исследовательского применения






Достарыңызбен бөлісу:




©dereksiz.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет