Пму ұС 18. 2/05 Қазақстан Республикасы білім және ғылым министірлігі

Микробиология пәні бойынша

050802 Зоотехниямамандығы бойынша оқитын студенттерге арналған

Кафедра мәжілісінде ұсынылды «___» _______200_ж. , № __ хаттамасы

Кафедра меңгерушісі _____________ Ж.М. Исимбеков
Химиялық технологиялар және жаратылыстану факультетінің оқу-әдістемелік кеңесінде мақұлданды
“___” ______ 200_ж., № ___ хаттамасы

ОӘК төрайымы ______________ Ұ.Д. Бүркітбаева

Микроскоптар -12, имерсиондық май - 6; Заттық шыны; Лункасы бар шыны - 6; Жабынды шыны оқытушы үстнліне 1 қароп; Бактериологиядық петля,; Метилъдік көк әр бір үстелге; Фуксин әр бір үстелге; Спиртовка әр бір үстелге; Дистелденген суы бар шайғыш әр бір үстелге; Физ, ерітінде бар приборка әр бір үстелге; кір сабыннан әр бір үстелге; Микроорганизмдер мәдениеті бар 1 приборка стоға; Микроорганизмдер мәдениеті бар Петри чашкасы столға; Мақта тампондары бар 1 столға; Қолға арналған дезоеріиінді орамал.

1) биологиялык микроскоп құрылысын және олармен жұмыс істеу тәртібін (МБИ-1), өсімдіктер анатомиясының практикалық әдісін қолданып естеріне түсіріндер;

2. 
   микроағзаларды микроскопиялау әдістерін окып біліндер;
   
3. 
   келер бойынша жарық түсіргішті орналастыруды үйреніндер;
   

4. 
   тіркелген және боялған бактериялар препаратын дайындаңдар;
   
5. 
   иммерсионды объективпен тіркелген және боялған бактерияларды мынандай тәртіпте кдрастырындар:
   

б) тіркелген препаратты зат үлшесіне қойып, оны бекіту;

в) препаратты құрған объективпен қарап, бөлшектеп зерттеудің ынғайлы орнын табу,

г) тубусты көтеріп, иммерсионды объективті крйып, препаратқа иммерсионды май тамшысын тамызу;

д) препаратқа кырынан карап, иммерсинды объективтін линзасың төменгі фронтальды жағын иммерсинды майға малыңцар;

е) окулярға қарап, зерттелінетін объект көрінгенше, микроскоптың тубусын баяу көтеріндер;

ж) микрометрлік винт арқылы фокусты нақтылау;

з) препаратты зерттер, суретін салу;

и) тубусты кетеріп, иммерсинды майды сүрту.

Микроскоп. Жасушалардың мембранасына,ядросына және цитоплазмасының құрамына кіретін молекулалар мен органоидтарды жарық немесе электрондық микроскоп арқылы көруге болады. Жарық арқылы көрсететін микроскоп зерттейтін заттарды 100-3000 есеге дейін үлкейтіп көрсетеді, ал жетілдірілген окулярды қолданып,зерттелетін объектіні экранға түсіргенде оны 100 мың есеге дейін үлкейтуге болады. Биологияның арнаулы саласы-биохимия жасушаның химиялық құрамын молекулалық деңгейде зерттеу үшін центрифуга деп аталатын күрделі құралды пайдаланады. Ол өте жылдам айналып,жасушаның құрылымдық бөліктерін бір-бірінен бөліп алады, себебі оның бөліктерінің тығыздықтары әр түрлі болады. Жасушаның аса нәзік құрылысы мен қызметін зерттек тек цитологтардың, биохимиктердің,физиологтардың, генетиктер мен биофизиктер күш-жігерін ұштастырудың нәтижесінде ғана мүмкін екені өзінен-өзі түсінікті.Жасуша теорясы негізінің қалануы және жетілдірілген техникалық құралдардың шығуы жасушаның құрылысы мен химиялық құрамын,атқаратын қызметін зерттеуге кең жол ашты.

А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.

1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив, 12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания.

Электрондық микроскоп арқылы қазіргі кезде микроағзалардьщ морфологиясын зерттеуде үлкен жетістікке жеткенімен, жарықты микроскоп өзінің мәнін жоғалтқан жок. Қазіргі микроскоп 2000-2500 есеге үлкейтуге мүмкіндік береді және микроағзаньщ морфологиялық ерекшелігін аңықтайды.

Микроскоппен керінетін көрші нүктелер - ен өз аралықты рұқсатты қабілеті деп атайды.

Рұқсатты қабілеттің үлкейтуі 2 жолмен жүзеге алады:

1. 
   сандық апертурасы жоғары объективті қолдану (ол әр объективте белгіленген). Ең үлкен сандық апертурасы микроағзалардың морфологиясын жиі зерттейтін иммерсиондық объективтерде (МИ - 90 немесе ОИ - 90) болады;
   
2. 
   Препаратқа түсетін жарық, толқын үзьгадығьга қысқарту арқылы. Бүл жағдайда зерттеуді ультракүлгін жарықта, яғни толкыны күндік жарықтан кьісқа жағдайда жасайды. Ол үшін арнайы УФ -микроскоптары алынады. Күндік жарықта көрінетін ең үсақ бөліктер, көлемі 1/3 жарык толкын үзьгадығынан үлкен болу керек. Бүл жарықты микроскоп арқылы көлемі 0,2-0,3 мкм аз емес микроағзаларды керуге болатыңдығын көрсетеді.
   

Микроағзаларды тірі жағдайда зертгеу үшін микроскопқа қоса қүралдар қолданады.

Қазіргі жарықты микроскоптар ішінен микробиологиялық зерттеулер үшін ең қолайлысы МБИ - 1, МБИ - 3 модельдері биологиялық микроскоптар болып табылады.

Микроскоптың оптикалық қуатын аңықтайтьш негізі бөлігі -объектив. Микроскоп объективтері қүрғақ және иммерсионды больш бөлінетіндігін естеріңізге түсірейік. Қүрғақ объективтерді (8х, Ох) орташа үлкейткіш кездерінде қолданады (100-600 есе) объектив пен препарат арасында ауа қабаты болады.

Микроағзаларды зерттегенде әрқашан иммерсионды немесе майға батырылған объективті қолданады (90х). Үлкен үлкейту береді (900-1350 есе). Иммерсионды объективпен жұмыс істегенде препарат жағылған самырсын майына салады. Самырсын майының сынуға көрсеткіші шыны сыну көрсеткішіне жақын, сондықтан шыны мен объектив линза арасында біркелкі орта қалыптасады. Осыған байланысты барлық сәулелер сынуға ұшырамай және өзінің бағытын езгертпей, объективке түсіп, ұсақ объектілердің көрінуіне жағдай жасайды.

Иммерсионды объективпен мына тәртіппен жүмыс істейді. Дайын тіркелген және боялған бактериялар препараттарын алдымен қүрғақ жүйе объективімен қарау. Онда қолайлы орын тауып, оны 2 жақтан микроскоп зат үстелшесіндегі тіркемелерімен бекітеді.

Микроскоп тубусын көтеріп, револьверді бұрап, иммерсиялық объекті орналастырады. Кейін препарат бетіне зат үстелшесінен алмай, иммерсионды май тамшысын (жиі самырсын майын колданады), тамызып, иммерсионды объективті түсіреді. Бүндай объективті түсіру және майға малуды макрометрлік бұранда кремальерасымен абайлап жасау керек.

Қырынын объектив алдыңғы линзамен май тамшысына түсуін, ырык. препаратты тиістеу керегін қарау. Содан кейін, окулярға қарап, көру бөлінде зерттелген объект көрінгенше макрометрлік винтпен микроскоп тубусын көтеру. Фокусты микрометрлік бүранда арқылы нақтылайды. Бүл микрометрлік бүрандамен кейін әр уақытта препаратты тануда қодцанылады. Сол кезде конденсор диафрагмасын ашып жарық түсіруді арттыру.

Иммерсионды объективтің толық күшін пайдалану үшін иммерсионды майды немесе суды конденсордың жоғарғы линза бетіне жағады.

Жүмыстан соң самырсын майынан объектив пен кондесорды тазалайды. Алдымен майды фильтрлейді қағаз кесіндісімен сүртіп, содан соң тазаланған бензинде малынған пгүберекпен сүртіледі. Ксилол мен спиртті қолдануға болмайды, өйткні, объектив линзаларының бүлінуіне әкеліп соғады.


Зертханалық жұмыс №2

Тақырып: Бактериялардың морфологиясы
Мақсаты: Студенттерді микроорганизмдер клеткасындағы қор заттары мен кажулаларының боялу әдісімен таныстыру

Материалдар және құрал-жабдыктар

Жабынды шыны, микробиологиялық ілмек, спирт шамы, пинцет, суы бар тамызғыш, бояғыштардьщ сулы ерітінділері (фуксин, метиленді көк, генцианвиолет), суы бар шайғыш, препараттарға арналған шыны көпіршесі бар кристаллизатор, сүзгіш қағаздың жолақтары, микроскоп, микроағзалардың таза культурасы, табиғи материалдардан (ет, балық, үн, көкөніс, көң т.б.) жасалған түнбалар.

Бактериялар микроағзалардың ең кең және әртүрлі болып келетін топ. Бактеряялар көбінесе жасушаның көлденең бөліну арқылы көбейетін біржасушалы ағзалар. Морфологиялық жағынан бактерияларды пішініне, мөлшеріне, жасушалардың өзара орналасуына, талшыктардьщ және капсулалардың бар жоғына, жасушаньщ спора түзу қабілетіне қарай ажыратылады.

Пішініне қарай бактериялар 3 топка бөлінеді: шар тәріздес, таяқша тәріздес және иірілген.

Дұрыс шар тәріздес пішінімен катар жасушалар сопақ немесе кандауырша тәріздес (пневмококктар) немесе бүршақ тәріздес (гонококктар, менингококктар) болады. Шар тәріздес бактериялар кебінесе талшықтары болмайды, қозғалмайды және спораларды түзбейді.

Таяқша тәріздес микроағзалардьщ көбі - спора түзбейтін формалары, олар бактериялар деп аталады (Bacterium, Bact. немесе В. деп белгіленеді). Қолайсыз жағдайларда спора түзе алатын таякша тәріздес бактериялар бациллалар (Bacillus, Вас. деп белгіленеді). Бактериялар мен бациллалар жалғыз, жүптасьга немесе тізбек (стрептобактериялар мен стрепто- бациллалар) құрап орналасады. Таякша тәріздес бактериялар арасьшда сапрофита де, патогенді де түрлері кездеседі.

Бактериялардың морфологиясьш зерттеу үшін әртүрлі табиғи материалдардан жасалған түнбаларды дайындау керек: ет, балық, үн, көкөніс, көң, жүмыртқаның ақуызы, жемістер т.б. Материаддардың шағын мөлшерін ұсақтап, кішкентай шыныға салады. Қандауыр кескіш үшына борды салып, су құбырынан суды шынының 2/3 көлеміне қүю керек. Түнбасы бар шыныны термостатта 25-28°С немесе жылы бөлмеде қараңғыда 3-5 күн үстау керек. Осы уақытта ортада бактериялардың көп түрі жинақталады.

Табиғи материалдардың түнбаларымен қатар, бактериялардың морфологиясын культуралардьщ шағын топтарын зерттеуде пайдалануға ьщғайлы. Таза культуралардьщ құрамында бактериялардың мына түрлерінщ болуы ыңғайлы:

Микрококктар - Micrococcus roseus, M. luteus;

Диплококктар - Azotobacter chroococcum, Az. vinelandii;

Стрептококктар - Streptococcus lactis, St. cremoris;

Сарциналар - Sarcina maxima;

Бактериялар - Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris;

Achromobacter prodigiosu.-

Бациллалар - Bacillus subtilis, Вас. cereus;

Вибриондар - Cellvibrio;

Спириллдер - Spirillum volutans.

Бактериялардьщ морфологиясын зертгеуді түнбасының біреуіндегі (ет, балық, көңнің түнбасы морфологиясына ең бай) {ікроағзаларын микроскоптаудан бастау керек. Тұнбаньщ сұйыктығынан бір мезгілде 2 препарат дайындайды (жұғьга). Тіршілік _кезеңіндегі препаратты ВИ-40 объективті қолданьш микроскоптайды; объективімен қарайды. Препараттарды караған кезде микроағзалардың пішініне, жасушалардың өзара орналасуьгаа және бактериялардьщ мөлшерінің микроскоптың әртүрлі үлкейтудегі аракатынасына назар аударып сурет салу.

Бактериялардьщ қозғалысын зерттеу үшін тіршілік кезеңіндегі дрепаратты микроскоптың караңғы белігінде микроскоптау ,кзксығырақ болады.

Бактериялардьщ морфологиялық әртүрлілігі туралы үлкен эсер кзлдыратын кез келген тұнба материальгаан жасалған теріс-қара _сцялы препарат болып табылады. Препаратгы МИ-90 объективті ₀ядаяьш микроскоптайды. Қара сияньщ фоньшда пішіні, мөлшері яртүрл' және әртүрлі сәйкестікте орналасқан микроағзалардьщ боялмаған жасушалары микроскоптан карағанда керінеді.

Бактериялардьщ морфологиялық топтарын анығырақ зерттеу щін таза немесе жинақталған культуралардан жасалған тұрақты микробиологиялық препараттарды дайындайды.

Таза культуралардың жиынтығы болмаған кезде, бактерияларды морфологиясын зерттеу үшін Петри шынысында пластинкасына ауадан себілген микроағзалардың колониясын қолдаяуға болады. Әдетте, ауадан Micrococcus, Sarcina, Bacterium, a_acillus тұқымдастардың өкілдерін алады.

Стрептококктарды қарау үшін, ашытылған сүттен жасалған тамдардың жүғынды қолданылады. Вибриондар мен филлалармен танысу үшін көң тұнбасы мен тоспа судан жасалғанынды карайды.

Микроорганизмдердің морфологиясыи зерттеу бойынша жүргізілген жұмыс нәтижесін кестге енгізу.
МИКРООРГАНИЗМДЕРДІҢ МОРФОЛОГИЯСЫ

Жабынды және заттық шынылар, препаратгау инелері, пинцеттер, микробиологиялық ілмек, спирт шамы, Петри шынылары, аш агар, топырақ үңтақтарын себуге арналған елек, топырақ, тегіс жиекті пробирка, 70-80%-ті уксус қьшщылы, аммиактың іздері бар 60%-тік этанол, стерильді суы бар колба, фуксин немесе генцианвиолеттің судағы 1%-ті ерітіндісі, шыны шпатель, 0,1 мл-ге микропипеткалар, 1 және 10 мл-ге пипеткалар, крахмалды-аммиакты агар (КАА), МПА немесе КАА-ғы актиномицеттердің таза культуралары.КАА-ның құрамы (дистильденген судьщ г/л): (NH4)₂S0₄ - 2.0; К₂НРО₄-1.0; MgSO₄-1.0; NaCl-1.0; бор -10,0; агар- 18,0 КАА-ны дайындау: тұздарды ерітіп, борды қосады. Осы кезде судьщ шағын мелшерін қалдырып, онда крахмалды жақсылап араластырады. Дайьгадалған ерітінді қайнатып, үнемі араластырып, оған крахмалды құяды. Ортаны агарландырады, тауық жұмыртқасьгаьщ ақуызымен жарықтандырып, автоклавада стерильдейді.

Бергенің (1980) анықтауышьшда актиномицеттер Streptomycetaceae тұқымдасының 17-ші топқа жатқызылды. Актиномицеттер - бактериялар мен зен саңырауқүлақтардың

Актиномицеттердің титік өкілдері жақсы керінетін мицелийі бар. Зең саңырауқұлактарға қарағанда, актиномицеттердің мицелийі белінбеген және біралып, ете бұтақталатын жасушадан тұрады. Актиномицеттердің гифтердің диаметрінен шамамен 10 есе аз.

Актиномицеттердщ мицелийдің жасуша қабьпсшасы құрылысы жағынан жақсы граммды бактериялардың қабыкшасымен ұқсас. Ол ақуызды, липидті және мукополисахаридті компонештерден түзілген, қабықшаньщ қалыңдығы 0,01-0,03 мкм. Кейбір актиномицеттердің қабыкпгасында тейхойды қышқылдар астында цитоплазмалык мембрана орналасады. Ол зат алмасу процесстері мен спораларды тузуге белсенді қатысады. Ультрамикроскоптық анализ кезінде актиномицеттердің цитоплазмасында цитоплазмалық мембранамен байланыскан, жіңішке мембраналық құрылымы бар мезосомалар керінеді. Актиномицеттер мицелийінің цитоплазмасы, әсіресе кәрі культураларда тұрпайы дәнді құрылыты болады. Онда еритін және ерімейтін полифосфаттар, полисахаридтер, ал кейбір түрлерінде майлы заттар байқалған.Ортаның құррамы мен өсу жағдайларына байланысты актиномицетгердің цитоплазмасында полифосфаттар мен РНҚ-дан тұратын волютиннің дәндері жиналады. Кейде актиномицеттердің цитоплазмасьшда ұсақ және ірі көпіршіктер ретінде вакуольдер пайда болады. Культураның қартаюы кезінде қорға жиналған заттардьвд орнында вакуольдер пайда болады деген болжам бар.

Актиномицеттердіц ядролык заты кабаттанған жішпелерден құралған жіңішке тордан тұрады. Онда ядролық мембрана жоқ және цитоплазмадан бөлінбеген. Жекелеген ядроның болуы актиномицеттерді зең саңырауқұлақтардан ерекшелендіреді де, бактериялармен жақындастырады.

Актиномицеттердің колониялары тығыз болады да, микробиологиялық ілмекпен алынбайды. Олар қатпарлы, кедір-бұдырлы, кабыршақты, сирек тегіс, түссіз немесе пигменттелген болады. Колониялардың түсі кек, күлгін, қызыл, сары, ашық қызыл, жасыл т.б. болады. Кейде актиномицеттер пигментті сыртка бөліп, субстратты бұл түске бояйды. Актиномицеттердщ колониялары берік болып субстратпен бірігіп кеткен. Субстраттьщ ішінде орналаскан мицелийдін бөлігін субстратты мицелий деп атайды. Субстраттан тыс орналасқан мицелийдің жігапелерден гифтер түзіліп, ауа мицелийін қалыптастырады. Актиномицеттердің көбінде колонияньщ бір белігін немесе барлық бетін ұнды, үлпілдек карадақпен жабатын жаксы дамыған ауа мицелийі бар. Тусі бойынша ауа мицелийі ақ немесе сүр, сирек жасыл, қызғылт, қоңыр, көкшіл туске боялады.

Ауа мицелийдің жіпшелерінде тұқым таситьш мүшелер –споралары бар споратасығыштар. Актиномицеттердің споратасығышгарды орналасуы мен құрылысы бойынша ажыратады. Қүрылысы жағынан споратасығыштар тік, ұзын немесе қысқа, бұйра және 1-ден 10 иірімге дейін не одан да кеп иірімдері бар спиральды иірілген болады. Иірімдердің спиралі қысыңкы немесе созылыңқы болуы мүмкін. Ауз мипелийдің гифтерінде споратасығыштар сатылап, мутовчато, супротивно, шок; тәрізді болып орналасады.

Споратасығыштарда споралар үзінділеу немесе сегменттеу типімен қалыптасады. Үзінділеу кезінде споратасығыш гифаньщ адролық заты түйірлерге ыдырап, олардың айналасында цитоплазма шоғырланады. Әрбір осындай фрагмент өзіндік қабықшасымен қапталыньш, піскен спораға айналады. Сегменттеу кезінде споратасығыш гифаның цитоплазмалық мембранасы дөцес форма түзейді. Осы дөңес форма споратасығышты перегородкалармен болашақта споралар болатын біртекті жасушаларға бөледі. Споралар піскенде споратасығыш ыдырап споралар шаншлады.

Споралардьщ шар тәрізді, таяқша тәрізді, цилиндрлі және алмұрт тәрізді пішіндері ажыратылады. Споралар кабықшасының беті тегіс, кедір-бүдырлы, шаш тәрізді және қалқашпа болуы мүмкін. Актиномицеттердің споралары қоршаған ортаньщ қолайсыз жағдайларына салыстырмалы түрде төзімді, бірақ бактериялардьщ спораларына қарағанда төзімділігі төиендеу. Қолайлы жағдайларға тусіп, актиномицеттердің споралары жаңа мицелийге өседі де, болашақта колонияларды қалыптастырады. Спораның өнуі бірнеше жерлерден басталады. Актиномицеттер споралармен көбеюмен қатар, мицелийдің үзіңділері арқылы да көбейе алады.

Споратасығыштардьщ орналасуы мен құрылысы, спора тузудің типі, споралардың мөлшері мен пішіні, спора қабықшасының беті актиномицеттердің систематикалык орналасуын анықтау кезінде диагностикалық белгілер болып табылады.

Актиномицеттер топырақта, суда, өсімдік пен жануарлар қаддықтарында кең таралған. Актиномицеттер қоректік орталарда жақсы өседі, минералды азотты, әртүрлі көмірсуларды (қантгар, крахмал, декстрин), сонымен қатар органикалық қышқылдар, майларды май тәріздес қосылыстарды жақсы қорыгады. Олар күрделі қосылыстарды: жасымықты, парафинд, балауызды, хитинді т.б. белсенді ыдыратады. Актиномицетгердіц көбі антибиотиктік заттардың, витаминдердің, биотиннің, фомий қышқылының, никотин қышқылынын, ауксинні продуценті болып табылады.

Актиномицеттерді зерттеу үшін топырақ ұңтақтарьга Петри шынылардағы аш агардьщ пластинкаларына себеді.

8-10 тәліктен кейін топьфақ бөлшектерінің айналасында актиномицеттердің колониялары дамиды. Тегіс жиекті пробиркамен актиномицеттердің колониялармен бірге олардың бөліктерін кеседі де, заттық шыныға апарьга, кішкентай үлкейтулерде (объектив 8-20х) қарайды. Осьгадай материалда ақшыл, мөлдір субстратты мицелий жақсы керінеді, ауа мицелийдің гифтері анық керінеді, споратасығьпптардьщ орналасуы мен құрылысы.

Актиномицеттерді анығырак зерттеу үшін КАА-да өсірілген колонияларды қолдану жөн. Петри шыныларда КАА пластинкаларында 1 тамшыдан немесе 0,1 мл. 3-4 өсудің топырақ суспензиясын (өсірудің әдістемесі 23-ші жұмыста) есіреді. 8-10 тәліктен кейін КАА-ның бетінде актиномицеттердщ колониялары өсіп шығады. Тегіс жиекті пробиркамен актиномицеттердің колониялармен КАА-ның бөлігін кеседі де оны предметное шыныға әйнекке салып, микроскоптьщ кішкентай үлкейтулерде микроскоптайды. Колонияның сипатын қүрастырады.

Тіршілік кезіндегі препаратты дайьшдау үшін агардың бөлшегімен бірге колонияньщ бір бөлігін екінші заттық шьшыға 70-80%-ті сірке кышкылына немесе 60%-ті аммиактың іздері бар этанол тамшысына салады. Актиномицеттердің колониялары суланбайтындығын ескерген жөн. Актиномицеттердің колониясынан алынған материадды препараттау инелерімен жазып, жабынды шынымен жабады да, ВИ-40 объективті қолданып микроскоптайды. Препаратта мицелийдің үзінділері мен споратаситын гифтер көрінеді.

Спораларды түзу типін, пішінін және мелшерін зерттеу ушін тұрақты препараттарды дайындау керек - актиномицеттердің колониялардың таңбасы. Препарат таңбасы дайындау үшін актиномицеттер колониясының бетіне шыныны тығыз басады. Таңбасы ауада құрғатады, отга бекітеді, фуксин немесе генцианвиолетпен бояйды да, сумен шаяды. Жабынды шыныны заттық шыныға су тамшысына таңбасыны тоиен қаратьш қояды. Препаратты МИ-90 объективті қолданып микроскоптайды. Микроскопқа карағанда мицелийдін үзінділері, споратасығыштардьщ қүрылысы, споралардьщ түзілу типі, споралардың мөлшері мен пішіні жақсы көрінеді.

Актиномицеттерді зерттеу ушін Петри шыныларда МПА немесе КАА пластинкаларда осірілген таза культураларын қолдануға болады (Actinomyces griseus, Act. flava, Act. chromogenes т.б.).