Противоопухолевые свойства автономного электростимулятора желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек

Противоопухолевые свойства автономного электростимулятора желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек (АЭС ЖКТ и СО) в культуре клеток.

     Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги крыс, асцитная лимфома EL-4 и саркома МСА/77-23 (клон Н). Культуры опухолевых клеток были любезно предоставлены для работы Джексоновской лабораторией, США. Опухоли перевивались на 8-10 недельных мышах линии C57BL/6J (H-2k).

     Основные методы исследования.

     Выделение перитонеальных макрофагов.

     Клетки перитонеального экссудата выделяли по общепринятой методике с незначительными модификациями. Крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, вводили внутрибрюшинно 5-10 мл подогрето до 37°С раствора Хенкса, брюшную стенку массировали в течение 3-5 минут и вскрывали ножницами. Содержимое брюшной полости отсасывали пастеровской пипеткой и вносили в центрифужные пробирки. Центрифугировали в течение 10 мин при 150xg для осаждения клеточных элементов. Осадок клеток трижды промывали большими объемами холодного раствора Хенкса с 10% сывороткой теленка, инактивированной нагреванием. Клетки хранили при температуре тающего льда и использовали для исследований в течение 4 часов после процедуры изолирования.

     Продукцию свободных радикалов кислорода макрофагами оценивали по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (спонтанной и активированной частицами латекса). При проведении анализа 5х10⁵ макрофагов помещали в среду, содержащую раствор Хенкса и 5М люминола и люцигенина, в специальную полистироловую кювету хемилюминометра ЛКБ мод. 1251. Измерения интенсивности люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции проводили в режиме постоянного перемешивания содержимого измерительной кюветы при постоянной температуре 37°С. Условия инкубирования, измерения и представления результатов контролировались с помощью встроенного компьютера. Регистрировали интенсивность спонтанного свечения в суспензии макрофагов в течение 3 минут, затем, не нарушая светоизоляции системы, вносили суспензию частиц латекса (0,1%) и измеряли максимальную величину хемилюминесцентного ответа на активатов (данная величина определялась как разница между интенсивностью активированного и спонтанного свечения клеток.) При исследовании эффектов АЭС на продукцию кислородных радикалов фагоцитирующими клеткаи, АЭС помещали в культуру макрофагов и производили отбор клеток для анализа через 30, 60, 120 и 180 минут. В контрольную культуру помещали неработающий АЭС.

     Продукцию фактора некроза опухолей (-ТНФ) перитонеальными макрофагами определяли с помощью иммуноферментного метода, используя специальные наборы (КИТ) для специфического выявления микроколичеств -ТНФ. АЭС помещали в культуру макрофагов на 1,2 и 2,5 часа, а продукцию -ТНФ меряли через 24 часа инкубации клеток в стерильных условиях.

     Культивирование опухолевых клеток.

     Клетки EL-4 и МСА/77-23 культивировали в 24-луночных планшетах (Costar) в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки, буфер HERES, L-глютамин, незаменимые аминокислоты, пируват натрия, антибиотики и 2-меркаптоэтанол. В различные сроки после начала культивирования определяли уровень включения 3_Н-тимидина, для чего клетки переносили в 96-луночные планшеты (NUNC) по 50 тыс. клеток на 1 лунку, добавляли 1,5 Ci 3_Н-тимидина и культивировали в течение 1 часа. После этого клетки с помощью харвестера переносили на фильтр и определяли уровень радиоактивности с помощью бета-счетчика (Beckman). Первоначально было установлено, что максимальное количество 3_Н-тимидина включается в клетки лимфомы EL-4 на 2-сутки и в клетки саркомы МСА/77-23 на 4-5 сутки после начала культивирования.

     Для определения противоопухолевой активности АЭС ЭКТ и СО клетки лимфомы и саркомы культивировали в 6-луночных планшетах в объеме 8 мл культуральной среды с концетрацией клеток 3,5 — 4 х 10⁵ клеток/мл. В опытную лунку помещали исправный АЭС, в контрольную — поврежденный неработающий АЭС. Через 1, 6 и 24 часа клетки ресуспендировали непосредственно в лунках и забирали часть суспензии для определения параметров их функционирования и структурной целостности.

     Методы определения параметров функционирования и структурной целостности опухолевых клеток.

     Оценку жизнеспособности клеток в культуре определяли по окраске витальным красителем трипановым синим, для чего добавляли к культуре 5%-ный раствор красителя и через 5 минут микроскопически определяли количестов окрашенных нежизнеспособных клеток. Вычисляли процентное содержание неокрашенных (жизнеспособных) клеток в культуре.

     Интенсивность синтеза ДНК в опухолевых клетках определяли по включению 3_Н-тимидина, для чего 5х10⁴ опухолевых клеток инкубировали в присутствие 1,5 Ci меченого по тритию тимидина в течение 1 часа, переносили клетки на фильтр и определяли уровень радиоактивности на фильтре. Результаты выражали в виде индекса угнетения включения 3_Н-тимидина:

     И = количество импульсов в опытной культуре / количество импульсов в контрольной культуре.

     Каждая точка измерялась в трипликате. Проводили постановку пяти независимых экспериментов. Статистическую обработку результатов проводили методом Стьюдента, приняв 5% в качестве критерия достоверности различий опытных и контрольных результатов.

     Оценку клоногенной активности опухолевых клеток проводили в боросиликонированных капиллярах. Опухолевые клетки в количестве 5х10⁵ клеток/мл в полной среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой смешивали с 0,32% агаром, приготовленном на бидистиллированной воде, и помещали в капилляр. Капилляры инкубировали 14 дней при 37°С в атмосфере 5% СО₂. За колонию принимали скопление не менее 50 опухолевых клеток. Эффективность колониеобразования (ЭКО) оценивали в %.

     ЭКО = (количество колоний / количество высеянных клеток) Х 100%

     Для каждой точки заполняли по три капилляра. Статистический анализ проводили по методу Стьюдента.

     Результаты.

     1. Влияние АЭС ЖКТ и СО на продукцию кислородных радикалов и фактора некроза опухолей перитонеальными макрофагами.

     Совместная культивация АЭС с клетками лимфомы EL-4 и клетками саркомы МСА/77-23 в течение 1, 2 и 6 часов практически не влияла на жизнеспособность опухолевых клеток (Рис. 1а и 2а). К сожалению, через 24 часа инкубации определение жизнеспособности клеток в опытных культурах не представлялось возможным из-за резких изменений среды инкубации клеток под влиянием функционирующего АЭС.

     Пролиферативная активность клеток лимфомы и саркомы значительно снижались под влиянием АЭС ЖКТ и СО через 1 и 6 часов кокультивации (Рис. 1б и 2б). Так индекс угнетения включения тимидина в ДНК составил 1 час воздействия АЭС 0,74 ± 0,06 для клеток мимфомы и 0,8 ± 0,05 для клеток саркомы. Аналогичная величина через 6 часов совместной культивации равнялась 0,5 ± 0,01 (p<0,05) для клеток лимфомы и 0,6 ± 0,04 для клеток саркомы.

     Клонообразующая способность опухолевых клеток под воздействием АЭС ЖКТ и СО изучена на лимфоме El-4 в фазе логарифмического роста опухоли при максимальном включении тимидина в нее. Исходно количестов колоний, образовавшихся в капилляр, было равно 20,0 ± 1,8; ЭКО = 0,04%. Через 1 час количество колоний незначительно снижалось, достигая величины 15,0 ± 1,6; ЭКО = 0,03%. Через 6 часов инкубации количество колоний в опытных капиллярах снижалось до 1-2; ЭКО = 0,0002%. Количество колоний в контрольных капиллярах практически не изменялось в зависимости от времени инкубации и составило соответственно 20,0 ± 1,7; 20,0 ± 1,4; 19,0 ± 1,5; ЭКО = 0,04%. Таким образом, наблюдалось достоверное снижение ЭКО через 6 часов совместной культивации клеток лимфомы с АЭС (p<0,05).

     Заключение.

     Проведенные исследования показали, что автономный электростимулятор АЭС ЖКТ и СО обладает выраженным противоопухолевым эффектом в культурах клеток. Он достоверно снижает пролиферирующую активность клеток солидной и асцитной опухолей в культуре, о чем судили по укнетению включения тимидина в ДНК быстро делящихся опухолевых клеток. Данное угнетение включения предшественников в ДНК не связано, однако, с прямым цитотоксическим действием АЭС ЖКТ и СО, поскольку жизнеспособность опухолевых клеток оставалась практически неизменной. Можно предположить, что слабое электро-магнитное поле, созаваемое АЭС ЖКТ и СО, угентает метаболизм и скорость пролиферации опухолевых клеток, не влияя при этом на проницаемость клеточных мембран. АЭС ЖКТ и СО обладает способностью значительно снижать колониеобразование опухолевых клеток (скорость колониеобразования является показателем, характеризующим скрость матастазирования опухолей и степень их злокачественности). АЭС ЖКТ и СО повышает противоопухолевую активность клеток-фагоцитов (основных клеточных элементов естественного противоопухолевого иммунитета организма), усиливая продукцию ими свободных радикалов кислорода, регистрируемых с помощью люминол-зависимой ХЛ, и увеличивая продукцию клетками фактора некроза опухолей.

Руководитель работ, д.м.н., профессор

Л.Г.Коркина