Разработка системы поиска препаратов для коррекции нарушений Когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук
Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

Сергей Олегович Бачурин
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Георгий Иванович Ковалев

Доктор биологических наук Анатолий Николаевич Иноземцев

Доктор биологических наук, профессор Николай Михайлович Митрохин

Ведущая организация – ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится __________ 2009 года в ____ часов на заседании диссертационного Совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан “_____”_____________ 2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (г. Москва, ул. Балтийская, д. 8).

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Е.А. Вальдман

Характерной тенденцией развития современного общества в большинстве стран мира является увеличение продолжительности жизни и связанное с этим повышение в структуре населения доли лиц пожилого и старческого возраста. Эти процессы видоизменяют удельный вес различных форм патологий в популяции, среди которых доминирующее место занимают нейродегенеративные болезни. Именно поэтому, проблема когнитивных расстройств, в большинстве случаев развивающихся при нейродегенеративных заболеваниях позднего возраста, признается в настоящее время одной из наиболее актуальных и значимых с медико-социальной точки зрения (Иллариошкин, 2007).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте. Ежегодно число больных БА и родственными формами увеличивается на 800 тысяч в Европе и на 360 тысяч в США и Канаде (Brookmeyer et al., 1998; Sykes et al., 2001). К настоящему времени число людей с БА составляет около 20 млн. человек во всем мире, что наносит экономический ущерб, оцениваемый в 100 миллиардов долларов ежегодно (Fillit, Hill, 2005). Проблема старческого слабоумия является исключительно актуальной также и для нашей страны. Анализ эпидемиологических исследований позволяет говорить о том, что общая численность больных БА в России превышает 1 млн. человек (Гаврилова, 2001).

Вместе с тем, в настоящее время в реальной медицинской практике для лечения, в частности, БА широко используется крайне ограниченное число препаратов – всего четыре, три из которых являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы. Все эти препараты обладают рядом побочных свойств. Поэтому создание новых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций является важнейшей задачей современной фармакологии (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 1998; Воронина, Т.А., 2003; Островская Р.У. и др., 2002; Bachurin, 2003; Середенин С.Б. и др., 2006).

Одним из наиболее интенсивно развиваемых в настоящее время направлений создания новых лекарственных средств является поиск потенциаторов АМРА рецепторов и блокаторов NMDA рецепторов глутаматергической системы мозга (Lynch, Gall, 2006; Villmann, Becker, 2007). Неконкурентный блокатор NMDA рецепторов мемантин уже используется для лечения больных БА (Farlow, 2004). В то же время попытки применения других блокаторов NMDA- или потенциаторов АМРА рецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций у человека дают неоднозначные результаты. Потенцируя АМРА рецепторы в опытах in vitro, и улучшая память экспериментальных животных в поведенческих экспериментах, а также у людей-добровольцев, ряд потенциаторов АМРА рецепторов в клинических испытаниях не показывает достоверного улучшения когнитивных функций больных (Goff et al., 2008; Chappel et al., 2007). Безуспешными до сих пор остаются и попытки клинического использования антагонистов NMDA рецепторов (кроме мемантина) (Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou, Turski, 2002; Albensi et al., 2004). Все это делает актуальным выработку системы поиска перспективных соединений среди потенциаторов АМРА- и блокаторов NMDA рецепторов для оптимизации процесса создания новых лекарственных средств.

Цель исследования.

Определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях

1. Изучить влияние ряда эндогенных гормонов и пептидов на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов нейронов мозга млекопитающих.

2. Определить электрофизиологическим методом параметры ответов АМРА и NMDA рецепторов нейронов коры и мозжечка головного мозга млекопитающих на воздействие новых соединений.

3. Исследовать когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений в поведенческих тестах.

4. Изучить нейропротективное и когнитивно-стимулирующее действие отечественного лекарственного препарата димебон и участие глутаматных рецепторов в его реализации.

5. По результатам исследований определить критерии поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

Впервые электрофизиологическим методом показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, в которых ответы NMDA рецепторов на агонисты NMDA и хинолинат, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 значительно отличаются. Полученные результаты, наряду с данными других исследователей, полученными методами молекулярной биологии, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих.

Получены новые данные о механизмах действия ряда эндогенных пептидов на глутаматные рецепторы, свидетельствующие об их способности существенно модулировать работу АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга и тем самым влиять на когнитивные функции и нейродегенеративные процессы.

Впервые выявлено, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) потенцирует токи АМРА рецепторов и блокирует токи NMDA рецепторов. Установлено, что соматостатин аналогичным образом влияет на

ответы АМРА и NMDA рецепторов. Можно предположить, что эти свойства CLIP и соматостатина определяют их важную роль в процессах формирования памяти.

Среди новых представителей химических классов: ациклических производных изотиомочевины (дибензиламинов и изотиомочевин) и N,N-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены вещества, обладающие свойствами позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов и неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. Показано, что соединения-лидеры – IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 – обладают высокими когнитивно-стимулирующими свойствами и низкой токсичностью.

Впервые установлен механизм действия димебона на АМРА и NMDA рецепторы и изучены его переносимость и влияние на отдельные показатели старения у экспериментальных животных при длительном применении.

Установлено, что действие димебона на АМРА и NMDA рецепторы аналогично действию эндогенных пептидов, играющих важную роль в формировании памяти.

Сформулирована система поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов на основе способности веществ одновременно потенцировать АМРА- и блокировать NMDA рецепторы.

Научно-практическая значимость

1. Разработана методология поиска препаратов для коррекции когнитивных функций при нейродегенративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

2. Расширено представительство химических классов позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

3. Показано, что соединения-лидеры – IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 представляют несомненный интерес для дальнейших предклинических испытаний в качестве препаратов для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

4. Показано, что представитель гидрированных пиридо ([4,3-b]) индолов – димебон – помимо высоких когнитивно-стимулирующих и нейропротекторных свойств, обладает также свойствами при длительном применении предупреждать развитие отдельных признаков старения экспериментальных животных.

5. Результаты электрофизиологических и фармакологических исследований димебона легли в основу нормативных материалов и были представлены в Россздравнадзор для получения разрешения на проведение клинических испытаний димебона по новому применению – в качестве средства для лечения БА.

Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи и планов работы, в постановке и проведении экспериментальных исследований, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Результаты исследования и основные положения работы доложены на следующих научных конференциях и съездах: на I Всесоюзном Совещании «Глутаматные рецепторы», Ленинград, 1987; на 7-th Conference of European Neurochemichal Society, Sweden, Stockholm, 1988; на межреспубл. конференции, Волгоград, 1989; на XIY Менделеевском Съезде, Москва, 1989; на 13^rd Int. Congress of the Int. Society for Neurochemistry, Australia, Sydney, 1991; на 3^rd Int. Congress of Compar. Physiol. and Bioch., Tokyo, 1991, на 16-th Meeting of the Int. Society for Neurochemistry, 1997, Boston, USA; на 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, 1997, Eilat, Israel; на 9-th Int. Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, 1998, Martin, Slovakia; на 2-й Российской конф. Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии, 1999, Москва; на 5^th Int. Conf. on Neuroprotective Agents, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA; на III Российской конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга, 2003, Москва; на Конф. «Фундаментальные науки-медицине». Росс. Акад. Наук, Москва, 2003; на XVII^th Int. Symposium on Medicinal Chemistry, 2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden; на Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc: the World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery, 2004, Gif-sur-Yvette, France; на Симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), 2005, Москва; на 7^th Int. Conference “Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases”, Sorento, Italy, 2005; на XIV European Bioenergetics Conference, 2006, Moscow; на 8^th Int. Symposium on Neurobiology and Neuroendocrinology of Aging, Bregenz, Austria, 2006; на 10^th Int. Conf. on Alzheimer’s Disease and Related Disorders, Madrid, Spain, 2006; на III съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению», 2007, С-Петербург; на конференции «Орг. химия для медицины», 2008, Черноголовка.

Исследованы новые соединения 3-х химических классов. Ациклические изотиомочевины были условно разделены на два класса: дибензиламины (N, S-замещенные N'-1-[(гетеро)арил] -N'-[(гетеро)арил] метилизотиомочевины), и алкилизотиомочевины (S-замещенные N-1-[(гетеро)арил]алкил-N’-1-[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины), синтезированные к.х.н. А.Н. Прошиным (ИФАВ РАН); N,N'-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны и производные пирролидинового ряда (аналоги АМПАкина BDP), синтезированы на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова М.И. Лавровым (Зав. кафедрой - академик РАН Н.С. Зефиров).

Исследованы эндогенные вещества: дельта-пептид сна (DSIP) (кат. № 150793, ICN), уридин (кат. № U3750, “Sigma”), мурамиловые пептиды (MDP) (кат. № A9519, “Sigma”), интерлейкин-1β (IL-1β) (кат. № 195774, ICN), кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) (кат. № 152723, ICN), холецистокинин (CCK-4) (кат. № 154544, ICN), соматостатин (кат. № 195505, ICN); производные арахидоновой и докозагексаеновой кислот: амиды арахидоновой (AК) кислоты с дофамином - анандамид (AК-ДA), и этаноламином (AК-ЭA), амид докозогексаеновой кислоты (ДГК) с дофамином (ДГК-ДA), и эфиры ДГК с этиленгликолем (ДГК-ЭГ) и нитроэтиленгликолем (ДГК-НЭГ). Производныe АК и ДГК синтезированы д.х.н., проф. В.В. Безугловым (Институт Биоорганической Химии РАН) и к.х.н. И.В. Серковым (ИФАВ РАН); производные глутаминовой кислоты - фосфорсодержащие аминокарбоновые кислоты – 2-амино-5-фосфонопентановая (АР5) и 2-амино-7-фосфоногептановая (АР7) кислоты, синтезированные к.х.н. В. В. Рагулиным (ИФАВ РАН).

В качестве препаратов сравнения исследованы лекарственные средства: димебон (субстанция, ООО “Органика”), мемантин (М9292, “Sigma”), такрин (№ 154198, ICN), и соединения: циклотиазид (C9847, “Sigma”) и МК-801 (M107, Sigma”).

Для создания на животных экспериментальной модели болезни Альцгеймера использовали нейротоксин AF64A – (1-этил-1[2-гидроксиэтил]азиринидиум хлорид (“Bachem”).

Эксперименты в тесте «Условный рефлекс активного избегания» проведены на 160 крысах самцах популяции Вистар массой 240-280 г.

Эксперименты в тесте «Узнавания новой локализации объекта» проведены на 440 мышах самцах линии C57Bl/6 в возрасте 3-4 месяца.

Эксперименты в тесте «Открытое поле» проведены на 30 мышах самках линии C57Вl/6 в возрасте 27 месяцев.

Хронический эксперимент по изучению переносимости димебона при его длительном применении проведен на 98 мышах-самках линии С57Bl/6 возраста 21 месяц.

Все животные содержались в виварии ИФАВ РАН в стандартных условиях. Световой цикл состоял из 12 часов дня и 12 ночи, день начинался в 6 часов и заканчивался в 18 часов.

Животные получали комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей (экструдированный). Сертификат соответствия № POCC RU. ПР15. В11046.

ГОСТ Р50258-92.

Для измерения трансмембранных токов исследуемых нейронов Пуркинье мозжечка головного мозга крыс и нейронов коры головного мозга крыс, а также культивируемых нейронов гиппокампа крыс нами использован электрофизиологический метод patch-clamp в конфигурации whole cell (Hamill et al., 1980).

Нейроны Пуркинье выделяли из мозжечков 12-16 дневных крыс популяции Вистар. Для выделения использовали модифицированный метод Kaneda et al., (1988). Для выделения нейронов коры головного мозга использовали тот же метод с той лишь разницей, что возраст крыс составлял 7-9 дней, и время инкубации с ферментами составляло 14-16 минут в зависимости от возраста животных.

Культуральные нейроны получали из гиппокампов новорожденных крыс (1-2 суток) способом трипсинизации с последующим пипетированием. Культуральные клетки приготовлялись к.б.н. Н.Н. Лермонтовой и н.с. Т.П. Серковой (ИФАВ РАН).

Для получения трансмембранных токов производили активацию АМРА (α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота) рецепторов аппликацией растворов агонистов этих рецепторов - каиновой кислоты (КК) или глутаминовой кислоты, активацию NMDA рецепторов - аппликацией растворов агониста этих рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) методом быстрой суперфузии растворов.

Для отведения токов использовали боросиликатные микроэлектроды (сопротивление 2,5 – 5,5 мОм). Для регистрации токов использовали прибор EPC-9 (HEKA, Germany). Запись токов осуществлялась при помощи лицензионной программы Pulse (HEKA) на жесткий диск компьютера Pentium-3. Обработка результатов осуществлялась при помощи программы Pulsefit (HEKA).

Экспериментальная модель БА на крысах создавалась внутрижелудочковой инъекцией нейротоксина AF64A, который вызывает селективное разрушение ацетилхолиновых синаптических окончаний с последующей деградацией нейронов и снижением содержания ацетилхолиновых маркеров в гиппокампе и коре головного мозга крыс (Fisher, Hanin, 1986; Walsh, Opello, 1994; Lermontova et al., 1998). Под эфирным наркозом в стереотаксисе крысам в боковые желудочки мозга инъецировали 3 нмоль AF64A в 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости, контрольным крысам вводили 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости.

Действие эндогенных гормонов и пептидов на пресинаптические глутаматные рецепторы определяли при помощи метода захвата ⁴⁵Са²⁺ в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом и NMDА. Синаптосомы коры мозга крыс выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajosh, 1975) из коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) популяции Вистар. Данные эксперименты проводили совместно с н.с. Л.Н. Петровой (ИФАВ РАН).

Исследования по оценке «Условного рефлекса активного избегания» (УРАИ) проведены на крысах с экспериментальной моделью БА по методу Т.А. Ворониной, Р.У. Островской (2005). На следующий день после операции крысам первой группы внутрибрюшинно вводили исследуемые вещества – димебон или IP5051 – в соответствующих дозах и это введение осуществляли ежедневно в течение 12 - 14 дней. Другой группе крыс с холинотоксином AF64A давали физраствор из расчета 0,1 мл/кг веса. Группам сравнения с холинотоксином AF64A вводили антихолинэстеразный препарат такрин или блокатор NMDA рецепторов мемантин. Контрольной интактной группе крыс внутрибрюшинно в течение всего времени эксперимента вводили физраствор. Все крысы в двухкамерной клетке типа Shuttle-box обучались избегать болевого раздражения, подаваемого через электрифицированный пол. Данные эксперименты проводили совместно с к.х.н. Н.В. Лукояновым и к.б.н. Н.Н. Лермонтовой (ИФАВ РАН).

Изучение действия веществ на память осуществляли с помощью теста узнавания объекта (“Object recognition test”) по методу (Gaffan, 1992; Kolb et al., 1994; Steckler et al., 1998). Эксперименты проводили в камере наблюдения, которая изготовлена из непрозрачного органического стекла белого цвета размером 48х38х30 см. В качестве объектов обследования использовали стеклянные флаконы коричневого цвета диаметром 2,7 см и высотой 5,5 см. За 2 – 3 мин. до помещения животного камеру и объекты обследования протирали 85% спиртом. Животных всегда помещали в центр камеры. Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно за 1 час до тренировки. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя. Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Для определения двигательной активности животных, их эмоционального состояния и ориентировочно-исследовательской реакции использовали тест открытого поля по методу Т.А. Ворониной, С.Б. Середенина (2005). Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Состояние органов и тканей животных в длительном эксперименте оценивали с помощью гистологического метода. Для этого у павших животных и у животных в агональном состоянии забирали кусочки из внутренних органов и тканей. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после гистологической проводки заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Данные эксперименты проводили совместно с проф. Л.М. Михалевой (ГУ НИИ морфологии человека РАМН).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excell (версия Windows XP). Представлены средние арифметические и их доверительные интервалы (M±m). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Достоверными принимали различия при р≤0,05. Построение графиков осуществляли также с помощью программы Microsoft Excell.

Фундаментальные исследования, проведенные электрофизиологическим методом patch-clamp на свежевыделенных нейронах коры и гиппокампа головного мозга крыс в конце 80-х годов, показали, что в разных нейронах ответы на агонист NMDA рецепторов NMDA, его эндогенный лиганд хинолиновую кислоту (ХК), соагонист глицин и конкурентные антагонисты АР5 и АР7 существенно варьировали. Обнаружено 4 типа нейронов, в которых сочетания ответов на эти вещества имели устойчивый характер, но существенно отличались друг от друга (Grigoriev et al., 1991а, 1991б; Григорьев и др., 1992, Григорьев, 1993а; 1993б). В нейронах 1 типа возможность генерации токов NMDA и ХК полностью зависела от наличия глицина, АР5 полностью подавляла NMDA- и ХК-активируемые токи, АР7 блокировала токи только на 60%; в нейронах 2 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые не зависели от наличия глицина, АР5 и АР7 полностью блокировали токи NMDA и ХК с глицином и без него; в нейронах 3 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые глицин существенно потенцировал, АР5 и АР7 обе почти одинаково блокировали токи обоих агонистов на 40-70%; в нейронах 4 типа NMDA и ХК без глицина вызывали разные токи, глицин изменял ток NMDA, но не влиял на ток ХК, АР5 не влияла на токи ХК, но блокировала изменение тока NMDA, АР7 блокировала прибавку тока, которую давал глицин, и частично подавляла ток без глицина.

Одновременно в ведущих лабораториях мира методами молекулярной биологии были выделены mРНК субъединиц NMDA рецепторов. Было установлено, что имеются два основных типа субъединиц: NR1 и NR2, но субъединиц NR2 имеется 4 подтипа – NR2A, NR2B, NR2C и NR2D (Holmann, Heineman, 1994). Полученные методом реконструкции 4 типа NMDA рецепторов, состоящие из двух NR1 и двух каких-либо NR2(Х) субъединиц имели существенные отличия в своих функциональных и фармакологических свойствах (Buller et al., 1994; Chazot et al., 1994; Monyer et al., 1994; Laurie, Seeburg, 1994; Kendrick et al., 1996; Buller, Monaghan, 1997). В то же время имелось значительное сходство в реакциях этих разнородных NMDA рецепторов с

данными, полученными нами.

Таким образом, полученные нами результаты, наряду с данными других исследователей, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих, что явилось фундаментом для последующего синтеза избирательных и терапевтически перспективных лигандов этих рецепторов.

С целью установления механизмов эндогенной регуляции когнитивных и нейродегенеративных процессов было изучено влияние ряда эндогенных пептидов на АМРА и NMDA рецепторы.

Электрофизиологические эксперименты на нейронах гиппокампа показали, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) вызывает потенциацию ответов АМРА рецепторов в широком диапазоне концентраций (рис. 1). Кроме того, CLIP блокирует ответы постсинаптических NMDA рецепторов, и в определенном диапазоне концентраций блокирует пресинаптические NMDA рецепторы. Особенностью действия CLIP на пресинаптические NMDA рецепторы является то, что он вызывает их блокаду только в очень низких концентрациях – 10^-14–10^-11 М.

Рис. 1. Влияние CLIP на NMDA (1) и КК (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций CLIP в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю %.

Рис. 2. Влияние соматостатина на KK- (1) и NMDA (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций соматостатина в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю в % (контроль=100%).

Установлено, что дельта-сон-вызывающий пептид (DSIP) блокирует постсинаптические NMDA рецепторы. Определенный интерес имеют установленные нами различия в действии DSIP на постсинаптические NMDA рецепторы в нейронах коры и гиппокампа. Начиная с концентрации DSIP 1х10^-13 М, величина ответов в нейронах коры составляет в среднем 40% от контрольных величин. В нейронах гиппокампа его действие несколько отличается: блокирующий эффект наблюдается с концентраций DSIP на порядок выше – 1х10^-12 М – и имеет волнообразный характер. Установлено, что DSIP также оказывает ингибирующее действие на пресинаптические NMDA рецепторы. В то же время DSIP не влияет на ответы АМРА рецепторов.

Уридин вызывал значительную, но не полную блокаду постсинаптических NMDA рецепторов и практически полную концентрационно-зависимую блокаду пресинаптических NMDA рецепторов. Учитывая сомногенное действие уридина, можно предположить, что он играет важную роль в процессах общего торможении ЦНС, и также нейропротекторную роль во время сна (Kimura et al., 2001). Обнаружен небольшой потенцирующий эффект уридина на АМРА рецепторы, но пока не установлена его роль в когнитивных процессах.

Мурамиловые дипептиды (MDP) в наших экспериментах потенцировали АМРА и блокировали NMDA рецепторы. Холестокинин (ССК-4) блокировал захват кальция в узком диапазоне доз - (1х10^-9 – 1х10^-7 М) и в этом отношении его действие похоже на действие интерлейкина 1-β (IL1-β), только последний был на 2 порядка активнее. Эти данные говорят о том, что оба эти вещества в узком диапазоне доз способны модулировать пресинаптические NMDA рецепторы и тем самым нервную возбудимость и пластичность.

Проведенные исследования показали, что производные АК и ДГК в низких концентрациях, в отличие от самих кислот, способны влиять на ответы АМРА рецепторов. AК-ДА, ДГК-ДА и ДГК-ЭГ способны заметно потенцировать трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА рецепторов. ДГК-НЭГ, напротив, вызывает угнетение токов АМРА рецепторов. Полученные результаты подтверждают, что модификация молекулы эндогенного вещества может привести к весьма существенному изменению спектра его физиологической активности.

Наибольший интерес представляют данные о действии CLIP, который оказывает стимулирующее влияние на память во время фазы парадоксального сна, на глутаматные рецепторы (Seidenbecher et al., 1993; Wetzel et al., 2003; Ambrosini et al., 2001; Wetzel et al., 1994), а также соматостатина. Нами впервые установлено, что CLIP и соматоститин потенцируют АМРА рецепторы и блокируют NMDA рецепторы в широком диапазоне концентраций (6 порядков), что является крайне важным для проявления их память-стимулирующего эффекта. Полученные результаты расширяют наши знания о том, как эндогенные соединения могут осуществлять регуляцию когнитивных процессов. Один из таких механизмов может заключаться в модуляции АМРА и NMDA рецепторов.

Анализ полученных результатов в данном разделе работы позволяет заключить, что исследованные эндогенные пептиды играют важную роль в регуляции глутаматергической медиаторной системы мозга. Они действуют в крайне низких концентрациях, начиная с концентрации 1х10^-14 М, концентрационно зависимо и обратимо, что говорит об исключительной специфичности соответствующих рецепторов. Диапазон оказываемого ими влияния на ответы постсинаптических глутаматных рецепторов достаточно узок и, как правило, не превышает 60-70% изменения от уровня контрольных значений.

Таким образом, выявленные параметры модуляции АМРА и NMDA рецепторов эндогенными веществами, в первую очередь CLIP и соматостатином, дают ориентиры для поиска и отбора синтетических соединений в качестве потенциальных терапевтических препаратов. На их основе были разработаны направления синтеза новых соединений в нескольких химических классах.