Сравнительное изучение иммунной активности различных препаратов

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУННОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Определение специфической фармакологической активности иммуномодуляторов проводится в модельных системах (с использованием антигена), количественно характеризующих действие испытуемых препаратов на основные звенья иммунитета, функционирование которых обеспечивает развитие клеточного и гуморального иммунитета.

Основными экспериментальными животными, используемыми в модельных, системах при изучении иммуномодулирующих свойств препаратов, являются мыши ("Методические материалы по экспериментальному испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств". ф. 1984г»), Часть исследований проводится на морских свинках и других видах животных. Изучение иммунного ответа проводится на здоровых половозрелых животных, иммунизированных антигеном внутривенно или внутрибрюшинно в оптимальной или субоптимальной дозе.

Причем, при изучении влияния на антителогенез необходимо учитывать наличие - генного контроля высоты иммунного ответа, поскольку известно, что у высоко реагирующих (мыши линии СВА) и низко реагирующих (мыши линии С57В) генотипов процессы иммуномодуляции происходят по разному.

Как правило, изучение свойств неизвестных иммуностимуляторов проводится в сравнении с общеизвестными, широко используемыми в практике иммуномодуляторами. С этой целью чаще всего применяются тимические факторы, ускоряющие процессы дифференцировки Т-клеток, тем самым усиливая иммунный ответ, увеличивая количество рецепторов на мембранах этих клеток.

Из тимических факторов, как правило, используют «Тактивин», который представляет собой пептид с молекулярной массой 5*200 Д, получаемый из тимуса крупного рогатого скота. «Тактивин» обладает следующими свойствами: восстанавливает Т-клеточный ответ после тимэктомии; усиливает активность Т-хелперов; стимулирует реакции «трансплантат против хозяина»; увеличивает долю клеток, реагирующих на ФГА; т.е. он активирует Т-клетки, ускоряет их дифференцировку; увеличивает число Т-РОК (прямые розетки) путем ускорения реакции созревания протимоцитов в Т-клетки и т.д.

В связи с вышеизложенным, в нашит сравнительных исследованиях был выбран «Тактивин».


ПРОВЕРКА ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТОВ

(В СРАВНЕНИИ С «ТАКТИВИНОМ»)

НА ИММУНОЛОГИЧЕСКУЮ РЕАКТИВНОСТЬ ЖИВОТНЫХ.
В качестве экспериментальной модели были выбраны мыши линии СВА весом 30 г. Антигеном служили эритроциты барана (ЭБ) в концентрации 1*10⁴ (ниже субоптимальной дозы) на физиологическом растворе.

ЭБ вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,3мл.

Отработана оптимальная схема введения препаратов:

дозы, кратность введения, путь введения, отношение к времени иммунизации, проверено влияние препаратов на ход всей кривой иммунного ответа.

Об уровне иммунореактивности животных судили по численности и специфической функциональной активности пула антителообразующих клеток (АОК), формирующегося в селезенке в ответ на внутрибрюшинную иммунизацию эритроцитами барана, а также антиэритроцитарных антител в крови животных.

Подопытным животным одновременно с иммунизацией 1x10⁴ ЭБ пер орально вводили препараты в следующих дозах: «БИЛАКТИН» - 34,3 мг/кг; женьшень(ЖШ)- 220 мг/кг; «БИЛАКТИН» + ЖШ - 254,3 мг/кг; «Тактивин» вводили подкожно одновременно с иммунизацией ЭБ в дозе 1,7 мкг/кг (с 1-й по 4ю – опыт - группы). 5-ой - контрольной группе вводили только ЭБ в оптимальной дозе 1*10⁹ ; 6-ой - контрольной группе вводили только ЭБ в субоптимальной дозе 1*10⁴; 7-ой - контрольной группе вводили 0,3 мл физиологического раствора. При однократной иммунизации испытуемые препараты вводили ежедневно в течение всего периода наблюдения (11-14 дней). «Тактивин» вводили по общепринятой схеме.

Ежедневно, начиная с 3-го дня после иммунизации, у мышей (опытных и контрольных) из подключичной вены брали кровь для получения сыворотки и определения титра антиэритроцитарных антител методом гемагглютинации. У обескровленных животных извлекали селезенки и готовили клеточные суспензии на среде 199. В клеточных суспензиях определяли число АОК методами: 1 - розеткообразования; 2 - локального гемолиза в геле. Кроме того, определяли активность антителообразующих клеток (АОК) в селезенке с помощью модифицированного метода Симпсона, в основе которой лежит степень гемолиза ЭБ, инкубируемых с АОК и комплементом (сывороткой морской свинки).

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ.
Метод розеткообразования.
Принцип метода основан на том, что антителообразущие клетки животных, иммунизированных ксеногенными эритроцитами (ЭБ), способны инвитро фиксировать эти эритроциты на своей поверхности. Получаются так называемые "розетки" с лимфоцитом в центре и прикрепившимися к нему эритроцитами. Клетку считают "образующей розетку" в том случае, если на ее поверхности фиксировано не менее 5 -чужеродных эритроцитов. Расположение эритроцитов может быть различным. Одни клетки окружены полным венчиком из эритроцитов, у других этот венчик имеет разрывы, третьи - сплошь покрыты эритроцитами (розетки в форме морулы), а у некоторых имеется даже по несколько эритроцитарных слоев. Встречаются полярные розетки, в которых эритроциты прикреплены лишь на одном из полюсов клетки, а остальная ее поверхность свободна. Эритроциты прикрепляются к поверхности центральной клетки без участия комплемента.

В основу использованной нами методики положен метод Цальберга.

Среда для культивирования клеток 199; 0,15 М раствор NaCl; забуференный физиологический раствор с рН 7,2 состоящий из 9 частей 0,15 М раствора NaCl и I части фосфатного буфера; трипановый синий (фирма Сигма США); лед. Чашки Петри; глазные скальпели и ножницы, фильтровальные сетки; центрифужные пробирки; шприцы, иглы; холодовая центрифуга К-24 (ГДР), микроскоп; автоматические пипетки; пастеровские пипетки; камеры для подсчета клеток (например – камера Горячева).

Извлечённую иммунную селезёнку отмывают от остатков крови (животное предварительно обескровливается), переносят в чашку Петри на льду, измельчают в среде 199 и затем пропускают через инъекционную иглу № 20 и фильтруют через тонкую дедероновую сеточку.

Суспендированные клетки трижды отмывают культуральной средой, центрифугируя на холоду при 350 об/мин, и готовят взвесь требуемой концентрации. Жизнеспособность клеток полученной суспензии определяют при помощи трипанового синего, который окрашивает погибшие клетки в синий цвет.

Из отмытых клеток на среде 199 готовят суспензию, содержащую 10^ живых клеток в I мл. Эритроциты барана отмывают три раза 0,15 М раствором NаС1 или забуференным физиологическим раствором и готовят из них 5%-ную суспензию (т.е. около 1000000000 клеток в 1 мл). Затем 0,9 мл суспензии клеток исследуемого органа и 0,1 мл суспензии эритроцитов автоматическими пипетками вносят в парные центрифужные пробирки, тщательно перемешивают, центрифугируют 4-5 минут при 200 об/мин и инкубируют в термостате при 37° С в I часа. Центрифугирование способствует образованию розеток, обеспечивая тесный контакт между теми и другими клетками на дне центрифужной пробирки. При инкубации при 37 С часто в центре розетки находят клетки, синтезирующие или, точнее, выделяющие в окружающую среду антитела. Об этом свидетельствует, в частности, увеличение средних размеров розеток при 37°С (в сравнении с проведением реакции при 4°С). Часто эритроциты покрывают центральную клетку в несколько слоев, а в суспензии можно найти эритроцитарные агглютинаты без центральной клетки.

Вместо культуральной среды иногда можно применять солевые растворы, например раствор Хенкса. Величина рН во время инкубации должна оставаться в пределах от 6,8 до 7,5. При рН выше 8 число розеток резко уменьшается.

После однократной иммунизации мышей эритроцитами барана в их селезенках из 10⁶ клеток 10⁴ и более образуют розетки. При исследовании в динамике наблюдается два максимума клеток - первый на 5-й - 6-й день, а второй, примерно, на 10 день после однократной иммунизации. Как правило, второй максимум бывает ниже первого.

Метод розеток, несмотря на ряд замечаний, считается специфическим и весьма чувствительным методой изучения иммунного ответа. Он примерно в 10 раз чувствительнее локального гемолиза в геле и потому дает более высокие фоновые показатели. При этом он не трудоемок и не требует дорогих реагентов.

Принцип метода. Клетки для исследования получают из лимфоидных органов экспериментальных животных, иммунизированных чужеродными эритроцитами, суспендируют в золе агара или агарозы вместе с эритроцитами, которыми проводили иммунизацию. Полученную суспензию тонким слоем распределяют на ровной поверхности. При последующей инкубации из лимфоидных клеток выделяются антитела, они диффундируют в окружающий гель и фиксируются на находящихся поблизости эритроцитах. Добавление комплемента вызывает гемолиз этих эритроцитов. Вокруг клеток, образующих возникают прозрачные пятна, различимые невооруженным глазом на красновато-коричневом фоне геля. Эти пятна - зоны гемолиза. В центре каждой зоны находится клетка, образующая антитела к эритроцитам. Сосчитав число таких зон, можно определить число таких клеток. Зная общее число внесенных в гель лимфоидных клеток, можно рассчитать число клеток, образующих антитела, на 1000000 или на 10000000 и т.д. клеток исследуемого органа.

Увеличение числа продуцентов антител в селезенке мышей, инъецированных препаратом, свидетельствует о стимулирующем действии препарата на антителообразование, снижение их числа - об его угнетающем действии.

В норме среднее число гемолизинобраэующих клеток в селезенке мышей СВА на 5-е сутки после иммунизации 10⁷ эритроцитами барана составляет 160+-7.0 в расчете на 10⁶ спленоцитов.
Приборы и реагенты.

Шприцы и тонкие инъекционные иглы (№20); мелкие дедероновые сеточки; пластиковые чашки Петри диаметром 5см; водяная баня; холодовая центрифуга К-24 (ГДР); горизонтальный столик; прибор подсчета бляшек с подсветкой; термостат на 37°С.

Среда для культуры клеток 199; раствор Хенкса; 0,9% раствор NaCl; очищенный агар (фирмы Сигма); ДЭАЭ-декстран (фирмы Сигма); агароза; 0,5 % раствор трипатового синего (флоу лабораториес); 10% суспензия отмытых бараньих эритроцитов в 0,9% растворе NaCl. Источником комплимента служит свежая сыворотка морской свинки, адсорбированная эритроцитами барана в разведении 1:8 средой 199.
Ход реакции

Подготовка нижнего слоя геля.

Дно чашек Петри заливают сдоем агара, расплавленного и профильтрованного с добавкой ДЭАЭ-декстрана. Для этого готовят 1,4% (вес/объем) агаровый золь и прибавляют в него (1мг на 1 мл) ДЭАЭ-декстран на растворе Хенкса, чтобы нейтрализовать антикомплементарные свойства агара. Величину рН необходимо довести до 7,2-7,4.

Нижним слоем может также служить гель агарозы (как в нашей случае) без добавки ДЭАЭ-декстрана.

Готовили 1% раствор агарозы в среде 199 или растворе Хенкса (вес/объем), растворяли в водяной бане (до полного растворения агарозы) и заливали на дно чашек Петри (расположенных на горизонтальной поверхности) в объеме 3 мл. Чашки оставляли до затвердения придонного слоя агарозы и затем сохраняли в холодильнике 2-3 дня.

Перед нанесением верхнего слоя геля чашки с нижним слоем подогревали до 37°С. Клетки иммунной селезенки готовятся описанным выше методом (на холоду), отмывают трижды при 350 об/мин. и 4°С, затем суспендируют в среде 199 (предварительно определив их жизнеспособность) необходимой концентрации. Для исследований были использованы концентрация спленоцитов 1*10⁷ . Эта концентрация была подобрана в предварительных исследованиях так, чтобы на чашке Петри было не более 200-400 зон гемолиза. Готовую взвесь клеток следует как можно быстрее внести в золь верхнего слоя: она остается годной не больше I часа после приготовления.

Верхний золевый слой также лучше готовить из агарозы - 0,7% (вес/объем) в среде 199 с рН 7,2-7,4. Золь агарозы разливают по 2 (1) мл в бактериологические пробирки и держат в водяной бане при 47-49°С. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл 10% взвеси эритроцитов барана и 0,1мл охлажденной суспензии клеток селезенки.

После перемешивания на ротаторе, чтобы избежать пузырей, содержимое пробирки немедленно выливают на подогретую до 37° С чашку с нижним слоем геля и равномерно распределяют по его поверхности. Чашки следует расположить на строго горизонтальной поверхности, чтобы верхний слой геля был повсюду одинаковой толщины. После затвердения агарозы чашки инкубируют I час при 37°С, а затем сверху наслаивают комплемент морской свинки и инкубируют еще 2-3 часа при 25° С перед окончательным подсчетом бляшек. В качестве контроля использовали предварительно инактивированную нагреванием сыворотку морской свинки (56°С в течение 30 минут). Антибиотики в реакции не применялись, так как селезеночные бактерии у мышей не были обнаружены.

Для подсчёта бляшек гемолиза можно воспользоваться стереоскопической лупой или прибором для подсчета бактериальных колоний. В центре каждой зоны гемолиза должна лежать видимая в микроскоп лимфоидная клетка. Если в этом месте находится несколько клеток, то к образующим антителам относят только одну из них.

Реакция гемагглютинации для определения антител в сыворотке крови

(агглютининов к эритроцитам барана).

Этот метод прямой (гемагглютинации) используется для количественного определения антител в тех случаях, когда нужно изучать иммунный ответ экспериментальных животных на эритроцитарные антигены.

0,9% раствор NaCl; пластиковые планшеты; автоматические пипетки; водяная баня; холодовая центрифуга; термостат; микроскоп; эритроциты барана.

Чтобы исключить иммунный гемолиз, исследуемую сыворотку декомплементируют, термостатируя 30 минут при 56°С. Затем готовят ряд последовательных разведений, каждое из которых смешивают с 2% взвесью эритроцитов барана (предварительно отмытых) и оставляют при комнатной температуре. Когда эритроциты осядут (примерно через два часа), можно учесть результаты реакции при слабом увеличении или невооруженным глазом. При положительной реакции агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки равномерным слоем. При отрицательной реакции все эритроциты собираются в одной точке. Результаты реакции выражают титром антител - величиной, обратной последнему разведению сыворотки, которое еще агглютинирует эритроциты.

Среда 199; физиологический раствор; 0,02 М трис-HCl-буфер;0,14 М NaCl; комплемент морской свинки, эритроциты барана; пластиковые плато или пробирки; термостат; холодовая центрифуга; фотометр.

Клетки селезенки выделяли обычным способом на холоду в среде 199, отмывали трижды физиологическим раствором и смешивали 1 мл содержащий 10000000 клеток/мл с равным объемом 0,2% суспензии эритроцитов барана. Предварительно истощенный против ЭБ комплемент морской свинки разводили в 0,02 М трис-HCL-буфере с 0,14 М NaCl (рН 7,4) и добавляли (1 мл) к взвеси клеток. Через 1,5 часа инкубации при 37°С клетки осаждали центрифугированием. Супернатант переносили и измеряли на спектрофотометре СФ-46 поглощение при 414 нм.

№1 -опытная группа (ЭБ 1x10⁴ + «БИЛАКТИН»);

№2 - опытная группа (ЭБ 1x10⁴ + женьшень);

№3 - опытная группа (ЭБ 1x10⁴ + «БИЛАКТИН» + женьшень);

№4 - опытная группа (ЭБ 1x10⁴ «Тактивин»);

№5 - контрольная группа (ЭБ 1x10⁹);

№6 - контрольная группа (ЭБ 1x10⁴);

№7 - контрольная группа (физ. раствор).

Уже с 3 дня наблюдения проявлялось иммуностимулирующее действие препарата «БИЛАКТИН» (см. рис.1-2 ПРИЛОЖЕНИЯ).

Величина пула антителообразующих клеток (АОК) в селезенке экспериментальных животных (методы розеток и Ерне) под влиянием «БИЛАКТИНа» превышала таковую во всех контрольных группах. Этот препарат был более активен в сравнении с другими испытуемыми препаратами, стимулирующий эффект которых был примерно одинаковым и не отличался от первых 2-х контрольных групп. В сыворотке мышей в низких титрах появились антиэритроцитарные антитела.

Начиная с 4-го дня резко усиливалась специфическая функциональная активность АОК селезенки мышей. С этого же дня в сыворотке мышей начинали возрастать титры специфических гемолизинов.

На 5-ый день наблюдения титры антиэритроцитарных антител в опытных группах значительно превышают таковые в сыворотке мышей контрольных групп (Рис,4). На 5-е сутки достигает своего максимума функциональная активность АОК в селезенках опытных групп мышей (исключая 2-ю группу, где максимум наступает на 6-ой день). (см. рис. 3. ПРИЛОЖЕНИЯ).

Особенно высок этот показатель в 1-й опытной группе («БИЛАКТИН») и продолжает оставаться высоким в течение последующих 2-х дней (6-го и 7-го).

На 6 сутки наблюдения отмечаются высокие значения пула АОК в селезенках мышей 2-й и 3-й группы (максимальные показатели этих групп). Лишь в 4-й группе (ТАК) отмечается резкое снижение пула АОК. (см. рис.1-2 ПРИЛОЖЕНИЯ).

Определяется резкий подъем титров гемолизинов в сыворотке мышей всех опытных групп (исключая группу с «Тактивином», где отмечается незначительное увеличение титров антител). (см. рис.4 ПРИЛОЖЕНИЯ)

Высокие значения количества АТ в первых 3-х группах остаются в течение 7-го и 8-го дней. На 6-й день достигает максимальных показателей активность пула АОК во второй опытной группе (женьшень).

Для 7 дня характерно, прежде всего, падение количества АОК в селезенках всех опытных групп (см. рис.1-2 ПРИЛОЖЕНИЯ).

На 6-й, 7-й дни достигает максимума величина пула АОК в иммунных контролях (5-я, 6-я группы).

На 9 день отмечается вторая волна максимума пула АОК в селезенках мышей 1-й и 3-й групп (Рис. 1, 2). Во 2-ой группе имеет место лишь незначительное возрастание количества АОК селезенки. С этого же дня начинает снова возрастать функциональная активность АОК селезенки 1-й и 3 групп мышей, достигая второго максимума к 10 дню наблюдения (Рис.3). Необходимо отметить, что все эти показатели более всего выражены в 1-й опытной группе («БИЛАКТИН»), значительно меньше - во 2-ой (женьшень) и менее всего в 4-й («Тактивин»).

В последующие 11-й, 12-й, 13-й и 14-й дни происходит постепенное снижение активности АОК селезенки во всех группах, а также величины пула АОК у этих животных (см. рис.1- 2 ПРИЛОЖЕНИЯ).

ВЫВОДЫ

1. 
   Исследованные препараты – «БИЛАКТИН», женьшень, «БИЛАКТИН» + женьшень, являются выраженными иммуноактиваторами.
   
2. 
   Иммуностимулирующее действие изученных препаратов существенно выше, чем у «Тактивин»а.
   
3. 
   Препарат «БИЛАКТИН» обладает более мощным иммуноактивирующим эффектом, чем препарат женьшеня и «Тактивин».
   
4. 
   Иммуностимулирующая активность препаратов «БИЛАКТИН» и женьшень не суммируется. Можно утверждать, что препарат женьшень частично угнетает биологическую активность «БИЛАКТИН»а.
   
5. 
   После первого пика иммунной стимуляции препараты «БИЛАКТИН» и «БИЛАКТИН» + женьшень в короткие сроки вызывают повторный максимум иммуноактивности по типу вторичного иммунного ответа (в отсутствии повторной иммунизации). Препарат женьшень практически не обладает таким эффектом.
   
6. 
   Нарастание специфических антител на 12-й, 13-й дни эксперимента без введения в этот срок препаратов животным свидетельствует о стимуляции клеток иммунной памяти, что имеет место при вторичном иммунном ответе.