В культуру in vitro крокуса алатауского Crocus alatavicus L

Жұмыстың мақсаты Қазақстан Флорасының эндемик Crocus alatavicus түрінің микроклондық көбейту технологияларын өңдеу үшін оқшауланған ұлпаларын in vitro жағдайына енгізу және өсіру ерекшеліктерін зерттеу болып табылады. Оқшауланған ұлпа дақылдарында алатау бәйшешегінің регенерация және морфогенез ерекшеліктері зерттелді. Морфогенетикалық реакциялардың бастапқы өсімдіктің даму фазасына, біріншілік экспланттың табиғаты мен физиологиялық күйіне тәуелділігі анықталды. Регенерация процестері жаңарған төбе бүршіктерінің белсенді өсуі, өркен негізінде адвентивті бүршіктердің және түйнек кескіндерінде каллус ұлпаларының қалыптасу жолымен өтетіні анықталды.

D.N. Satybaldiyeva, S.V. Nam, V.K. Mursaliyeva, B.K. Zayadan, R.M. Mammadov

По жизненной форме крокусы являются геофитами с эфемероидным циклом развития. Формирование геофитного габитуса и образование подземных запасающих органов, защищающих почки возобновления, позволило выработать у данных растений своеобразные приспособительные реакции и механизмы устойчивости к неблагоприятным условиям внешней среды. В связи с этим дикорастущие крокусы обладают высоким биологическим и экономическим потенциалом, что обуславливает перспективность их использования в селекции в качестве источников ценных генов при выведении новых сортов и форм [2].

На территории Казахстана произрастают крокус алатауский C. alatavicus Regel et Semen. и крокус Королькова С. korolkowii Regel et Maw [3].

Крокус алатауский C. alatavicus – высокодекоративное растение, ценное очень ранним цветением и легкостью культивирования. В природной флоре Казахстана приозрастает в Джунгарском и Заилийском Алатау, Каратау. Охраняется в заповедниках Аксу-Джабаглы и Алматинском, ботанических заказниках Беркара и Каракунуз, национальных природных парках Иле-Алатау и Алтын-Эмель [4].

В настоящее время в результате хозяйственной деятельности человека оба вида находятся под угрозой исчезновения и занесены Постановлением Правительства РК в ''Перечень редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений'' [5].

В мировой практике для сохранения эндемичных видов применяются два подхода: in situ – сохранение природных популяций в естественных местообитаниях; ex situ – хранение гермоплазмы в банке семян и выращивание в живых коллекциях в условиях интродукции. Проведенный патентный поиск по теме исследований показал перспективность использования метода культуры тканей для сохранения и повышения продуктивности ценных видов крокуса [6, 7]. Но различные виды и даже сорта одной и той же культуры требуют особых условий выращивания, и поэтому необходима разработка индивидуальных подходов к их культивированию.

Целью исследований являлось изучение особенностей введения и культивирования in vitro изолированных эксплантов C. alatavicus для разработки технологии микроклонального размножения эндемичного вида Флоры Казахстана.

Образцы растений крокуса алатауского C. alatavicus были собраны на территории Алматинской области на фазе цветения в конце марта - начале апреля.

Методика культивирования эксплантов и приготовления питательных сред общепринятая [8]. Исходным материалом служили клубнелуковицы маточных растений, взятые из природных мест произрастания. В качестве эксплантов использованы сегменты клубнелуковиц, цветочные почки, различные части цветка, листьев и др. Экспланты вводились в асептические условия в марте во время цветения маточных растений и после их вегетации на этапе перехода вновь образованных клубнелуковиц к глубокому покою.

Для получения асептической культуры в качестве стерилизующих агентов использовали 70% этиловый спирт, 50 % р-р Доместос и 0,1 % р-р сулемы HgCl₂ и др. После стерилизации в асептических условиях каждую клубнелуковицу делили на 4-5 сегментов размером 0,5-1 см, которые далее высаживали на питательную среду с внесением различных концентраций регуляторов роста.

Для введения в культуру in vitro были использованы варианты среды Мурасиге и Скуга (МС) с различными концентрациями и сочетаниями фитогормонов: 6-бензиламинопурин (БАП), нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д), индолилмасляная кислота (ИМК), кинетин.

Для культуры изолированных пыльников использовали среду МС с внесением глютамина 400 мг/л, смеси аминокислот 100 мг/л, НУК 10 мг/л, БАП 1 мг/л и повышенный уровень сахароза 45 %. Для индукции клубнеобразования использовали варианты среды с повышенным уровнем сахарозы.

Пробирочный материал с эксплантами содержали в темноте при 22^о С, экспланты листьев в условиях освещения при температуре 25^о С. Дальнейший рост и развитие оценивали по частоте каллусогенеза, количеству эксплантов с развившимися побегами и/или микролуковицами, количество микролуковиц или побегов на экспланте.

Результаты и их обсуждение

Выявлено, что способностью к регенерации и каллусогенезу обладают экспланты изолированные от молодых, вновь образованных клубнелуковиц при их культивировании сразу после выкопки, в середине июля. На них отмечалось одновременное образование каллуса и развитие дополнительных побегов. Прямая регенерация побегов на эксплантах происходила за счет активации роста пазушных почек, локализованных на поверхности клубнелуковиц в результате индуцирующего действия цитокинина БАП. Количество побегов варьировало от 2 до 5 на одном экспланте.

Установлено, что количество полученных побегов на первичных эксплантов в течение первого пассажа зависит от гормонального состава питательной среды. Максимальное количество побегов 14 штук было получено при культивировании эксплантов на среде МС с внесением БАП в концентрации 2 мг/л и 0,5 мг/л 2,4 Д. Дополнение среды только БАП в концентрации 6 мг/л привело к регенерации меньшего количества побегов.

Одинаковый эффект на побегообразование выявлен у вариантов которые были одинаковыми по составу фитогормонов, но отличались концентрациями: 2,0 мг/л БАП + 0,1 мг/л 2,4 Д и 1,0 мг/л БАП + 0,25 мг/л 2,4 Д, соответственно.

Формирование каллуса происходило на поверхности среза через три недели культивирования на средах содержащей разные концентрации БАП и 2,4 Д. При дальнейшем пассировании каллуса на те же варианты сред через две недели отмечалось появление адвентивных побегов в каллусной ткани.

Для дальнейшего развития посадочный материал с побегами был перенесён в условия освещения с 16 часовым фотопериодом. В этих условиях через месяц пассирования наблюдалось отрастание побегов белого цвета.

Для индукции корнеобразования полученные побеги были пересажены на варианты среды МС c 3 мг/л БАП +80 г/л сахарозы и МС c 1 мг/л ИМК +50 г/л сахарозы. В ходе культивирования отмечалось утолщение основания побегов и через две недели после пассирования были заметны клубневидные образования с усыхающими покровными чешуями, характерными для клубнелуковиц (рисунок 1).

Отмечено, что оставшиеся ткани исходных эксплантов клубнелуковиц с каллусом после отделения от них регенерированных побегов сохраняли способность к регенерации побегов. При этом, частота геммогенеза при пассировании каллусной ткани на среды БАП и 2,4 Д составляла 29 %.

Отмечено также закладка дополнительных почек у основания полученных побегов при их вторичном пассировании на среду МС с 6 мг/л БАП.

Формирование каллуса отмечено через три месяца культивирования на индуцирующей среде МС, содержащей глютамин, аскорбиновую кислоту, БАП и НУК. При этом частота каллусообразования была низкая и не превышал 9 %. Только у одного из 11 высаженных пыльников в условиях темноты сформировался каллус плотной структуры желтоватого цвета. При дальнейшем пассировании на свежие питательные среды каллус увеличивает свою массу, но морфогенеза не отмечалось.

МС 1 – БАП 2,0 + 2,4 Д 0,5; МС 2 – БАП 2,0 + 2,4 Д 0,1; МС 3 – БАП 1,0 + 2,4 Д 0,25; МС 4 – БАП 6,0 (мг/л)

питательной среды МС

1. 
   Чекурова Г.В., Озерова С.О. Крокусы. – М: Кладезь-Букс, 2007. – 96 с.
   
2. 
   Иващенко А.А. Тюльпаны и другие луковичные растения Казахстана. – Алматы: Две столицы, 2005. – 192 с.
   
3. 
   Красная книга Казахстана. – Алма-Ата: Наука, 1981. – Т. 2.
   
4. 
   Флора Казахстана. – Алма-ата: Издательство Академии наук Казахской ССР, 1958. – Т. 2. – С. 233
   
5. 
   Перечень редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Постановление Правительства Республики Казахстан от 31 октября 2006 года.
   
6. 
   Чуб В.В., Власова Т.А., Бутенко Р.Г. Физиология растений. – М.: Наука, 1994. – Т. 41. –№ 6. – с. 815–820
   
7. 
   Ilahi I., Jabeen M., Firdous N. Morphogenesis with saffron tissue culture // Plant Physiol. – 1987. – №128. – P. 227-232
   
8. 
   Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В, Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наукова думка, 1980. – 487 с.
   

Фамилия: Сатыбалдиева

Имя: Дария

Отчество: Нурбатыровна

Год рождения: 1989

Страна: Казахстан

Организация: КазНУ им. аль-Фараби

Должность: докторант PhD

Учреждение/организация, почтовый адрес с индексом: 050038, Алматы, аль-Фараби 71, факультет биологии и биотехнологии, кафедра биотехнологии

Название направления: Биотехнология

Название статьи: Введение в культуру in vitro крокуса алатауского Crocus alatavicus L.

Название доклада: Crocus alatavicus L. алатау бәйшешегін in vitro жағдайына енгізу

Представление доклада: очное участие на секции

Тел.: 87026133244

Факс: 8(727) 3956748

E-mail: dariya.sat.89@mail.ru

Фамилия: Мурсалиева

Имя: Валентина

Отчество: Кадаматовна

Год рождения: 1964

Страна: Казахстан

Организация: Институт биологии и биотехнологии растений

Ученая степень, ученое звание: кандидат биологических наук

Должность: заведующая лабораторией клонального размножения

Учреждение/организация, почтовый адрес с индексом: 050040, Алматы, ул. Тимирязева 45

Название направления: Биотехнология

Название статьи: Введение в культуру in vitro крокуса алатауского Crocus alatavicus L.

Представление доклада: заочное участие

Тел.: 8(727) 3956748

Факс: 8(727) 3956748

E-mail: gen_mursal@mail.ru