Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus

(при помощи набора для выделения клеточных белков Total Protein Kit фирмы Bio-Rad (“Bio-Rad”, США)).

1. Клетки в количестве 150 млн концентрируют из культуральной среды при помощи фильтровальной установки (“Millipore”, США).

2. Клетки отмывают от среды центрифугированием (7 500 g, 15 мин, MiniSpin, “Eppendorf”, Германия) надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют воду, процедуру повторяют.

3. Осадок клеток растирают до гомогенного состояния в ступке на холоде в течение 5 мин для разрушения прочных кремнистых стенок, контролируя степень разрушения створок под микроскопом (Axiovert 200, “Zeiss”, Германия).

4. Гомогенат переносят в пластиковую пробирку на 1,5 мл и добавляют Total Protein 300 мкл, обрабатывают ультразвуком в течение 4 мин с охлаждением.

5. Осаждают центрифугированием (7 500 g, 30 мин), отбирают супернатант, который в дальнейшем использовали как образец для нанесения на электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

1. Для растворения кремнистого панциря и освобождения связанного с ним органического материала проводят обработку клеток 5М фторидом аммония (NH₄F), pH 5.0, (4^оС, 12 ч) в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз 3 мМ ФМСФ (m/v) и 3 мМ йодуксусной кислоты (m/v).

2. Образовавшийся после центрифугирования (12 100 g, 3 мин) осадок ресуспендируют в 500 мМ Трис-HCl, pH 8.8, и центрифугируют в тех же условиях. Промывку повторяли дважды.

3. Затем осадок обрабатывают ультразвуком и проводят карбоксиметилирование 5 мМ йодуксусной кислотой в 0.25 М Трис-HCl, рН 8.8, в присутствии 3 мМ ФМСФ (1 ч, 4^оС, m/v).

4. Для разрушения дисульфидных связей и солюбилизации белков к осадку добавляют β-меркаптоэтанол до концентрации 52 мМ в 2 %-ном растворе SDS в 0.25 М Трис-HCl, pH 8.8, полученную суспензию перемешивают при 37^оС в течение 12 ч.

5. Для защиты меркапто-групп цистеина белки повторно карбоксиметилируют, добавляя йодуксусную кислоту до концентрации 54 мМ. Смесь центрифугируют при 12 100 g в течение 2 мин и из супернатанта осаждают белки 80% метанолом (v/v) на холоде.

6. Белки растворяют в буфере для нанесения на гель (1% SDS, 10% глицерин, 100 мМ β-меркаптоэтанол, 50 мM Трис-HCl, pH 6.8) и анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ (Петрова и др., 2007).
Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей

1. Клетки в количестве 5-8 х10⁶, концентрируют фильтрованием и промывают трижды 10mM Tris-Cl/1mM CaCl₂ pH 7.4 (TC буфер).

2. После последней промывки, клетки перенесят в ступку и растирают на холоде c TC буфером, полученный гомогенат центрифугируют, супернатант перенесят в отдельную пробирку – TC-экстракт.

3. Клетки промывают пятикратно TC буфером и добавляют 100 mM этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) рН 7.8 и инкубируют 12 ч при комнатной температуре, на качалке.

4. Затем, центрифугируют, собрют супернатант – EDTA-экстракт. Осадок промывают водой трижды и инкубируют 30 мин с 1M NaCl – NaCl-экстракт.

5. Осадок обрабатывают 8 M мочевиной 30 мин, при комнатной температуре, на качалке – эстракт 8 М мочевины.

6. Материал после экстракции трижды промывают водой и мембранные белки экстрагируют 2% SDS при 37^OС, 12 ч, супернатант собирают– SDS-экстракт.

7. Все этапы экстракции проводят в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз: 3 мМ ФМСФ и 3 мМ йодуксусной кислоты (m/v). полученные белковые экстракты концентрируют 80% метанолом (v/v), 10 мин на холоде. Образцы анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ (Frigeri et al, 2006).

1. Культуру клеток S. acus выращивают на среде ДМ. После того, как количество клеток в культуре достигло 896·10⁶, клетки отделяют от среды, как это описывалось раньше.

2. Осадок клеток переносят в пластиковую пробирку и трижды промывают водой.

3. К клеткам (V=500 мкл) добавляют SDS и EDTA, до концентрации 2% и 0,2М, соответственно, перемешивают при помощи пипетирования и инкубируют на водяной бане (t = 95^оC) в течение часа. Центрифугируют (7 500 g, 15 мин) и убирают надосадочную жидкость.

4. Осадок промывают водой и повторяют обработку SDS/EDTA дважды. Полученный осадок после третьего кипячения трижды промывают водой и высушивают до сухого веса (m = 100 мг). После чего к осадку добавляют раствор 2M NH₄F, pH 5.0 до полного растворения створок (V_{конечный}= 56 мл).

5. Полученный раствор диализуют против раствора NH₄F 1% (v/v), c добавлением 3 мМ ФМСФ (m/v) в течение 12 час.

6. Супернатант и осадок, выпавший при диализе, разделяют, центрифугированием (7 500 g, 15 мин).

7. Осадок обрабатывают буфером (2% SDS, 10% глицерин, 5% β- меркаптоэтанол, 0,065 M Трис-HCl pH 6,8) трижды по 5 мин на водяной бане (95^оС), после каждого раза центрифугируют (12 100 g, 3 мин), отбирают супернатант, а осадок заливают новой порцией буфера.

8. В дальнейшем супернатант используют как образец для измерения поглощения на длинах волн 220-300 нм и для ПААГ-электрофореза.

Определение концентрации белка по методу Брэдфорда

1. Для определения концентрации белка по методу Брэдфорда (Bradford, 1976) строится калибровочная кривая стандартного раствора бычьего гамма глобулина (БГГ, 2 мг/мл) Bio-Rad.

2. Подготавливают следующие разведения БГГ: 1000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 61 мкг/мл, 30,6 мкг/мл, 15 мкг/мл и 7,6 мкг/мл. К 50 мкл белкового раствора добавлют 200 мкл реагента Брэдфорда, затем измеряют оптическую плотность при помощи спектрофотометра “SmartSpec^TM Plus” (Bio-Rad) на 595 нм.

3. Из образцов, полученных при выделении белка, отбирают по 50 мкл, добавляют 200 мкл реагента Брэдфорда, измеряют оптическую плотность (595 нм).

4. Для образцов, содержащих β-меркаптоэтанол и SDS, разведение белка готовят при помощи буфера (2% SDS, 10% глицерин, 5% β- меркаптоэтанол, 0.065 M Трис-HCl pH 6,8).

Растворение панцирей диатомовых водорослей

1. Для подборки условий растворения отбираются клетки (например: A. baicalensis, C. baicalensis, C. minuta, S. acus) так, чтобы они находились в одинаковом состоянии (наличие хлоропластов и толщина панциря) при помощи инвертирующего микроскопа Axiovert-200.

2. Клетки промывают водой дважды и растворяют в 1 М раствор NH₄F, pH 5 в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300c. После чего буферный раствор удаляют и промывают дистиллированной водой 4-5 раз.

3. Материал исследуется при помощи сканирующего электронного микроскопа (например: SEM 525-M (“Philips'”, Япония)) (Петрова и др., 2004).

1. Белковые фракции наносятся на SDS-ПААГ (для лучшего разделения белков диатомей удобнее использовать градиентный гель 5-20% без концентрирующего в TGB буфере), так чтобы каждой пробы и маркера молекулярных масс было по две повторности – тестирования качества проб и электрофореза окрашиванием Кумаси, и для иммунохимического анализа. Электрофорез проводят при стандартных условиях: 20 мин – 50 V, затем на 100 V.

2. После окончания электрофореза, стекла вынимают из камеры, разнимают, часть геля окрашивают Кумаси, вторую перекладывают в камеру для переноса.

3. Подготовка камеры для переноса: перенос ведется в буфере (БДП): 3л – 7.86 г Трис-Cl, 33.75 г Глицина, 600 мл Этанола (Метанола). Камера заполняется небольшим количеством БДП, в котором смачивается нижняя прокладка из фильтровальной бумаги, на нее аккуратно перекладывают гель на подготовленную фильтровальную бумажку, поверх него накладывают мембрану (НЦ- нитроцеллюлоза или PVDF(PVDF предварительно активируется в метаноле 10-15с, после чего нельзя допускать ее высушивания). Мембрану сверху закрывают еще несколькими слоями фильтровальной бумаги и аккуратно зажимают камеру. Перенос ведут при 250 mA – 45мин./200 mA – 1-1,5ч/ 175 mA – не менее 1,5 ч.

4. После чего (если перенос вели на PVDF мембрану, то ей не дают высыхать) мембрану подписывают в соответствии с образцами, отмечают карманы и разрезают. Мембрану с маркером молекулярных масс отрезают и окрашивают в Кумаси 3-5 мин, затем отмывают краску.

5. Мембрану промывают 5-6 раз водой по 3-5 мин, затем еще три раза рабочим раствором (РБх10 100мл: Трис-Cl 1.211г, NaCl 8.753 г, БСА 10 г, Твин-20 500 мкл) и проводят забивку 1 ч Блокирующим Буфером (ББх10 100мл: Трис-Cl 1.211г, NaCl 8.753 г, БСА 10 г) на качалке (на этом этапе окрашивание можно приостановить, высушить мембрану до дальнейшего окрашивания, PVDF мембрану надо будет перед дальнейшим использованием опять активировать в метаноле).

6. После забивки ведут инкубацию с первичными антителами 2 ч при комнатной температуре, разведенными на РБ, так же при покачивании.

7. Повторяют промывку водой и РБ. Повторную забивку проводят 1 ч при комнатной температуре или можно ночь при +4⁰С.

8. После чего инкубируем мембраны со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:25 000 или 1: 10 000, подбирается экспериментально), 2 часа при комнатной температуре. После чего промываем троекратно водой и один раз РБ. И проявляют нитроцеллюлозу в растворе с хромогенами (10 мл р-ра NaCl 0,9%, забуференного 0,1-0,5% БСА: 2,5 мг ДАВ (диаминобензидина), предварительно за 40 мин растворенного в воде, / заместо ДАВ можно использовать хлорнавфтол 10 мг, растворенный в 500 мкл спирта, 2,5 мкл 30% ).

9. Проявку останавливают промывкой в воде несколько раз и высушивают, избегая попадания прямых солнечных лучей. Полученный результат сканируют и сопоставляют с частью геля окрашенного Кумаси.