Выделение суммарного цитоплазматического белка

Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus проводили при помощи набора для выделения клеточных белков Total Protein Kit фирмы Bio-Rad (“Bio-Rad”, США).

Клетки в количестве 150 млн концентрировали из культуральной среды при помощи фильтровальной установки (“Millipore”, США). Клетки отмывали от среды центрифугированием (7 500 g, 15 мин, MiniSpin, “Eppendorf”, Германия) надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли воду, процедуру повторяли. Осадок клеток растирали до гомогенного состояния в ступке на холоде в течение 5 мин для разрушения прочных кремнистых стенок, контролируя степень разрушения створок под микроскопом (Axiovert 200, “Zeiss”, Германия). Гомогенат переносили в пластиковую пробирку на 1,5 мл и добавляли Total Protein 300 мкл, обрабатывали ультразвуком в течение 4 мин с охлаждением. Осаждали центрифугированием (7 500 g, 30 мин) и отбирали супернатант, который в дальнейшем использовали как образец для нанесения на электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Для растворения кремнистого панциря и освобождения связанного с ним органического материала проводили обработку клеток 5М фторидом аммония (NH₄F), pH 5.0, (4^оС, 12 ч) в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз 3 мМ ФМСФ (m/v) и 3 мМ йодуксусной кислоты (m/v). Образовавшийся после центрифугирования (12 100 g, 3 мин) осадок ресуспендировали в 500 мМ Трис-HCl, pH 8.8, и центрифугировали в тех же условиях. Промывку повторяли дважды. Затем осадок обрабатывали ультразвуком и проводили карбоксиметилирование 5 мМ йодуксусной кислотой в 0.25 М Трис-HCl, рН 8.8, в присутствии 3 мМ ФМСФ (1 ч, 4^оС, m/v). Для разрушения дисульфидных связей и солюбилизации белков к осадку добавляли β-меркаптоэтанол до концентрации 52 мМ в 2 %-ном растворе SDS в 0.25 М Трис-HCl, pH 8.8, и полученную суспензию перемешивали при 37^оС в течение 12 ч. Для защиты меркапто-групп цистеина белки повторно карбоксиметилировали, добавляя йодуксусную кислоту до концентрации 54 мМ. Смесь центрифугировали при 12 100 g в течение 2 мин и из супернатанта осаждали белки 80% метанолом (v/v) на холоду. Белки растворяли в буфере для нанесения на гель (1% SDS, 10% глицерин, 100 мМ β-меркаптоэтанол, 50 мM Трис-HCl, pH 6.8) и анализировали с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ (Петрова и др., 2007).

3. 
   Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей
   

Культуру клеток S. acus выращивали на среде ДМ. После того, как количество клеток в культуре достигло 896·10⁶, клетки отделили от среды, как это описывалось раньше. Осадок клеток переносили в пластиковую пробирку и промывали трижды водой. К клеткам (V=500 мкл) добавили SDS и EDTA, до концентрации 2% и 0,2М, соответственно, перемешивали при помощи пипетирования и инкубировали на водяной бане (t = 95^оC) в течение часа. Центрифугировали (7 500 g, 15 мин) и убирали надосадочную жидкость. Осадок промывали водой и повторяли обработку SDS/EDTA дважды. Полученный осадок после третьего кипячения трижды промывали водой и высушили до сухого веса (m = 100 мг). После чего к осадку был добавлен раствор 2M NH₄F, pH 5.0 до полного растворения створок (V_{конечный}= 56 мл). Полученный раствор диализовали против раствора NH₄F 1% (v/v), c добавлением 3 мМ ФМСФ (m/v) в течение 12 час.

Разделили супернатант и осадок, выпавший при диализе, центрифу -гированием (7 500 g, 15 мин). Для супернатанта был измерен спектр поглощения (длина волн 220-300 нм) и измерена концентрация белка по методу Брэдфорда, при помощи спектрофотометра SmartSpec^TM Plus (“Bio-Rad”, США).

Осадок обработывали буфером (2% SDS, 10% глицерин, 5% β- меркаптоэтанол, 0,065 M Трис-HCl pH 6,8) трижды по 5 мин на водяной бане (95^оС), после каждого раза центрифугировали (12 100 g, 3 мин), отбирали супернатант, а осадок заливали новой порцией буфера. В дальнейшем супернатант использовали как образец для измерения поглощения на длинах волн 220-300 нм и для ПААГ-электрофореза.

Для определения концентрации белка по методу Брэдфорда (Bradford, 1976) была построена калибровочная кривая стандартного раствора бычьего гамма глобулина (БГГ, 2 мг/мл) Bio-Rad. Были приготовлены следующие разведения БГГ: 1000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 61 мкг/мл, 30,6 мкг/мл, 15 мкг/мл и 7,6 мкг/мл. К 50 мкл белкового раствора добавляли 200 мкл реагента Брэдфорда, затем измеряли оптическую плотность при помощи спектрофотометра “SmartSpec^TM Plus” (Bio-Rad) на 595 нм.

Из образцов, полученных при выделении белка, отбирали по 50 мкл, добавляли 200 мкл реагента Брэдфорда, измеряли оптическую плотность (595 нм). Для образцов, содержащих β-меркаптоэтанол и SDS, разведение белка готовили при помощи буфера (2% SDS, 10% глицерин, 5% β- меркаптоэтанол, 0.065 M Трис-HCl pH 6,8).
2.2.12. Растворение панцирей диатомовых водорослей.

Для подборки условий растворения отбирались клетки A. baicalensis, C. baicalensis, C. minuta и S. acus отбирался так чтобы клетки находились в одинаковом состоянии (наличие хлоропластов и толщина панциря) при помощи инвертирующего микроскопа Axiovert-200. Клетки промывали водой дважды и растворяли в 1 М раствор NH₄F, pH 5 в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300c. После чего буферный раствор удалили и промыли дистил-лированной водой 4-5 раз. Материал исследовался при помощи сканирующего электронного микроскопа SEM 525-M (“Philips'”, Япония) (Петрова и др., 2004).

Белковые фракции нанести на SDS-ПААГ (для лучшего разделения белков диатомей удобнее использовать градиентный гель 5-20% без концентрирующего в TGB буфере), так чтобы каждой пробы и маркера молекулярных масс было по две повторности – тестирования качества проб и электрофореза окрашиванием Кумаси, и для иммунохимического анализа. Электрофорез проводят при стандартных условиях: 20 мин – 50 V, затем на 100 V. После окончания электрофореза, стекла вынимают из камеры, разнимают, часть геля окрашивают Кумаси, вторую перекладывают в камеру для переноса.

Подготовка камеры для переноса: перенос ведется в буфере (БДП): 3л – 7.86 г Трис-Cl, 33.75 г Глицина, 600 мл Этанола (Метанола). Камера заполняется небольшим количеством БДП, в котором смачивается нижняя прокладка из фильтровальной бумаги, на нее аккуратно перекладывают гель на подготовленную фильтровальную бумажку, поверх него накладывают мембрану (НЦ- нитроцеллюлоза или PVDF(PVDF предварительно активируется в метаноле 10-15с, после чего нельзя допускать ее высушивания). Мембрану сверху закрывают еще несколькими слоями фильтровальной бумаги и аккуратно зажимают камеру. Перенос ведут при 250 mA – 45мин./200 mA – 1-1,5ч/ 175 mA – не менее 1,5 ч. После чего (если перенос вели на PVDF мембрану, то ей не дают высыхать) мембрану подписывают в соответствии с образцами, отмечают карманы и разрезают. Мембрану с маркером молекулярных масс отрезают и окрашивают в Кумаси 3-5 мин, затем отмывают краску.

Мембрану промывают 5-6 раз водой по 3-5 мин, затем еще три раза Рабочим раствором (РБх10 100мл: Трис-Cl 1.211г, NaCl 8.753 г, БСА 10 г, Твин-20 500 мкл) и проводят забивку 1 ч Блокирующим Буфером (ББх10 100мл: Трис-Cl 1.211г, NaCl 8.753 г, БСА 10 г) на качалке (на этом этапе окрашивание можно приостановить, высушить мембрану до дальнейшего окрашивания, PVDF мембрану надо будет перед дальнейшим использованием опять активировать в метаноле). После забивки ведут инкубацию с первичными антителами 2 ч при комнатной температуре, разведенными на РБ, так же при покачивании. Повторяют промывку водой и РБ. Повторную забивку проводят 1 ч при комнатной температуре или можно ночь при +4⁰С. После чего инкубируем мембраны со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:25 000 или 1: 10 000, подбирается экспериментально), 2 часа при комнатной температуре. После чего промываем троекратно водой и один раз РБ. И проявляют нитроцеллюлозу в растворе с хромогенами (10 мл р-ра NaCl 0,9%, забуференного 0,1-0,5% БСА: 2,5 мг ДАВ (диаминобензидина), предварительно за 40 мин растворенного в воде, / заместо ДАВ можно использовать хлорнавфтол 10 мг, растворенный в 500 мкл спирта, 2,5 мкл 30% ). Проявку останавливают промывкой в воде несколько раз и высушивают, избегая попадания прямых солнечных лучей. Полученный результат сканируют и сопоставляют с частью геля окрашенного Кумаси.

Реактив А:

20г Na₂CO₃; 4г NaOH; 1,6г K₂-цитрат; 10г SDS; H₂O до 1 л.

Реактив В:

0,5г CuSO₄*5H₂O в 100мл Н₂О (0,5 % раствор)

Реактив Фолина (ВЕК) развести Н₂О до 1N раствора кислоты (1мл Фолина + 1,23мл Н₂О)

Реактив С:

50мл А + 1мл В перед употреблением

Реактив D:

20мМ дитиотреитола (3,1 мг/мл) перед употреблением

Определение:

К образцу 0,5мл (довести Н₂О)добавить 2,5 мл реактива С, перемешать. Добавить 250мкл реактива Фолина, перемешать. Через 3 мин добавить 250мкл реактива D. Пробирки должны находиться в водяной бане на 40-50⁰С. Измерение против контроля при 740нм. Ручка фильтров “Спектромома” выдвинута.

Метод хорошо подходит для мембранных образцов. Калибровка по БСА, но лучше определить по классическому Lоwry препарат мембран и сделать калибровку по нему. В контроль вносить такое же количество буфера, как и в образец. Следить за тем, чтобы колориметрируемый раствор не содержал осадка (при t<20⁰С щелочь выпадает в осадок, ЭДТА и др. хелаторы дают коллоидный раствор с сильным светорассеиванием). При наличии этих явлений окрашеные пробирки нагреть на бане до тех пор, пока растворы не станут прозрачными. Определению мешает Тритон-X100. Достоверное определение от 7 до 45мкг белка в пробе.