Взаимоотношения чумного микроба ( yersinia pestis ) и блох (siphonaptera) (на примере сибирских природных очагов чумы) 03. 00. 16 экология

На правах рукописи

БАЗАНОВА
Любовь Петровна

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS)

И БЛОХ (SIPHONAPTERA)

(на примере сибирских природных очагов чумы)

03.00.16 – экология

АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Иркутск – 2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека, существующая угроза террористических актов с использованием биологических объектов могут привести к пока непредсказуемым последствиям, что определяет необходимость усиления контроля за особо опасными инфекциями, в том числе, чумой (Anisimov et al., 2004; Смирнова, Кутырев, 2006; Eisen et al., 2006; Трухачев, Лебедева, 2006, 2007).

Природный очаг чумы – сложная экологическая система. Трофические связи в этой системе между чумным микробом (Yersinia pestis), носителями инфекции (теплокровными животными) и переносчиками (блохами – Siphonaptera) обеспечивают формирование трансмиссивного пути поддержания энзоотии (Bacot, Martin, 1914; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский, 1974; Williams, Cavanaugh, 1983; Korenberg, 1989; Литвин, Коренберг, 1999; Иннокентьева и др., 1999; Атшабар, 1999; Анисимов и др., 2001).

Актуальность настоящей работы обусловлена следующим:

1. Сибирские природные очаги чумы (Забайкальский, Тувинский и Горно-Алтайский) в России являются северной окраиной Центрально-Азиатской зоны природной очаговости этой инфекции, основная часть которой расположена на территории Монголии и Китая (Сафонова, Саран, 1974; Голубинский и др., 1987; Попов и др., 2005). В Монголии и Китае ежегодно регистрируются вспышки заболевания людей чумой, и в последние годы прослеживается тенденция к увеличению числа заболевших (Tserennorov et al., 2003; Enkhbaatar.et al., 2003; Марамович и др. 2008).

На территории двух горных природных очагов Сибири (Тувинского и Горно-Алтайского) эпизоотии регистрируют ежегодно. При этом в Тувинском очаге с 1989 г. наблюдается трансформация сообществ носителей и переносчиков и расширение ареала чумного микроба (Галацевич, 1994; Вержуцкий, 2005). В Горно-Алтайском очаге происходит изменение структуры таксоценоза блох с возрастанием доли одних видов и сокращением численности других (Корзун, 2007).

2. Большинство культур чумного микроба, изолированных в сибирских очагах, получено от массовых видов блох. Так, в Тувинском очаге чумы на долю этих насекомых приходится 70,6 % штаммов возбудителя (Вержуцкий, 2005), Горно-Алтайском – 82,6 % (Корзун, 2007). Учитывая высокую естественную зараженность блох чумным микробом, считается более эффективным контролировать эпизоотическую ситуацию на территории природных очагов посредством борьбы с переносчиками, чем с носителями инфекции (Очиров и др., 1999; 2000; Вержуцкий и др., 2002; Матросов и др., 2004; Попов и др., 2004; Lorange et al., 2005; Никитин и др., 2005).

Результативность такого контроля зависит от глубоких знаний фауны, экологии, особенностей взаимоотношений блох с чумным микробом. Однако весь комплекс взаимоотношений чумного микроба и блох, влияющих на закономерность трансмиссии возбудителя в природных очагах Сибири, недостаточно исследован. Очевидна необходимость выявления таких особенностей, которые уточняют и расширяют наши представления о механизме энзоотии чумы. Изучение закономерностей системы паразит-хозяин, отношений между сочленами данной паразитарной системы (переносчик-чумной микроб) актуальны, поскольку напрямую связаны с проблемой эпидемиологического надзора и совершенствованием мероприятий по неспецифической профилактике этой инфекции.

1. Определить сезонную динамику процесса блокообразования у блох, их заражающей способности, роль самок и самцов этих эктопаразитов в трансмиссии чумного микроба.

2. Установить влияние абиотических факторов на алиментарную активность, смертность блох и их взаимоотношения с чумным микробом.

3. Рассмотреть возможность реализации и эпизоотологическую значимость второстепенных способов передачи чумного микроба блохами.

4. Оценить влияние межвидовых и межпопуляционных особенностей блох на их взаимоотношения с чумным микробом.

5. Установить особенности контактов между географически разобщенными популяциями чумного микроба и блох и исторически не контактировавшими с возбудителем чумы насекомыми и микробом.

6. Определить значение явления агрегированности чумного микроба в организме имаго блох для его передачи и сохранения насекомыми.

7. Выявить основные механизмы устойчивости сибирских природных очагов чумы, экологически связанные с блохами-переносчиками.

Впервые для сибирских природных очагов чумы установлена сезонная динамика блокообразования у блох и передачи чумного микроба этими насекомыми. Максимальные значения данных показателей в экспериментах совпадали по времени с пиком эпизоотии в природном очаге. Выявлено, что при кровососании на лабораторных животных (белых мышах), не имеющих выраженных сезонных различий в чувствительности к возбудителю чумы, динамика заражающей способности насекомых реализуется аналогично отмеченной при питании на длиннохвостом суслике. Это может указывать на коэволюцию эктопаразитов и чумного микроба, ритм взаимоотношения которых сохраняется при смене прокормителя.

Впервые показано, что процессы распространения и сохранения чумного микроба блохами связаны с полом насекомого: первый лучше осуществляется самцами, второй – самками. У самцов большинства массовых видов блох чаще и в более короткие сроки возникает «блок» преджелудка, чем у самок, и они активнее осуществляют передачу микроба.

Выявлены межпопуляционные различия во взаимоотношениях переносчиков с чумным микробом в Тувинском природном очаге. Более активное взаимодействие (по частоте формирования в организме насекомых бактериальных «глыбок») отмечены в парах (блоха – чумной микроб), происходящих с одного участка очаговости, или обитающих на участках со сходными биоценотическими характеристиками.

Впервые обнаружена возможность установления функциональных контактов между чумным микробом и блохами исторически не контактировавшими с возбудителем (с неочаговых по чуме территорий, внутривидовыми гибридами). Выявлена связь между уровнем флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков у насекомых и их векторной активностью.

Впервые установлено, что инфицированные «неблокированные» особи Citellophilus tesquorum altaicus – основного переносчика в Тувинском природном очаге – способны более 600 суток сохранять чумной микроб и осуществлять его передачу длиннохвостым сусликам. При массовом питании «неблокированных» блох исходом такой передачи является развитие острой генерализованной формы инфекции у зверьков, или подострое течение заболевания с бактериемией, достаточной для заражения насекомых. У чувствительных к возбудителю чумы животных при укусах даже небольшого числа таких блох развивается острая форма инфекции с агональной септицемией.

Выявлено, что второстепенные способы передачи чумного микроба инфицированными насекомыми (внесение через поврежденную кожу зверька из раздавленных блох и их экскрементов, при поедании эктопаразитов грызуном) при определенных условиях могут быть не менее эффективными, чем укусы «блокированных» блох, приводить к заболеванию зверьков с генерализацией инфекции и обеспечивать дальнейшую трансмиссию возбудителя.

Впервые показано, что состояние агрегированности чумного микроба в организме переносчика, сопровождающееся изменением морфологии и ультраструктуры микроорганизма, обусловливает не только его способность к блокообразованию и дальнейшей трансмиссии, но и сохранение микроорганизма при неблагоприятных условиях окружающей среды.

На основании изложенных материалов могут быть обоснованы следующие теоретические положения. Первое – трансмиссия чумного микроба в природных очагах Сибири осуществляется преимущественно укусами «неблокированных» особей массовых видов блох, содержащих конгломераты микроба. Второе – агрегированная форма чумного микроба в организме блох – его особое состояние, определяющее как трансмиссию, так и сохранение микроорганизма в зимний сезон, что обеспечивает непрерывность его циркуляции в сибирских горных очагах чумы и их устойчивость.

Практическая значимость. Работа проведена в рамках выполнения семи научных тем Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока: «Разработка методов борьбы с носителями и переносчиками в плане оздоровления природных очагов Сибири» // № госрегистрации 81004192. – Иркутск, 1985; «Оценка современного состояния сибирских очагов чумы и изучение факторов их устойчивости при проведении оздоровительных мероприятий» // № госрегистрации 01860020801. – Иркутск, 1990; «Изучение роли Л-форм в персистенции чумного микроба в природных очагах Сибири» // № госрегистрации 01860020809. – Иркутск, 1990; «Оптимизация эпидемиологического надзора в сибирских природных очагах чумы» // № госрегистрации 01910033788. – Иркутск, 1995; «Совершенствование системы эпизоотологического мониторинга в сибирских очагах чумы в связи с обеспечением эпидемиологического благополучия населения» // № госрегистрации 01960000188. – Иркутск, 2001; «Оптимизация методов регуляции численности синантропных членистоногих (блохи, комары, тараканы) в условиях крупного города» // № госрегистрации 01980010186. – Иркутск, 2002; «Популяционно-экологические аспекты природной очаговости чумы в Сибири в связи с ее профилактикой» // № госрегистрации 012000113852. – Иркутск, 2005.

На основании выполненных экспериментальных работ рекомендовано применять противочумным станциям при проведении бактериологического исследования блох и клещей наряду со стандартными средами сухую питательную среду, предназначенную для выделения Л-форм чумного микроба (ЛС). Применение среды ЛС позволило повысить результативность эпизоотологического обследования сибирских очагов чумы на 25-30 %.

Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы федерального и регионального уровня: «Методические рекомендации по повышению результативности исследований эктопаразитов в природных очагах чумы» (Иркутск, 1990), «Паспорт Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2000), «Методические указания. Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих – переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций» (М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002), «Методические рекомендации по эпизоотологическому обследованию Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2004), «Методические рекомендации по лабораторному разведению блох для научных исследований» (Саратов, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сибирских горных природных очагах чумы, несмотря на их различные характеристики по гостальности и векторности, основным механизмом поддержания энзоотии является трансмиссия чумного микроба инфицированными «неблокированными» блохами.

2. Блокообразование как специфический способ передачи чумного микроба блохами имеет выраженную сезонную динамику, обусловленную половыми и возрастными особенностями эктопаразитов и адаптацией к ним возбудителя. Наиболее активен этот процесс в пик эпизоотии в природном очаге.

3. Второстепенные способы передачи чумного микроба блохами могут быть в определенных условиях эффективными и играть существенную роль в циркуляции микроба в природных очагах Сибири.

4. Возможно установление функциональных контактов между чумным микробом и переносчиками из географически разобщенных популяций (из разных природных очагов), а также между возбудителем и блохами, никогда не контактировавшими с чумным микробом (насекомые с неочаговых территорий и межподвидовые гибриды блох). Адаптация Yersinia pestis к экологическим особенностям блох увеличивает способность микроба приживаться в их организме, о чем свидетельствует связь уровня ФА билатеральных признаков насекомых с частотой блокообразования.

5. Агрегированность чумного микроба является функцией его адаптации к организму блох и отражает векторную способность переносчиков.

Рассмотрены представления о природном очаге чумы как экологической системе (Павловский, 1947, 1960, 1964; Беклемишев, 1956; Балашов, 1972; Korenberg, 1982, 1989; Коренберг, 1983, 1985, 1986; Леви, 1985; Литвин и др., 1998; Литвин, Коренберг, 1999; Атшабар, 1999), особенностях взаимоотношений чумного микроба и блох (Pollitzer, 1954; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский 1974; Алексеев, 1989; Ващенок, 1999; Анисимов и др., 2002; Anisimov et al., 2004; Hinnebusch, 2005), состоянии агрегированности (биопленке) микроба в организме блохи, а также значении этого явления в трансмиссии (Burrows, Bacon, 1956; Акиев, 1970, 1991; Бурделов, 1987; Ващенок, 1988; Брюханова и др., 1989, 1999; Hinnebusch et al., 1998, 2002; Jarret et al., 2004; Duplantier et al., 2005; Erickson et al., 2006).

В 80-х годах прошлого века факты длительных межэпизоотических периодов в отдельных природных очагах чумы, одномоментности возникновения эпизоотий на разных участках, регистрации одиночных заражений носителей стали вступать в противоречие с традиционными представлениями о постоянном сохранении и непрерывной циркуляции чумного микроба в паразитарной системе. Это привело к обоснованию концепции «первичных» заражений, не связанных с трансмиссией (Попов и др., 1979; Солдаткин, Иванов, 1980; Мастюков и др., 1980; Солдаткин и др., 1984), и мысли о необходимости пересмотра традиционных взглядов на передачу чумы блохами как основного фактора поддержания энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988). Кризис идеи трансмиссивного механизма породил большое количество гипотез, основанных как на внутривидовой изменчивости чумного микроба (Дунаев и др., 1981, 1982; Дятлов, 1988, 1989; Ларина и др., 1992), так и «непаразитарном» механизме энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988; Домарадский, 1993; Слудский, 1998; Попов, 2002; Слудский и др., 2003). Факты зараженности нематодами личинок и имаго блох (Чумакова, Товканев, 1978; Чумакова, Козлов, 1983, 1984) привлечены для объяснения хранения и передачи возбудителя из почвенного биоценоза теплокровным животным по цепочке: матрикс биопленки чумного микроба – личинка нематоды – личинка блохи – грызун (Попов и др., 2006; Попов и др., 2007; Попов и др., 2008). Большинство гипотез, объясняющих длительные межэпизоотические периоды в отдельных очагах чумы нетрансмиссивными способами передачи возбудителя, до настоящего времени не получили прямого подтверждения или доказательства. Напротив, многочисленные экспериментальные данные, результаты эпизоотологических наблюдений в природных очагах свидетельствуют об определяющей роли блох в поддержании чумной энзоотии и обосновывает необходимость дальнейших исследований особенностей их взаимоотношений с чумным микробом (Леви, 1985; Бурделов, 1987; Сулейменов, 1995; Кокушкин, 1995; Анисимов и др., 2002; Eisen et al., 2006, 2007; Wilder et al., 2008).

Даны основные характеристики сибирских природных очагов чумы, особенности их биоценотической структуры и эпизоотических проявлений на очаговой территории (Голубинский и др., 1987; Вершинин, 1993; Иннокентьева, 1997; Вержуцкий, 2005; Корзун, 2007).

В экспериментах использованы лабораторные культуры блох и насекомые природных популяций. Блохи диких грызунов получены из биотопов долин рек Каргы и Барлык Тувы, природных стаций Юго-Восточного Забайкалья (падь Крементуй, район Торейских озер), Ольхонского района (Тажеранская степь), окрестностей пос. Усть-Орда Усть-Ордынского Бурятского автономного округа, Республики Бурятия (Тункинская долина, окрестности пос. Никольское). Опыты также проведены с Xenopsylla cheopis как классическим объектом экспериментальных исследований. Для заражения эктопаразитов, мелких млекопитающих и лабораторных животных использовали штаммы Y. pestis subsp. pestis, Y. pestis subsp. altaica, Y. pestis subsp. ulegeica из природных очагов Сибири (Тувинского, Горно-Алтайского, Забайкальского) и Монголии (Баян-Улэгейский и Хэнтейский аймаки). Поставлено 108 опытов, использовано 25500 блох 13 видов и подвидов, 1746 зверьков четырех видов и 13 штаммов чумного микроба.

В опыты брали в основном «молодых», питавшихся после выплода имаго. Применяли два способа заражения переносчиков чумным микробом. При естественном способе блох инфицировали на длиннохвостых сусликах, монгольских пищухах, плоскочерепных полевках, белых мышах в период развития у них агональной чумной бактериемии. При искусственном заражении на биомембране для кормления насекомых использовали смесь равных частей дефибринированной крови морской свинки и 2 млрд. взвеси чумного микроба из 48-часовой агаровой культуры, выращенной при 28º С. Между подкормками насекомых содержали в стерильном песке при соответствующей задачам опыта температуре и относительной влажности воздуха 80-93 %.

Взаимоотношения чумного микроба и блох оценивали по доле особей с «блоком» преджелудка от количества насекомых при первой подкормке, количеству всех особей за подкормку со сформировавшимися бактериальными «глыбками-конгломератами», частоте передачи чумного микроба животным, использованным для подкормок насекомых. Алиментарную активность определяли по доле пивших особей от числа живых, а смертность – по доле мертвых от общего количества эктопаразитов при каждой подкормке.

Сезонные особенности трансмиссии чумного микроба блохами изучали при разной температуре содержания насекомых, близкой к естественной температуре воздуха во время периода исследования. В опытах, поставленных при температуре от 5° до 27° С, использованы насекомые разных, условно выделенных календарных возрастов: «перезимовавшие», инфицированные летом или осенью предыдущего года и зимовавшие без прокормителя в условиях искусственной норы длиннохвостого суслика, и «молодые» – выплода и инфицирования текущего года. Преимущественно в эти эксперименты взяты особи II и III физиологических возрастов по шкале В.Н. Прокопьева (1958).

Активность трансмиссии оценивали по доле «блокированных» блох и всех особей, содержащих конгломераты микроба, относительному количеству инфицированных сусликов и среди них с генерализованной формой инфекции. Инфекциозность укусов «блокированных» блох определяли путем ежедневного кормления 1-3 таких особей на суслике в течение 1,5-2 часов, используя при каждой подкормке интактного зверька. В отдельном опыте эктопаразитов содержали в термостате при 25-27º С, исходя из данных О.Ф. Пауллер и В.Е. Мамаева (1954), что в центре жилого гнезда даурского суслика температура колеблется от 16º до 34º С, а в среднем равняется 26,7º С.

Изучение длительности сохранения чумного микроба C. tesquorum altaicus проводили по разработанной нами методике (Базанова, 1993). Зараженных имаго помещали в стаканчики-гильзы из органического стекла, дно и крышка которых выполнены из асбестового стерилизующего фильтра, обеспечивающего свободный доступ воздуха. «Гильзы» закладывали в ниши бункера, имитирующие гнездовую камеру суслика. Температуру и влажность воздуха измеряли перед началом опыта, в середине и в момент изъятия насекомых из «гнезда». За время проведения эксперимента температура колебалась от +2º С до -6º С. Между подкормками блох содержали: осенью и весной при 5-6º С, летом при 8-10º С. Общая продолжительность эксперимента составила 692 дня (с 14 сентября 1987 г. по 7 августа 1989 г.).

Заражение длиннохвостого суслика алиментарным способом проводили путем нанесения на слизистую рта зверька суспензии из 1-5 инфицированных блох. Возможность заражения суслика возбудителем чумы через поврежденную кожу устанавливали, втирая раздавленных насекомых или их экскременты в предварительно скарифицированную кожу зверька. Исследовали длительность сохранения чумного микроба в инфицированном экскрементами и трупами эктопаразитов субстрате гнезда. Для этого использовали смесь из равных частей песка и мелких опилок, где содержали зараженных насекомых в период между подкормками. Такой субстрат хранили в течение 8-9 месяцев в специальных нишах лаборатории-бункера, имитирующих нежилые гнезда суслика, а затем использовали для заражения сусликов в виде подстилки. Суспензии из трупов блох высевали на экспериментальные серии сред: УДС (универсальная диагностическая среда) и ЛС (среда для выделения Л-форм чумного микроба). Суспензию из субстрата высевали на среду УДС; этим же материалом заражали белых мышей подкожно или внутрибрюшинно.

Изучение межпопуляционных особенностей взаимоотношений переносчиков с чумным микробом. Исследование проведено на двух массовых видах блох длиннохвостого суслика C. tesquorum altaicus и Rhadinopsylla li transbaikalica из Каргинской и Барлыкской природных популяций Тувинского очага чумы. Взаимоотношения с чумным микробом оценивали по уровню инфицирования насекомых, накоплению в их организме микроба в агрегированном состоянии и образованию «блока» при заражении и подкормках на длиннохвостом суслике. Кроме того, изучали особенности взаимоотношений C. tesquorum altaicus лабораторной популяции, полученной от блох с Каргинского участка очаговости, и чумного микроба, изолированного в Саглинском и Каргинском участках Тувинского очага (штаммы Y. pestis И-3327 и И-3428) при искусственном заражении и подкормках блох на белых мышах.

При исследовании уровня флуктуирующей асимметрии (ФА) у C. tes-quorum внутри каждого варианта опыта сопоставляли две группы блох: одна – особи со сформировавшимся «блоком» преджелудка, другая – те, у которых в течение опыта «блок» не был отмечен. Оценивали признаки: число щетинок на эпистерне (1), метэпимере (2), наружной поверхности бедра (3), внутренней поверхности бедра (4), наружной поверхности голени (5) с правой и левой стороны тела имаго. Уровень ФА характеризовали через показатель дисперсии разности в проявлении признака с двух сторон тела (σ_d²), а также путем расчета доли асимметричных имаго в проанализированной выборке.

1. Визуально путем микроскопирования после каждой подкормки на животном выявляли блох с бактериальными «глыбками», частичными и полными «блоками». Учет средней за подкормку доли насекомых, содержащих микроб в различной степени агрегированности, позволил провести сравнительный анализ динамики взаимоотношений переносчика и возбудителя.

2. Исследовали содержимое желудочно-кишечного тракта блох путем свето-оптического, фазово-контрастного и электронного микроскопирования. Мазки для исследования на светооптическом уровне готовили по методике А.П. Бейер с соавт. (1974). Ультратонкие срезы преджелудка, приготовленные согласно методическим рекомендациям (Волгоград, 1983) и (Саратов, 1989), просматривали в электронном микроскопе Jem 100 SX (JeOL, Япония). Проводили фильтрацию суспензии из содержимого желудков инфицированных блох через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и высев полученных фильтратов на стандартные питательные среды, а также среду для культивирования Л-форм чумного микроба.

3. Для детекции микроба в насекомых использованы бактериологический и молекулярно-биологический – постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) методы. Подробно методики подготовки блох к исследованию и постановки ПЦР изложены в работах (Балахонов и др., 1998, 1999, 2000).

4. Взаимоотношения блох и чумного микроба исследовали с учетом эколого-физиологических особенностей насекомых: сроков важнейших сезонных явлений в их жизни, возрастного и полового состава опытных групп, алиментарной активности, смертности, продолжительности жизни.

Исследование зверьков, использованных для кормления инфицированных насекомых. Манипуляции с животными проводили с соблюдением правил, принятых Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986). Факты передачи чумного микроба животным устанавливали бактериологическим (посев органов на стандартные среды или среду для Л-форм чумного микроба), биологическим (заражение биопробы суспензией из органов животных) и серологическим (реакция пассивной гемагглютинации – РПГА, реакция нейтрализации антител – РНАт и реакция нейтрализации антигена – РНАг) методами исследования. Часть опытных животных, на которых кормили «перезимовавших» блох и без видимого «блока», дополнительно исследовали в иммунологических тестах: определяли показатель повреждения нейтрофилов (ППН) по методу В.А. Фрадкина (1962), исследовали органы с помощью радиоиммуного анализа (РИА).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистическую обработку проводили с помощью стандартных методов (Рокицкий, 1967; Закс, 1976; Поллард, 1982; Боровиков, Ивченко, 2000; Боровиков, 2001; Никитин, Сосунова, 2003) с применением программы «Excel». Различия между двумя группами по средним показателям оценивались с применением критерия Стьюдента, по изменчивости – F критерия. Использованы методы регрессионного, дисперсионного и корреляционного анализов и метод множественных сравнений по Шеффе. В работе приняты стандартные уровни значимости: * – P<0,05; ** – P<0,01; *** – P<0,001.