Химия растительного сырья

Экспериментальная часть

20% водно-этанольный экстракт получали, используя технологические приемы в соответствии с требованиями ГФ XI.

Исследования биологической активности проведены на 400 белых беспородных мышах-самцах массой 18–22 г и 100 белых беспородных крысах-самцах массой 180–200 г, полученных из питомника «Рассвет» НПО «Вирион» (Томск). Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными ФЗ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных.

Острую токсичность, противовоспалительную и анальгезирующую активности, ранозаживляющие свойства исследуемого экстракта исследовали согласно Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г.) [4].

Антигрибковую активность исследовали in vitro методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро [5]. В качестве тест-микроорганизмов использовали Trichophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger и Candida albicans. Оценку антигрибковых свойств экстракта проводили в сравнении с фармакопейными препаратами – нитрофунгином и сангвиритрином и индивидуальными веществами фенольной природы, обладающими фунгистатическими свойствами.

Антибактериальную активность экстракта исследовали методом серийных разведений на мясопептонном бульоне [5], в сравнении с извлечениями из фармакопейного сырья шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного, используемых в качестве антимикробных средств.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами с определением средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (m). Достоверность результатов оценивали параметрически по t-критерию Стьюдента. Кроме того, использовали пакет статистических программ «Statistica for Windows 7.0».

Обсуждение результатов

Существенными составляющими фармакологической активности ранозаживляющих средств является наличие у них противовоотечного и анальгезирующего действия, так как воспалительный отек и боль являются неотъемлимыми компонентами раневой патологии [6–10]. Это побудило нас оценить антиэкссудативные и болеутоляющие свойства экстракта.

При субплантарном введении раствора агара наблюдалось интенсивное формирование воспалительного отека задней конечности у мышей. В данных условиях эксперимента предварительное 5-кратное внутрижелудочное (один раз в сутки) введение экстракта в диапазоне доз 100–500 мг/кг приводило к достоверному ослаблению формирования воспалительного отека лапы мышей (табл. 1).

При этом наиболее выраженный антиэкссудативный эффект экстракта отмечался для доз 250 и 500 мг/кг – угнетение отека составило 30,1 и 31,1% соответственно. Предварительное введение мышам препарата сравнения – индометацина (10 мг/кг) вызывало более эффективное торможение развития отека – 47,2% (табл. 1).

Известно, что анальгетическое действие флоголитиков состоит из периферического и центрального эффектов. К периферическим компонентам, участвующим в обезболивании, относится противоотечное действие [6–10]. Ослабление экссудации под влиянием исследуемого экстракта позволило предположить болеутоляющие свойства исследуемого экстракта на модели уксусных корчей у мышей.

Таблица 1. Влияние предварительного введения экстракта из (50–500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на формирование агарового отека конечностей у белых беспородных мышей-самцов

Судя по полученным экспериментальным данным (табл. 2), экстракт обладает и выраженным болеутоляющим действием. Предварительное 5-кратное внутрижелудочное введение (один раз в сутки) данного экстракта в диапазоне доз 250–500 мг/кг приводит к достоверному, практически не уступающему аналогичному действию индометацина по снижению среднего количества корчей – на 36,9 и 42,9% соответственно (табл. 2).

Исследование ранозаживляющей активности экстракта проводили на моделях «асептически резаной раны» и «ампутации хвоста» у крыс. В качестве препаратов сравнения использовали фармакопейные ранозаживляющие средства: 10%-ную метилурациловую мазь и облепиховое масло (ООО «Биолит», Томск). О ранозаживляющей активности исследуемых препаратов судили по срокам полного заживления раны и морфологическим показателям состояния тканей в области резаной раны. Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.

У контрольной группы животных, получавших обработку мазевой основой: ПЭГ 400 – ПЭГ 1500 (1 : 4), после нанесения «асептической раны» в области спины методом удаления кожно-фасциального лоскута диаметром 20 мм, заживление дефекта кожи происходило в сроки 18,60±1,40 дня (табл. 3).

В течение первых 5–7 дней наблюдалась гнойно-воспалительная реакция мягких тканей, окружающих раневой дефект, сопровождающаяся обильной экссудацией и образованием гнойно-некротической корочки. При удалении последней на 7-й день отмечено отхождение обильного гнойного отделяемого скопившегося между грануляционной тканью дна раны и удаляемой корочкой. Отмечена мацерация кожи, окружающей рану.

Морфологическая картина, свидетельствующая о выраженности воспалительного процесса у животных контрольной группы, подтверждалась гистологическим исследованием. Микроскопия препаратов участка раневого дефекта показала наличие гнойно-некротической корочки и поверхностной гематомы. Хорошо определялся эпидермис, с сохраненной дифференцировкой слоев, но на поверхности имелся некротический детрит с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией с наличием гнойных телец, между гнойно-некротической корочкой и поверхностью раневого дефекта определялся разрушающийся эритроцитарный тромб.

При обработке раны 3% мазью экстракта полная эпителизация дефекта отмечается в сроки 12,20±1,4 дня. Ускорение заживления раны по отношению к контрольной группе составило 34,4% (табл. 3). Обработка раны мазью данного экстракта способствовала ликвидации гнойно-экссудативной воспалительной реакции, о чем свидетельствовало отсутствие скопление гноя под удаляемой корочкой на 7-е сутки после нанесения раны.

Таблица 2. Влияние предварительного введения 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (50–500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на болевую чувствительность белых беспородных мышей-самцов на модели «уксусных корчей»

Таблица 3. Влияние аппликаций 3% мази 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum, 10% метилураци­ловой мази и масла облепихи на сроки заживления «асептически резаной раны» у крыс

Таблица 4. Влияние аппликаций 3% мази 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum, 10% метилураци­ловой мази и масла облепихи на сроки заживления «ампутационной культи хвоста» у крыс

При микроскопии препаратов поверхности раневого дефекта наблюдался эпидермис с наличием акантотических тяжей, грануляционная ткань с переходом в созревающую, в сосочковом слое дермы очаговый гиперкератоз в различных фазах созревания. По поверхности определялись роговые чешуйки в состоянии очагового слущивания.

Необходимо отметить, что 10% метилурациловая мазь и масло облепихи в аналогичных условиях эксперимента оказали менее выраженные ранозаживляющие эффекты – полная эпителизация раны наблюдается в сроки 13,40±1,20 и 15,60±1,60 дня соответственно (табл. 3). Кроме того, в группе животных, получавших аппликации масла облепихи, так же как и в контрольной группе, в течение первых 5–7 дней наблюдалась гнойно-воспалительная реакция мягких тканей, окружающих раневой дефект, сопровождающаяся обильной экссудацией и образованием гнойно-некротической корочки.

Аналогичная картина наблюдается на модели «ампутации хвоста» у крыс – аппликации 3% мази экстракта и 10% метилурациловой мази проявляют сравнимое между собой ранозаживляющее действие, ускоряя процесс заживления ампутационной культи (по сравнению с контрольной группой) на 22,9 и 19,8% соответственно (табл. 4).

В данных условиях эксперимента не наблюдалось достоверного влияния масла облепихи на процессы заживления культи. Таким образом, в данных условиях эксперимента 3% мазь экстракта обладает выраженным ранозаживляющим действием, сравнимым с аналогичным эффектом 10% метилурациловой мази и значительно превосходящим репаративные эффекты масла облепихи.

Рациональная терапия раневых поражений включает в себя обязательную антимикробную (антибактериальную и противогрибковую) составляющую [11–13]. Известно, что перспективными в этом плане группами БАВ являются эфирные масла, фенольные соединения (особенно фенолокислоты) и полисахаридный комплекс (ПСК) [5, 14, 15]. Наши исследования показали, что в растениях S. fuscum присутствуют фенолокислоты, кумарины и ПСК, что позволило предположить у них наличие антифунгальных и антимикробных свойств. Поэтому мы провели исследование антибактериальной и противогрибковой активности экстракта.

В перспективных концентрациях (31,7–62,5 мкг/мл) экстракт действует только на возбудителей дерматофитий. При этом более высокую чувствительность к исследуемым препаратам проявляют тест-грибы Trichophyton rubrum и Microsporum canis (табл. 5).

По данным эксперимента, экстракт проявляет выраженные бактериостатический и бактерицидный эффекты (табл. 6). В разведении 1/80 он ингибирует размножение микроорганизмов штаммов Escherichia coli Н-304, Staphylococcus aureus Р-209 и Кlebsiella pneumoniae, слабо влияя на штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 (б/ст – 1/20). Бактерицидное действие проявляется в более высоких концентрациях: 1/40–1/20, за исключением влияния на Staphylococcus aureus Р-209 (б/ц – 1/80).

Таким образом, сырье S. fuscum является перспективным объектом для разработки на его основе новых фитопрепаратов. 20% водно-этанольный экстракт, обладая низкой токсичностью, оказывает многогранное воздействие на организм.

На наш взгляд, сочетание противовоспалительной и анальгезирующей активности, ранозаживляющих свойств, антибактериального и антифунгального действий данного экстракта рационально в комплексной терапии раневых и воспалительных процессов, ожоговых поражений кожи, инфицированных ран.