Сұраншиев Ж.Ә. «Ветеринарлық вирусология» пэоәК
-сурет. ПТР нәтижелерінің электроферограммасы
жүктеу/скачать 4.8 Mb. Pdf көрінісі
|
| 38-сурет. ПТР нәтижелерінің электроферограммасы
(Третякова И.В., 2022) 1 — позитивті бақылау; 2 — негативті бақылау; 3, 6, 7 — теріс нәтиже көрсеткен сынамалар; 4, 5, 8, 9, 10, 11 — оң нәтиже көрсеткен сынамалар. Негативті бақылау сынамасы енгізілген жол бойында телімді жолақ пайда болған жағдайда талдау нәтижесі есепке алынбайды. Мұндай нәтиже реагенттердің және/немесе үлгілердің ластануынан болуы мүмкін. Бұл ретте талдау нәтижелері жарамсыз деп танылып, сынамаларды қайтара зерттейді. Сондай-ақ ластану көздерін анықтап, оларды жою шараларын жүргізуді талап етеді. ДНҚ-зонд әдісі. Кез келген вирус өзіне ғана телімді нуклеотидтердің қатаң анықталған тізбегі бар нақты бір молекуланы (ДНҚ немесе РНҚ) қамтиды және олар комплементарлық қасиетті иеленген. Ауруға шалдыққан жануарлардан алынған материалдардың құрамынан вирустардың нуклеин қышқылдарын анықтау үшін қос тізбекті нуклеин қышқылы молекуласының бір-бірінен ажыратылған тізбектерін пайдалауға болады. Өйткені мұндай нуклеин қышқылдарының ажыраған тізбектерінің қайта қос тізбекті түзе алатын, яғни комплементарлық қабілеті бар. Комплементарлық – бұл сутегі иондары арқылы байланысқан екі жеке- дара нуклеин қышқылдарының бір қос тізбекті құрауы, егер біреуінің нуклеотидтер тізбегінің реттілігі екіншісімен дәл сәйкес келген жағдайда олардың азоттық негіздері аденин-тимин және гуанин-цитозин (ДНҚ молекуласы) немесе аденин-урацил және гуанин-цитозин (РНҚ молекуласы) жұптарын түзе алады. ДНҚ-зонд әдісінің принципі – патологиялық материалдардың құрамынан вирустардың нуклеин қышқылдарын анықтау үшін ДНҚ-зондтар, яғни белгілі бір вирустың нуклеин қышқылының молекеуласына комплементарлы болып келетін және онымен байланысып қос тізбекті түзуге қабілеті бар таңбаланған бір тізбекті нуклеин қышқылының молекулаларының қолданылуында. Нуклеин қышқылдарының әрбір молекуласы нуклеотид тізбегі болып табылады және олардың әрқайсысы азоттық негіздерден тұрады (Аденин, Гуанин, Цитозин, Тимин немесе Урацил). Нуклеин қышқылдары екі түрге (ДНҚ, РНҚ) ажыратылады, ал олардың құрамы азоттық негіздер мен қанттардың түрлері бойынша ерекшеленеді. ДНҚ-зонд әдісінің кезеңдері 1 Белгілі бір вирустың бір тізбекті ДНҚ-фрагментін (ДНҚ-зондын) алу және оны таңбалау. Әрбір вирустың түріне арналған зонд алдын ала дайындалады: химиялық жолмен синтездеу арқылы көп мөлшерде жинап алады, оларды изотоп, флюорохром немесе ферментпен таңбалайды. Дайын болған зондты пайдаланғанға дейін сақтауға қояды. Ауруға шалдыққан жануарлардан алынған материалдардан ДНҚ-зонд алу үшін вирусты бөліп алады. Электрофорез әдісінің көмегімен вирустың ДНҚ-фрагменті алынады. Вирустың ДНҚ- фрагментін бактерия ДНҚ-на (плазмидаға) ендіріп, селективті қоректі ортада клондау арқылы бактерия массасын жинап алады. Сонан соң вирус ДНҚ- фрагменті бар бактериялардан плазмидалық ДНҚ бөліп алады да, таңбалайды және 80°С температурада қыздырып, денатурацияға ұшырату арқылы ДНҚ-ның қос тізбегін тарқатады. Тарқатылған ДНҚ тізбектерінің біреуінде вирустың ДНҚ тізбегіне комплементарлы фрагменттері (ДНҚ-зонд) болады. Вирустық РНҚ-на тән ДНҚ-зонд алу үшін вирус РНҚ фрагментін бөліп алып, кері транскрипция арқылы ДНҚ-фрагменті алынады. Алынған ДНҚ- фрагментін плазмидаға ендіреді. ДНҚ-зонд көмегімен ауру малдардан алынған кез келген материалдардың құрамынан вирустың нуклеин қышқылдарын анықтауға болады. Бұл жұмыстарға жаңадан алынған, кептірілген, мұздатылған, тіптен жартылай бүлінген биоматериалдар (ұлпалар, шайындылар, қан) жарай береді. 2 Патологиялық материалдардан нуклеин қышқылдарын бөліп алу және денатурациялау (қос тізбекті молекуланы бір тізбекке тарқату). Ол үшін патологиялық материалды гомогенизациялайды, суспензиялайды, центрифугалайды және тұнба сұйықтығын ақуыздарды талқандайтын препараттармен (алдымен протеиназамен, сосын фенолмен хлороформ қоспасымен) өңдейді. Сосын ДНҚ минус 70°С температурада тұндырады, тұнбаны спиртпен шайып, қайнату немесе сілтімен өңдеу арқылы денатурацияға ұшыратады. 3 Молекулалық гибридизация, яғни бастапқы бір тізбекті ДНҚ-ның әрекеттесуі (вирус ДНҚ мен ДНҚ-зонд өзара комплементарлы болған жағдайда). Ол үшін әртүрлі материалдардан алынған сынамаларды квадраттарға сызылған ұсақ саңылаулы мембраналық сүзгі беткейіне (әр сынаманы нөмірленген өз квадратына) енгізеді. Зондты шыны бетіне енгізеді де, шыныны зерттеуге алынған сынамалары бар сүзгі бетіне қойып, 20 минут +80°С , сосын 2 сағат бойы +55°С температурада ұстайды. Сонымен қатар позитивті және негативті бақылаулар да қойылады. Уақыт өткеннен кейін мембраналық сүзгіні шыныдан ажыратып, шайып, кептіреді. Байланысқа түспеген бір тізбекті ДНҚ молекулаларынан арылту үшін натрий додецилсульфаты мен лимонқышқылды натрий ерітіндісімен өңдейді. 4 Түзілген қос немесе екі тізбекті ДНҚ молекулаларын анықтау авторадиография әдісімен радиоактивтілікті айқындау арқылы, бақылау сынамаларымен салыстыра отыра жүргізіледі. Реакция нәтижелері фотопленканың қараю қарқындылығына байланысты оқылады. Сынама енгізілген орнының қараюы зерттеуге алынған патологиялық материал құрамында белігілі бір вирустың нуклеин қышқылдарының бар екендігін білдіреді. Сонымен қатар реакция нәтижелерін таңбалауда қолданылған заттардың (флюорохром немесе фермент) түрлеріне қарай иммунды ферменттік талдау немесе иммунды флуоресценция реакциясымен де анықтауға болады. жүктеу/скачать 4.8 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|