Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология



жүктеу 493.66 Kb.
бет2/3
Дата17.06.2016
өлшемі493.66 Kb.
1   2   3

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение иммуностимулирующих свойств препаратов цитокинового ряда на экспериментальных моделях, включая модель с индуцированной иммуносупрессией, при иммунизации животных вакциной против гепатита В.


Валидация методов определения специфической активности препаратов рекомбинантных цитокинов человека - «Альнорин (рчФНОα)» и «Бефнорин (рчФНОβ)» и аттестация отраслевых стандартных образцов.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан» на интенсивность иммунного ответа животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

2. Установить дозы и схемы введения вакцины и препаратов цитокинов при иммунизации экспериментальных животных.

3. Изучить адъювантные свойства цитокинов на модели животных без иммуносупрессии и животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией при однократной и двукратной иммунизации вакциной против гепатита В.

4. Изучить влияние цитокинов на интенсивность иммунного ответа по уровню частоты сероконверсии и концентрации в сыворотке крови специфических антител (АТ).

5. Провести валидацию методов определения специфической активности препаратов рчФНОα и рчФНОβ с определением следующих характеристик – подлинность, воспроизводимость, повторяемость, линейность.

6. Разработать и аттестовать отраслевые стандартные образцы (ОСО) рчФНОα и рчФНОβ для определения специфической активности препаратов «Альнорин (рчФНОα)» и «Бефнорин (рчФНОβ)». Разработать нормативную документацию на стандартные образцы (ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ).


НАУЧНАЯ НОВИЗНА


Исследованные препараты цитокиновового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан», оказывают иммуноадъювантное действие при иммунизации экспериментальных животных вакциной против гепатита В.

Одновременное введение вакцины против гепатита В с препаратами цитокинов повышает интенсивность иммунного ответа животных, что сопровождается увеличением уровня сероконверсии и повышением концентрации специфических АТ по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без цитокинов.

При иммунизации животных низкими дозами вакцины выраженный иммунный ответ развивается только в случае использования вакцины в сочетании с цитокинами. Иммунный ответ на вакцину, вводимую с цитокинами, приближается к ответу, который развивается на большую дозу вакцины без цитокинов.

Уровень иммунного ответа животных с иммуносупрессией при иммунизации вакциной с препаратами цитокинов соответствует уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных аналогичными дозами АГ без цитокинов.

Проведена валидация методов определения специфической активности препаратов рчФНОα и рчФНОβ. Разработаны и аттестованы ОСО определения специфической

активности, оформлены нормативные документы на ОСО рчФНОα (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНОβ (ОСО 42-28-401-08).



ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Экспериментальные исследования позволили расширить представления об особенностях иммунного ответа иммунодефицитных животных и животных без иммуносупрессии на сопоставимые дозы АГ вакцины против гепатита В, вводимой без цитокинов или с цитокинами, используемыми в качестве иммуноадъювантов.

Результаты исследований показали, что изученные препараты цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин», а также препарат «Имунофан», повышают уровень иммунного ответа на специфический АГ вакцины против гепатита В, что свидетельствует о перспективности использования указанных препаратов в качестве адъювантов при вакцинации.

Результаты исследований на животных с индуцированной иммуносупрессией свидетельствуют о возможности использования препаратов цитокинов для стимуляции иммунного ответа при вакцинации лиц, имеющих проявления иммунодефицита (хронических инфекционных и онкологических заболеваниях, травмах, ожогах, ВИЧ-инфицированных, пациентов, находящихся на гемодиализе и др.).

Для усовершенствования и стандартизации методов контроля качества препаратов «Альнорин (рчФНОα)» и «Бефнорин (рчФНОβ)» проведена валидация методов определения их специфической активности и подлинности. Разработаны два ОСО, утверждены Свидетельства и Инструкции по применению - ОСО рчФНОα (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНОβ (ОСО 42-28-401-08), которые внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Методы оценки специфической активности внесены в проекты ФСП на вновь разрабатываемые в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Бердск) отечественные лекарственные препараты «Альнорин (рчФНОα)» и «Бефнорин (рчФНОβ)».

Разработанные и аттестованные ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ используются при контроле качества указанных препаратов по показателю специфической активности.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На экспериментальных моделях животных (без иммуносупрессии и с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией) показана эффективность использования исследованных препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан», в качестве адъювантов при иммунизации вакциной против гепатита В.

При одновременном введении вакцины с препаратами цитокинов отмечена их способность усиливать иммунный ответ. У животных наблюдается более высокая частота сероконверсии и большая концентрация специфических АТ по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без цитокинов.

Адъювантное действие цитокинов более демонстративно проявляется при использовании малых доз вакцины, на которые развивается слабый иммунный ответ в случае их использования без цитокинов, а также на экспериментальной модели животных с индуцированной иммуносупрессией.

Интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных при иммунизации низкой дозой вакцины, вводимой с препаратами цитокинов, приближается к интенсивности ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных аналогичными дозами вакцины без цитокинов.

На примере валидации методов определения специфической активности препаратов цитокинов рчФНОα и рчФНОβ предложен подход к валидации методов оценки специфической активности и других препаратов цитокинов. Установленные в процессе валидации характеристики позволили аттестовать два ОСО препаратов цитокинов -рчФНОα и рчФНОβ.


АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация прошла апробацию 21. 04. 2009 г. на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Основные положения диссертационной работы представлены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», Уфа, 2004; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; 6-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств», Москва, 2007; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008; ХIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в С-Петербурге», С-Петербург, 2009; Х Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 2009.


ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.


СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы и двух приложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 103 отечественных и 157 иностранных источников.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты по изучению адъювантных свойств препаратов цитокинов провели на 1303 мышах линии Balb/c (самки), весом 14 – 16 г.

Для иммунизации животных использовали вакцину против гепатита В «Engerix B» (фирма «GlaxoSmithKline», Бельгия). Вакцина содержит рекомбинантный НВsAg, полученный из дрожжевых клеток (Saccnharomyces cerevisiae), адсорбированный на 3% растворе гидроокиси алюминия.

В качестве иммуноадъювантов использовали следующие препараты:



  • «Беталейкин (интерлейкин 1-бета), лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного и подкожного введения» (ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА, г. С - Петербург);

  • «Ронколейкин (интерлейкин-2 человека рекомбинантный), раствор для внутривенного и подкожного введения» (ООО «Биотех», г. С-Петербург);

  • «Аффинолейкин» (Пермский Филиал ФГУП НПО «Микроген»);

  • «Имунофан» (ООО НПП «Бионокс», г. Москва).

Препараты рекомбинантных цитокинов человека, для которых проведена валидация методов контроля специфической активности, разработаны и аттестованы ОСО:

  • «Альнорин (рчФНОα), лиофилизат для приготовления раствора для инъекций»

  • «Бефнорин (рчФНОβ), лиофилизат для приготовления раствора для инъекций»

(ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Бердск).

В работе также использованы:



  • кроличьи поликлональные АТ к рчФНОα и АТ к рчФНОβ, любезно предоставленные сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»;

  • линия клеток мышиных фибробластов L-929, любезно предоставленная сотрудниками института Иммунологии (п. Любучаны);

  • актиномицин Д («Serva»);

  • «Циклофосфан» (ОАО «Биохимик», г. Саранск).

При аттестации ОСО использовали Международные стандартные образцы:

  • рчФНОα («NIBSC» Великобритания) 86/504, активность 40000 МЕ/мкг белка,

  • рчФНОβ («NIBSC» Великобритания) 87/640, активность 150000 МЕ/мкг белка.

Для определения в сыворотке крови экспериментальных животных специфических АТ к НВsAg использовали тест-систему «ВектоНВsAg-антитела-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск).

Схема иммунизации животных вакциной против гепатита В

Иммунизацию экспериментальных животных проводили вакциной против гепатита В «Engerix B». Использовали несколько доз вакцины, начиная с дозы 2,5 мкг/мышь до 0,003 мкг/мышь, которую вводили в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно, однократно или двукратно с интервалом в две недели. Разведения вакцины готовили на 3% растворе гидроокиси алюминия – Аl(OH)3, используя 3-х кратный шаг разведения.

Цитокины, применяемые в качестве иммуноадъювантов, использовали в виде монопрепаратов или в комплексе, включающем «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)». Цитокины вводили подкожно одновременно с вакциной однократно или двукратно.

При использовании монопрепаратов вводимая доза для каждого из цитокинов (расчет на 1 мышь) составляла: 10 нг для «Беталейкина (рчИЛ-1β)», 100 МЕ - «Ронколейкина (рчИЛ-2)», 1,0 ед - «Аффинолейкина», 0,05 мкг - «Имунофана» в объеме 0,5 мл. Дозы препаратов, вводимых в комплексе, составляли 5 нг для «Беталейкина (рчИЛ-1β)» и 50 МЕ - «Ронколейкина (рчИЛ-2)» (Лебедев В.В. с соавт., 1992; Акользина С.Е. 1996).

Для создания иммунодефицитного состояния животным до иммунизации ежедневно вводили циклофосфан в дозе 1 мг/мышь в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно. Курс введения включал три инъекции препарата ежедневно. Перед реиммунизацией животным также 3-х кратно вводили циклофосфан. Состояние иммуносупрессии оценивали по снижению количества нейтрофилов и лейкоцитов в периферической крови животных.

Интенсивность иммунного ответа животных, иммунизированных вакциной против гепатита В, оценивали по частоте сероконверсии (в %), концентрации в сыворотке специфических АТ к НВsAg. Оценку иммунного ответа проводили в динамике. Взятие крови проводили через 15 дней после первой иммунизации из ретроорбитального синуса и 15 дней после повторного введения АГ– тотально. Свежие образцы сывороток хранили при температуре от 2 до 8 ˚С не более одной недели. При длительном хранении образцы сывороток сохраняли при температуре минус 20˚С, подвергая оттаиванию однократно.


Определение уровня сероконверсии и концентрации АТ к НВsAg

Определение уровня сероконверсии и концентрации АТ к НВsAg в исследуемых образцах сыворотки экспериментальных животных проводили с использованием иммуноферментной тест-системы «ВектоНВsAg-антитела-стрип» (г. Новосибирск). При анализе результатов выделяли подгруппы животных, в сыворотке которых концентрация специфических АТ составляла менее 20, от 20 до 100 и выше 100 мМЕ/мл. В указанных подгруппах определяли средние значения концентрации специфических АТ и частоту выявления соответствующих уровней АТ (в %).


Определение специфической активности препаратов рчФНОα и рчФНОβ


Специфическая активность препаратов рчФНОα и рчФНОβ оценивается по их способности оказывать цитолитическое действие на клетки мышиных фибробластов L-929 в присутствии актиномицина Д. Предварительно подобранная «рабочая» концентрация актиномицина Д, присутствуя в среде для культивирования, должна вызывать не более 10% гибели клеток. РчФНО усиливает действие актиномицина Д, вызывая больший процент гибели клеток. Активность исследуемого образца оценивают по минимальной дозе, вызывающей гибель 50% клеток по сравнению с контролем, которым служат клетки, культивированные в среде, содержащей актиномицин Д в «рабочей» концентрации и не содержащей рчФНО. Уровень жизнеспособных клеток, сохранившихся после цитолитического действия рчФНО, оценивают путем определения оптической плотности (ОП) элюирующего раствора при длине волны 540 нм. Показатели ОП увеличиваются пропорционально количеству живых клеток, т.е. значения ОП обратно пропорциональны концентрации рчФНО в исследуемом образце. Определение специфической активности препаратов рчФНО проведено в сравнении с соответствующими Международными стандартными образцами (МСО) рчФНОα и рчФНОβ («NIBSC», Великобритания).
1   2   3


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет