Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология



жүктеу 493.66 Kb.
бет3/3
Дата17.06.2016
өлшемі493.66 Kb.
1   2   3

Реакция нейтрализации цитолитического действия рчФНО


Реакцию нейтрализации проводят с целью определения подлинности препаратов рчФНО (рчФНОα или рчФНОβ). Постановку реакции осуществляют с использованием специфических кроличьих сывороток, соответственно против рчФНОα или рчФНОβ. Препарат рчФНОα должен быть специфичен и его действие должно нейтрализоваться специфической кроличьей сывороткой против рчФНОα и не нейтрализоваться сывороткой к рчФНОβ. Соответственно, действие препарата рчФНОβ должно нейтрализоваться сывороткой против рчФНОβ и не нейтрализоваться сывороткой к рчФНОα. Препараты считаются подлинными, если «рабочее» разведение специфической сыворотки полностью нейтрализует определенную величину цитолитической ак­тивности (в МЕ) как исследуемых препаратов, так и стандартного образца.
Статистические методы обработки результатов. Статистическую обработку данных проводили на ПК с использованием стандартного пакета статистических программ «Statgrafics». Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t – критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение адъювантных свойств препаратов цитокинов при иммунизации экспериментальных животных вакциной против гепатита В

На экспериментальных моделях с индуцированной иммуносупрессией и без иммуносупрессии у животных было изучено влияние препаратов цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В.

1. Экспериментальные исследования на животных без иммуносупрессии.

Первоначально проведены эксперименты по выбору адекватных доз вакцины, используемых для иммунизации, которые вызывали низкий уровень иммунного ответа и позволяли оценить иммуноадъювантный эффект препаратов цитокинов. Животных иммунизировали однократно, используя разные дозы вакцины - 2,5; 0,83; 0,27; 0,09; 0,03; 0,01; 0,003 мкг/мышь. Установлены оптимальные дозы АГ - 0,27 и 0,09 мкг/мышь, при введении которых наблюдался низкий уровень иммунного ответа, частота сероконверсии составляла от 20% до 33%.

Далее проведены эксперименты по подбору доз цитокинов, стимулирующих развитие специфического иммунного ответа.

Изучена зависимость уровня иммунного ответа экспериментальных животных от схемы введения цитокинов. Вакцину вводили в ранее подобранных дозах однократно. Цитокины вводили с вакциной одновременно, за 2 дня или через 2 дня после введения вакцины. В условиях проведенных экспериментов сроки введения цитокинов, относительно введения вакцины, существенно не влияли на уровень иммунного ответа. В последующих экспериментах препараты цитокинов вводили одновременно с вакциной, поскольку одновременное введение максимально приближено к условиям практического применения адъювантов.

На следующем этапе исследования оценивали уровень сероконверсии животных при однократной иммунизации различными дозами вакцины (от 0,83 до 0,01 мкг/мышь) в сочетании с препаратами цитокинов «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)». Контролем служили животные, иммунизированные одной вакциной (Табл. 1).

Проведенные эксперименты показали, что уровень сероконверсии животных, иммунизированных вакциной в сочетании с цитокинами, выше, чем показатель в контрольной группе при сопоставлении ответа на аналогичные дозы (р<0,05).



Ответ на меньшие дозы вакцины, вводимой на фоне цитокинов, приближался к ответу на большую дозу вакцины. Уровень сероконверсии на 15 день эксперимента отмечен в 40 – 60% случаев после иммунизации вакциной в дозах 0,09 мкг и 0,27 мкг/мышь на фоне введения цитокинов. Аналогичный уровень сероконверсии (40%) отмечался у животных контрольной группы, иммунизированных одной вакциной в дозе 0,83 мкг/мышь. Более выраженный ответ наблюдали в группах животных, которым вакцину вводили в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)».
Таблица 1.

Оценка влияния препаратов цитокинов - «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)» на выраженность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В (однократная иммунизация)


Доза АГ при иммунизации

(мкг/мышь)

Количество сероположительных животных (в %)

АГ (контроль)

АГ+рчИЛ-1β

АГ+рчИЛ-2


15 день

30 день

15 день

30 день

15 день

30 день

0,83 (n=190)

40,0± 6,9

20,0± 5,7

50,0± 6,0**

33,3± 5,6

25,0± 5,2

20,0± 4,8

0,27 (n=185)

28,5± 3,3

17,1± 2,7

57,9± 4,9*

22,2± 4,1

47,8± 5,0*

21,0± 4,0

0,09 (n=160)

20,0± 5,2

0

60,0± 6,9*, **

25,0± 6,1*

40,0± 6,9*

30,0± 6,5*

0,03 (n=40)

0

0

16,0± 8,4*

10,0± 6,8*

20,0± 9,1*

0

0,01 (n=40)

0

0

10,0± 6,8*, **

0

0

16,0± 8,4*, **


Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

** - различие достоверно (р<0,05) между показателями опытных групп

- в таблице представлены результаты 4-х экспериментов

Следует отметить, что при иммунизации животных минимальными дозами вакцины (0,03 и 0,01 мкг/мышь) ответ наблюдали только в случае использования АГ в сочетании с цитокинами (рчИЛ-1β или рчИЛ-2), тогда как при введении одного АГ иммунный ответ не развивался.

В следующей серии экспериментов оценивали иммунный ответ животных после двукратной иммунизации (с интервалом 15 дней), используя ранее подобранные дозы вакцины (0,27 или 0,09 мкг/мышь). Цитокины - «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» вводили животным как на этапе иммунизации, так и реиммунизации. Схема экспериментов представлена на рисунке 1.



Рисунок 1. Схема экспериментов с использованием цитокинов на этапе иммунизации и

реиммунизации.


Перед реиммунизацией на 15 день эксперимента были выделены группы серонегативных и серопозитивных животных. Животные серонегативной группы были разделены на две подгруппы. Опытную подгруппу реиммунизировали вакциной в сочетании с препаратами цитокинов, контрольную – одной вакциной.

Результаты исследований на 30 день эксперимента представлены на рисунке 2.



*,**

*,**

*

*

Рисунок 2. Оценка влияния цитокинов («Беталейкин - рчИЛ-1β» и «Ронколейкин - рчИЛ-2») на выраженность иммунного ответа после реиммунизации серонегативных животных вакциной против гепатита В (30 день эксперимента).

Как видно из рисунка 2, при реиммунизации выделенной серонегативной подгруппы животных вакциной в сочетании с цитокинами, количество серопозитивных животных на 30 день эксперимента было больше по сравнению с животными контрольных групп, реиммунизированных одной вакциной. В группах с рчИЛ-1β при дозах вакцины 0,27 или 0,09 мкг/мышь уровень сероконверсии был в 2,3 и 4,5 раза выше (100%; 90,9%) по сравнению с контролем. Уровень сероконверсии в контроле составлял для дозы 0,27 мкг/мышь – 42,8%, 0,09 мкг/мышь - 20%. В группах с рчИЛ-2 количество серопозитивных животных было в 1,7 и 3,4 раза больше (75,0 %; 69,2%) по сравнению с контролем. Отмечено, что уровень иммунного ответа животных, реиммунизированных вакциной в сочетании с рчИЛ-1β, был выше по сравнению с группой животных, реиммунизированных АГ в сочетании с рчИЛ-2 (р<0,05).

Группа серопозитивных животных, выделенная на 15 день эксперимента после первичной иммунизации, была реиммунизирована одной вакциной. К 30 дню все животные остались серопозитивными.

В следующей серии экспериментов оценивали иммуноадъювантное действие комплекса препаратов цитокинов, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», а также препаратов «Аффинолейкин», «Имунофан», которые использованы как на этапе иммунизации, так и реиммунизации. Животных иммунизировали вакциной в дозе 0,27 мкг/мышь (рис. 3).

Результаты проведенных исследований показали, что все исследуемые препараты цитокинов проявляли иммуноадъювантное действие.


*

*

*

*

*

Рисунок 3. Оценка влияния препаратов цитокинов на выраженность иммунного ответа животных, иммунизированных вакциной против гепатита В в динамике (15 и 30 дни эксперимента).
Введение комплекса, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», было так же эффективно, как и ранее изученное индивидуальное введение указанных препаратов. Следует отметить, что стимулирующий эффект цитокинов наблюдался как на 15, так и на 30 дни эксперимента. Исключением является препарат «Аффинолейкин», его стимулирующее действие отмечено только на 30 день эксперимента, то есть после повторного введения с вакциной.

При реиммунизации животных в сочетании с комплексом препаратов цитокинов на 30 день эксперимента количество сероположительных животных было в 1,2 раза больше (85,8%) по сравнению с группой животных, иммунизированных одной вакциной (68,6%). При введении вакцины с препаратом «Аффинолейкин» количество сероположительных животных было в 1,2 раза больше (85,7%), с препаратом «Имунофан» в 1,3 раза больше (87,2%) по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, в результате исследований, проведенных на животных без индуцированной иммуносупрессии, установлено, что все используемые препараты цитокинов в виде монопрепаратов или комплекса цитокинов оказывали в различной степени иммуноадъювантное действие при иммунизации животных вакциной против гепатита В. Введение цитокинов одновременно с АГ приводило к увеличению числа серопозитивных животных по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ. Наибольшим стимулирующим эффектом обладал препарат «Беталейкин (рчИЛ-1β)» по сравнению с другими препаратами цитокинов.

Стимулирующий эффект цитокинов отмечен как после первичной иммунизации животных вакциной против гепатита В, так и после реиммунизации животных, которые оставались серонегативными через 2 недели после первичной иммунизации, по сравнению с животными, иммунизированными одной вакциной. Меньшие дозы вакцины, используемые в сочетании с цитокинами, вызывали иммунный ответ, сопоставимый с ответом на большие дозы вакцины, вводимые без иммуноадьювантов.



2. Экспериментальные исследования на животных с индуцированной иммуносупрессией.

Состояние иммуносупрессии вызывали двукратным курсом введения циклофосфана (перед иммунизацией и реиммунизацией). Использовали две дозы вакцины – 0,83 мкг и 0,27 мкг/мышь. Оценивали интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных (опытные группы) по сравнению с уровнем ответа животных без иммуносупрессии (контроль) на 15 день после иммунизации.

В результате проведенных исследований установлено, что иммунный ответ иммунодефицитных животных на одинаковые дозы вакцины был менее выраженным. Количество сероположительных животных в опытной группе было в 1,8 и 1,6 раза меньше (26,1±5,7% и 25,3±5,6%), соответственно двум дозам АГ (0,83 мкг и 0,27 мкг), по сравнению с контрольной группой животных. Количество сероположительных животных в контрольной группе составляло 48,5±6,5% и 40,1±6,3% при использовании двух вышеуказанных доз вакцины. Различия между сравниваемыми показателями опытной и контрольной групп статистически достоверны (р<0,05).

Животные опытной и контрольной групп на 15 день исследования были разделены на серонегативных и серопозитивных. Серонегативных животных реиммунизировали одним АГ или АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)». Схема построения эксперимента представлена на рисунке 4.






Рисунок 4. Схема экспериментов с использованием цитокинов на этапе реиммунизации.
Результаты исследования приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, к 30 дню эксперимента после реиммунизации группы серонегативных животных АГ в сочетании с рчИЛ-1β уровень иммунного ответа был значительно выше по сравнению с группой животных, реиммунизированных одним АГ. Так, в опытной группе иммунодефицитных животных, реиммунизированых АГ в сочетании с рчИЛ-1β, количество серопозитивных животных было в 1,7 и 1,2 раза больше (87,5% и 62,5%) по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ (55,5% и 50,0%), соответственно двум дозам АГ (0,83 и 0,27 мкг/мышь).

В контрольной группе животных без иммуносупрессии, после реиммунизации серонегативных животных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)», уровень сероконверсии был в 1,4 раза выше (100%) по сравнению с животными, реиммунизироваными одним АГ (68,6 и 70,0%, соответственно двум дозам АГ). Иммунный ответ иммунодефицитных животных (опытные группы) на одинаковые дозы вакцины был ниже по сравнению с животными без иммуносупрессии (контроль). Однако, следует отметить, что уровень иммунного ответа при использовании цитокинов у иммунодефицитных животных (62,5% - 87,5%) приближается к уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных одним АГ (68,6% - 70%).

Таблица 2.



Оценка выраженности иммунного ответа серонегативной группы животных после реиммунизации вакциной против гепатита В (30 день эксперимента)

Группа


Доза АГ

(мкг/мышь)

Реиммунизация

АГ

АГ + рчИЛ-1β


Контрольная (АГ)

(n=70)


0,83

68,6 ± 7,9

100

0,27

70,0 ± 7,8

100

Опытная (ЦФ +АГ)

(n=120)


0,83

55,5 ± 6,4

87,5 ± 4,3*, **

0,27

50,0 ± 6,5*

62,5 ± 6,3*


Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

** - различие достоверно (р<0,05) между показателями опытных групп

- в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

Серопозитивная группа животных была реиммунизирована одним АГ. У всех животных сохранялась сероконверсия до 30 дня эксперимента.



На следующем этапе исследования оценивали интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных, которым вводили цитокины - «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» как на этапе иммунизации, так и реиммунизации (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ в дозах 0,83 или 0,27 мкг/мышь.

Результаты исследований показали, что на 15 день после первичной иммунизации количество сероположительных животных, иммунизированных АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)», в 1,6 и 1,3 раза больше (42,3±6,4% и 35,1±6,2%), соответственно двум дозам АГ, по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ. После иммунизации АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» - в 1,5 и 1,2 раза больше (39,2±6,3% и 30,6±5,9%) по сравнению с контролем. Уровень сероконверсии в контрольной группе составил 26,1±5,7% и 25,3±5,6%, соответственно двум дозам АГ. Статистически значимое различие показателей отмечено в группе животных (доза 0,83 мкг/мышь), иммунизированных АГ в сочетании с рчИЛ-1β, по сравнению с контрольной группой.

Так же, как в предыдущей серии экспериментов, на 15 день животные были разделены на серонегативных, которым повторно вводили АГ или АГ в сочетании с цитокинами, и серопозитивных, которых реиммунизировали одним АГ.

Результаты исследований представлены на рисунке 5.

К

*
ак видно из рисунка 5, к 30 дню эксперимента при реиммунизации серонегативных животных АГ в сочетании с препаратами цитокинов уровень иммунного ответа был существенно выше по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ. Так, в группах животных, реиммунизированных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)», отмечена 100% сероконверсия соответственно двум дозам АГ 0,83 мкг и 0,27 мкг/мышь. При реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-2 сероконверсия наблюдалась в 85,7% и 100% случаев при двух указанных дозах. Тогда как при реиммунизации одним АГ – 87,5% - 82,1% и 66,6% - 80%, соответственно указанным группам животных.

Рисунок 5. Оценка влияния цитокинов (рчИЛ-1β и рчИЛ-2) на выраженность иммунного ответа серонегативной группы иммунодефицитных животных после реиммунизации (30 день эксперимента).
Группы сероположительных животных после реиммунизации АГ на 30 день эксперимента сохранили сероконверсию в 100% случаев.

3. Экспериментальные исследования по оценке эффективности иммунизации вакциной против гепатита В на животных с индуцированной иммуносупрессией по уровню специфических АТ.

В данной серии экспериментов оценивали уровень иммунного ответа по концентрации специфических АТ у животных с индуцированной иммуносупрессией (опытные группы) и животных без иммуносупрессии (контроль). На 15 день эксперимента были выделены серопозитивные животные опытной и контрольной групп, которых реиммунизировали одним АГ. При оценке результатов выделяли подгруппы животных с концентрацией АТ менее 20, от 20 до 100 и выше 100 мМЕ/мл. Определяли также средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) и частоту их выявления в каждой из подгрупп (в %). Результаты оценки уровня специфических АТ в динамике (на 15 и 30 дни эксперимента) приведены в таблицы 3.

Таблица 3.



Оценка концентрации АТ серопозитивной группы животных с иммунодефицитом и без иммунодефицита на 15 и 30 дни эксперимента

(иммунизация вакциной против гепатита В)


Группы животных


Концент

рация

АТ

(мМЕ/мл)

Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл)

(Диапазон выявляемых показателей уровня АТ)

Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

15 день

30 день

0,83

0,27

0,83

0,27



АГ контроль

ная

(n=90)


< 20


15,1±0,8

(12,3-19,6)

64,8±8,1


14,1±0,5

(12,9-15,9)

54,5±8,5


-

14,6±2,1

(12-19)


27,2±7,6

20-100


47,1±11,6

(25-74)


35,2±8,1

43,2±11,1

(27-72)


45,5±8,5

34,5±17,4

(23-86)


25,0±7,3

45,6±12,2

(23-64)


27,2±7,6

>100


-

-

420,6±65,2

(170-798)

75,0±7,3


452,0±131

(182-790)

45,6±8,5




ЦФ

+ АГ

опытная

(n=90)


< 20


13,3±1,3

(12-20)


84,5±4,7*

13,5±0,9

(12-19)


80±5,2*

-

19,1±0,4

(18-20)


60,0±10,3*

20-100


41,4±5,8

(23-62)


15,5±4,7*

44,5 ±14,6

(30-59)


20,0±5,2*

25,2±1,5

(21-34)


83,3±4,8*

42,7±4,3

(31-51)


40,0±6,3*

>100


-


-

160,5 ±19,6*

(141-180)

16,7±4,8*


-
Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

- в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

Как видно из таблицы 3, уровень иммунного ответа иммунодефицитных животных был ниже по сравнению с животными без иммунодефицита. Указанная закономерность отмечена как после однократного, так и после двукратного введения АГ. Так, на 15 день эксперимента в опытной группе иммунодефицитных животных максимальная концентрация АТ была в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл и частота их выявления в 2,3 раза ниже (15,5% и 20,0%) по сравнению с контрольной группой животных без иммуносупрессии - 35,2% и 45,5%, соответственно двум дозам АГ.

К 30 дню эксперимента (доза 0,83 мкг/мышь) в опытной и контрольной группах животных стали выявляться АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл. При этом в опытной группе количество животных с указанным уровнем АТ было в 4,5 раза меньше (16,7%) по сравнению с контрольной – 75,0%. При дозе 0,27 мкг/мышь в опытной группе концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной - выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл.

Средние значения концентрации АТ на 30 день эксперимента в опытной группе животных (доза 0,83 мкг/мышь) были в 2,6 раза ниже (160,5 мМЕ/мл) по сравнению с контрольной группой, где средние значения концентрации АТ составляли 420,6 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг отмечена аналогичная закономерность.

Таким образом, интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных на вакцину против гепатита В ниже по сравнению с животными без иммуносупрессии, об этом свидетельствует как более низкая частота выявления, так и более низкие уровни концентрации специфических АТ, определяемых на 15 и 30 дни эксперимента.

Анализ выделенной серонегативной группы животных будет приведен ниже в таблице 5.

Следующая серия экспериментов проведена на животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией, изначально иммунизированных АГ на фоне введения цитокинов - «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ.

На 15 день эксперимента были выделены группы серопозитивных животных, которых реиммунизировали одним АГ (Табл. 4).

Как видно из таблицы 4, на 15 день эксперимента при двух дозах АГ в опытной группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)», максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Животных с указанным уровнем АТ в опытной группе (доза АГ 0,83 мкг/мышь) было в 2,3 раза больше (35,0%) по сравнению с контрольной, иммунизированной одним АГ (15,5%). При дозе АГ 0,27 мкг наблюдалась аналогичная закономерность (соответственно 45% и 20%).

В группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» при двух дозах АГ, максимальная концентрация АТ находилась также в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Количество животных с указанной концентрацией АТ было в 2,4 и 1,5 раза больше (37,5%; 31,5%) по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных без цитокинов (15,5% и 20,0%), соответственно двум дозам АГ.

В группе животных с рчИЛ-1β (доза 0,83 мкг/мышь) на 30 день эксперимента стали выявляться АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл. Частота их выявления была в 2,7 раза больше (44,4%) по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ, где количество животных с указанной концентрацией АТ составляло 16,7%. При дозе АГ 0,27 мкг/мышь в опытной группе с рчИЛ-1β у 20% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл.

Таблица 4.



Оценка концентрации АТ серопозитивной группы иммунодефицитных животных

на 15 и 30 дни эксперимента

(иммунизация вакциной против гепатита В на фоне введения цитокинов)


Группы животных


Концентрация

АТ

(мМЕ/мл)

Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл)

(Диапазон выявляемых показателей уровня АТ)

Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

15 день

30 день

0,83

0,27

0,83

0,27



ЦФ+ АГ

контроль

ная

(n = 90)


< 20


13,3±1,3

(12-20)


84,5±4,7

13,5±0,9

(12-19)


80±5,2

-

19,1±0,4

(18-20)


60,0±10,3

20-100

41,4±5,8

(23-62)


15,5±4,7

44,5 ±14,6

(30-59)


20,0±5,2

25,2±1,5

(21-34)


83,3±4,8

42,7±4,3

(31-51)


40,0±6,3

>100

-


-

160,5 ±19,6

(141-180)

16,7±4,8


-



ЦФ

+ АГ

+ рчИЛ-1β

опытная

(n = 89)



< 20

18,4±0,4*

(17-20)


65,0±6,2*

19,1±0,4*

(17-20)


55,0±5,7*

17,6±1,2

(17-20)


16,8±4,8

17,8±0,7

(16,2-19,8)

40,0±6,3*


20-100

39,2±7,6

(21-80)


35,0±6,2*

46,3±3,2

(30-59)


45,0±5,7*

42,4±6,3*

(24-69)


38,8±6,3*

30,7±3,2*

(30-37)


40,0±6,3

>100

-

-

368,0±52,5*

(153-525)

44,4±6,4*


158,5±6,5*

(152-165)

20,0±5,2*




ЦФ

+ АГ

+ рчИЛ-2

опытная

(n = 90)


< 20

17,1 ±0,5*

(15-19)


62,5±6,3*

17,9±0,3*

(17-19,6)

68,5±6,0*


-

18,6±0,9

(18-20)


23,2±5,4*

20-100

32,8 ±5,0*

(20-48)


37,5±6,3*

26,8±2,2*

(21,2-32)

31,5±6,0*


43,0±3,9*

(20-56)


78,5±5,3*

40,7±6,3

(20-74)


61,5±6,3*

>100

-

-

215,0±34,9

(180-284)

21,5±5,3


156,0±25,2*

(131-181)

15,3±4,6*




Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

- в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

В группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» при дозе АГ 0,83 мкг/мышь, количество животных с концентрацией АТ выше 100 мМЕ/мл составляло 21,5%, что в 1,3 раза больше, чем в контрольной группе, иммунизированной одним АГ - 16,7%. При дозе АГ 0,27 мкг/мышь в опытной группе у 15,3% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл. В контрольной группе максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл.
Средние значения максимальных концентраций АТ (выше 100 мМЕ/мл) на 30 день эксперимента в опытной группе с рчИЛ-1β составляли 368,0 и 158,5 мМЕ/мл, с рчИЛ-2 – 215,0 и 156,0 мМЕ/мл, соответственно указанным дозам АГ. В контрольной группе животных, иммунизированных одним АГ, концентрация АТ была существенно ниже. Средняя концентрация АТ при дозе 0,83 мкг составляла 160,5 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ были в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл (среднее значение - 42,7 мМЕ/мл).

В результате проведенных исследований на иммунодефицитных животных установлено, что частота выявления специфических АТ и средние значения концентрации АТ были значительно выше в группах животных, иммунизированных вакциной в сочетании с препаратами цитокинов, по сравнению с контрольными животными, иммунизированными одной вакциной.



В следующем разделе работы проанализированы результаты обследования животных с индуцированной иммуносупрессией, иммунизированных одним АГ, которые оставались серонегативными до 15 дня после первичной иммунизации. Контролем служили животные без иммуносупрессии. Животные опытной и контрольной групп были реиммунизированы АГ или АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1β)». Концентрацию специфических АТ в исследуемых группах животных оценивали после реиммунизации (30 день эксперимента). Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, в опытной группе иммунодефицитных животных после реиммунизации одним АГ (доза 0,83 мкг) максимальные концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной группе выявлялись АТ выше 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опытной группе составляли 45,0 мМЕ/мл, в контрольной - 297,2 мМЕ/мл.

После реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-1β в опытной группе иммунодефицитных животных появились АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, и количество животных с указанной концентрацией АТ составляло 22,5%, что в 3,8 раза меньше по сравнению с контролем – 87,5%.

При реиммунизации АГ в дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ в опытной группе находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл и выявлялись у 50,0% животных, что в 1,4 раза меньше по сравнению с контролем – 70%. При использовании АГ в сочетании с рчИЛ-1β в опытной группе максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, в контрольной - выше 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опытных группах составили 21,9 мМЕ/мл (реиммунизация одним АГ) и 52,2 мМЕ/мл (реиммунизация АГ с рчИЛ-1β). В контроле - 42,0 и 414,5 мМЕ/мл, соответственно указанным группам.


Таблица 5.

Оценка концентрации АТ на 30 день эксперимента у животных, которые оставались серонегативными после первичной иммунизации вакциной против гепатита В



Иммунизация

животных


Концентра

ция

АТ

(мМЕ/мл)

Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл)

(Диапазон выявляемых показателей АТ)

Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

Реиммунизация животных

АГ

АГ + рчИЛ-1β

0,83

0,27

0,83

0,27



АГ

Контрольная

(n = 60)



< 20

-

16,5 ±1,4

(15-19,5)

30,0±7,8


-

19,0±0,1

(17-19)


9,0±4,9

20-100

65,0±16,2

(39-94)


42,8±8,4

42,0±4,5

(24-60)


70,0±7,8

28,0 ±2,0

(26-30)


12,5±5,6

52,2±7,9

(21-70)


54,5±8,5

>100

297,2±131

(160-90)


57,2±8,4

-


597±66

(282-800)

87,5±5,6


414,5±139,2

(180-680)

36,5±8,2




ЦФ + АГ

опытная

(n = 58)



< 20

17,5±0,9

(16,3-20)

22,0±5,3


16,3 ±0,8

(15-19)


50,0±6,5*

19,3±0,3

(19-20)


39,5±6,3

18,2±0,8

(16-20)


37,5±6,3*

20-100

45,0±18,0*

(22-80)


78,0±5,3*

21,9 ±0,5*

(20-23)


50,0±6,5*

46,0 ±15,3*

(20-70)


38,0±6,3*

52,2±13,6

(22-85)


62,5±6,3*

>100

-

-

240±121*

(120-360)

22,5±5,4*


-



Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

- в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

В результате проведенных исследований установлено, что средние значения концентрации АТ и частота встречаемости АТ в опытных группах иммунодефицитных животных были ниже по сравнению с животными контрольных групп без иммунодефицита. При реиммунизации АГ с рчИЛ-1β интенсивность иммунного ответа была выше по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ. Уровень иммунного ответа иммунодефицитных животных в случае их реиммунизации АГ в сочетании с цитокинами приближался к уровню ответа животных без иммунодефицита, реиммунизированных одним АГ.

В следующей серии экспериментов проанализированы результаты обследования иммунодефицитных животных, изначально иммунизированных АГ в сочетании с препаратами цитокинов, которые оставались серонегативными до 15 дня после первичной иммунизации. Выделенные группы серонегативных животных реиммунизировали АГ или АГ в сочетании с препаратами цитокинов - «Беталейкин (рчИЛ-1β)» или «Ронколейкин (рчИЛ-2)» (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ. Концентрацию специфических АТ оценивали после реиммунизации животных на 30 день эксперимента. Результаты исследования приведены в таблицы 6.

Как видно из таблицы 6, в опытной группе животных, иммунизированных АГ (доза 0,83 мкг) на фоне введения рчИЛ-1β, после реиммунизации одним АГ у 6,3% животных выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной группе максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ в исследуемых группах были в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, но частота выявления указанной концентрации АТ в опытной группе в 1,7 раза выше (87,5%) по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ (50%).

После реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-1β, концентрация АТ в сравниваемых группах была выше 100 мМЕ/мл, при этом частота выявления АТ в группе животных с рчИЛ-1β (доза 0,83 мкг) была в 1,5 раза выше (33,4%), по сравнению с контрольной группой иммунодефицитных животных (22,5%). Средняя концентрация АТ в опыте составила 288,0 мМЕ/мл, в контроле – 240,0 мМЕ/мл.

В группе животных, иммунизированных АГ (доза 0,83 мкг) с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)», после реиммунизации одним АГ у 25% животных выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контроле максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опыте - 142,0 мМЕ/мл, в контроле - 45,0 мМЕ/мл.

После реиммунизации АГ с рчИЛ-2 в опытной группе частота выявления и средняя концентрация АТ была выше по сравнению с контрольной группой. Так при дозе 0,83 мкг после реиммунизации АГ с рчИЛ-2 у 41,7% животных выявлялись АТ выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контроле концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опыте составили 464,0 мМЕ/мл, в контроле - 45,0 мМЕ/мл.

При дозе АГ 0,27 мкг после реиммунизации животных АГ или АГ с рчИЛ-2 отмечена аналогичная закономерность. У 45,4% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл (средние значения концентрации АТ 190,1 мМЕ/мл). Тогда как в контроле максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл (средние значения концентрации АТ 21,9 мМЕ/мл).


Таблица 6.

Оценка концентрации АТ в сыворотке крови на 30 день эксперимента у иммунодефицитных животных, которые оставались серонегативными после первичной иммунизации вакциной против гепатита В



Группы

животных


Концентра

ция

АТ

(мМЕ/мл)

Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл)

(Диапазон выявляемых показателей АТ)

Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

Реиммунизация животных

АГ

АГ + рчИЛ-1β

АГ + рчИЛ-2

0,83

0,27

0,83

0,27

0,83

0,27



ЦФ+АГ

контроль

ная

(n = 72)



< 20

17,5±0,9

(16,3-20)

22,0±5,3


16,3 ±0,8

(15-19)


50,0±6,5

19,3±0,3

(19-20)


39,5±6,3

18,2±0,8

(16-20)


37,5±6,3

-

-

20-100

45,0±18,0

(22-80)


78,0±5,3

21,9 ±0,5

(20-23)


50,0±6,5

46,0 ±15,3

(20-70)


38,0±6,3

52,2±13,6

(22-85)


62,5±6,3

-

-

>100

-

-

240±12,1

(120-360)

22,5±5,4


-

-

-



ЦФ

+ АГ

+ рчИЛ-1β

опытная

(n = 70)


< 20

18,1±0,8

(16-20)


25,1±5,6

17,0±1,0

(16-18)


12,5±4,3*

19,0±0,6

(18-20)


16,6±4,8*

17,6±1,6

(16,0-19,2)

11,1±4,0*


-

-

20-100

32,2 ±6,0

(22-80)


68,6±6,0

33,4 ±5,4*

(21-98)


87,5±4,3*

64,8±8,4

(29-98)


50,0±6,5

51,0±6,5

(32-90)


61,2±6,3

-

-

>100

143±11*

(132-154)

6,3±3,1*


-

288±74,5**

(141-567)

33,4±6,1**


192,0±31,2*,**

(138-306)

27,7±5,8*,**


-

-



ЦФ

+ АГ

+ рчИЛ-2

опытная

(n = 74)


< 20

-

17,9±0,4

(17,2-18,4)

30,0±5,9*


-

-

-

18,7±0,8

(18-20)


36,3±6,2*

20-100

43,6±8,9

(21-94)


75,0±5,6

35,8±3,3*

(26-45) 50,0±6,5




-

-

46,6±5,7

(30-78)


58,3±6,4*

45,0±3,0

(42-48)


18,3±5,0*

>100

142,0±9,8*

(134-141)

25,0±5,6*


113,5±11,5*

(102-125)

20,0±5,2*


-

-

464±13,8*,**

(100-820)

41,7±6,4*,**


190,1±3,5*,**

(131-314)

45,4±6,4*,**



Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

** - различие достоверно (р<0,05) между подгруппами животных,

реиммунизированных АГ или АГ в сочетании с цитокинами

- в таблице представлены результаты 3-х экспериментов


В результате проведенных исследований установлено, что интенсивность иммунного ответа в группах иммунодефицитных животных, иммунизированных и реиммунизированных на фоне введения препаратов цитокинов, выше по сравнению с контрольной группой иммунодефицитных животных, иммунизированных одним АГ.

Таким образом, проведенные исследования показали, что исследуемые препараты цитокинов являются эффективными иммуноадъювантами, специфически усиливающими иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации вакциной против гепатита В. Наиболее демонстративно иммуноадъювантное действие цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В в случае использования малых доз АГ проявляется на модели животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией, по сравнению с животными без иммуносупрессии. У животных с иммуносупрессией при первичной иммунизации АГ с цитокинами или реиммунизированных на фоне введения цитокинов, наблюдается более выраженный иммунный ответ по сравнению с животными, иммунизированными АГ без цитокинов. Отмечен более высокий уровень сероконверсии и большая частота встречаемости высоких концентраций специфических АТ. В случае использования исследуемых препаратов цитокинов как на этапе иммунизации, так и реиммунизации иммунодефицитных животных, уровень иммунного ответа приближается к уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных одним АГ.

Результаты проведенных исследований предопределяют возможность использования лекарственных препаратов цитокинов не только с терапевтической целью, но также в качестве иммуноадъювантов для обеспечения формирования адекватного поствакцинального иммунного ответа, что наиболее значимо для лиц с проявлениями иммунодефицита.


Валидация методов определения специфической активности и

разработка СО препаратов цитокинов - рчФНОα и рчФНОβ.

Для контроля качества как коммерческих, так и вновь разрабатываемых лекарственных препаратов МИБП должны использоваться стандартизованные аттестованные методы. Это в полной мере относится к методам оценки специфической активности препаратов МИБП. Кроме того, при осуществлении контроля производственных процессов, а также контроля качества готовых лекарственных средств, необходимо использование стандартных образцов.

В настоящее время разрабатываются новые отечественные лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков цитокинов человека. Одними из таких препаратов являются «Альнорин (рчФНОα)» и «Бефнорин (рчФНОβ)». Для указанных препаратов выполнен полный объем доклинических исследований, в настоящее время они находятся на второй фазе клинических испытаний.

С целью обеспечения контроля их качества следующий раздел работы включал исследования по валидации методики определения специфической активности указанных препаратов цитокинов (рчФНОα и рчФНОβ) и аттестации соответствующих ОСО.

Для определения повторяемости и воспроизводимости методики, оценки колебаний результатов анализа проводили исследования с разными схемами построения опытов - при одновременной постановке на одном и двух планшетах одного или нескольких образцов в одной лаборатории, а также в разные дни на разных планшетах нескольких образцов в двух лабораториях.

Исследования проведены в сравнении с Международными стандартными образцами, аттестованными «NIBSC» (Великобритания) – рчФНОα, активность 40 000 МЕ/мкг белка; рчФНОβ, активность 150 000 МЕ/мкг белка.

В результате проведенного исследования валидированы методики определения специфической активности препаратов цитокинов - рчФНОα и рчФНОβ. Используя валидированные методики, аттестованы два ОСО определения специфической активности соответствующих препаратов рчФНОα и рчФНОβ. Аттестованная активность ОСО рчФНОα 3,1 х 104 ± 0,3 х 104 МЕ/мкг белка, коэффициент вариации 25,1%. Активность ОСО рчФНОβ 6,8 х 104 ± 0,6 х 104 МЕ/мкг белка, коэффициент вариации – 19,1%.

Для определения срока годности ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ была проведена оценка стабильности препаратов методом ускоренного теста - при воздействии повышенных температурных режимов (37ºС, 65ºС, 95ºС) в течении различных промежутков времени (от 5 часов до 6 недель). Контролем служили образцы препаратов рчФНО, хранившиеся при температуре от 2 до 8˚С в течение 2 - 3,5 лет.

Проведенные исследования показали, что активность препаратов рчФНОα и рчФНОβ под воздействием различных температурных и временных режимов не меняется. Результаты наших исследований согласуются с данными ВОЗ, касающихся стабильности стандартных образцов препаратов рчФНО. Согласно данным ВОЗ, специфическая активность стандартных образцов препаратов рчФНО снижается на 0,01% в течение одного года в условиях хранения при температуре от 2 до 8˚С.

Установлен срок годности разработанных и аттестованных ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ - 3 года.

Оформлены и утверждены два Свидетельства и две Инструкции по применению - ОСО определения специфической активности рчФНОα (ОСО 42-28-400-08) и ОСО определения специфической активности рчФНОβ (ОСО 42-28-401-08). Разработанные ОСО внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.


ВЫВОДЫ

1. На экспериментальных моделях установлено, что препараты цитокинового ряда «Беталейкин (рчИЛ-1β)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан» усиливают иммунный ответ животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

2. Иммуноадъювантное действие цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В наиболее демонстративно проявляется на животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией.
3. При иммунизации или реиммунизации животных вакциной в сочетании с цитокинами, используемыми в виде монопрепаратов или комплекса, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1β)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», наблюдается более высокий уровень сероконверсии и частота выявления высоких концентраций специфических антител по сравнению с животными, иммунизированными без цитокинов.

4. У животных с индуцированной иммуносупрессией и без иммуносупрессии, иммунизированных и реиммунизированных вакциной против гепатита В в сочетании с цитокинами, уровень сероконверсии как на 15, так и на 30 сутки был существенно выше по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных вакциной без цитокинов.


5. Концентрация специфических антител у животных, иммунизированных и реиммунизированных вакциной с цитокинами, в 1,2 - 4,5 раза превышала уровень антител животных, иммунизированных без цитокинов.

6. Дозы вакцины, которые не индуцировали выработку антител, вызывали развитие иммунного ответа в случае их использования с цитокинами. Интенсивность иммунного ответа на малые дозы вакцины, используемой в сочетании с исследованными препаратами цитокинов, соответствует уровню ответа на большие дозы вакцины, вводимой без цитокинов.



7. Проведена валидация метода определения специфической активности препаратов рчФНОα и рчФНОβ с установлением следующих характеристик - воспроизводимости, повторяемости, линейности.
8. Разработаны два отраслевых стандартных образца определения специфической активности - ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ. Составлены и утверждены нормативные документы - на ОСО рчФНОα и ОСО рчФНОβ (Свидетельства и Инструкции по применению соответствующих ОСО). Разработанные ОСО рчФНОα (ОСО 42-28-400-08) и рчФНОβ (ОСО 42-28-401-08) внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Никитина Т.Н. Стимуляция поствакцинального иммунного ответа препаратами цитокинов при иммунизации животных вакциной против гепатита В // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых. «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». Уфа. - 2004. - С. 67.

  2. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов / Авдеева Ж.И. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва. – 2006. - С. 73.

  3. Никитина Т.Н. Препараты цитокинов как иммуноадъюванты при иммунизации вакциной «Энджерикс» / Авдеева Ж.И., Карпова Е.В. // Шестая межд. конференция «Клинические исследования лекарственных средств». – 2007. - С. 82-83.

  4. Авдеева Ж.И. Показатели клеточного иммунного ответа при иммунизации мышей антирабической вакциной на фоне цитокинов / Акользина С.Е., Алпатова Н.А., Никитина Т.Н., Медуницын Н.В. // Цитокины и воспаление. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 15-20.

  5. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов / Авдеева Ж.И. // Биопрепараты. – 2008. - № 1 (29). - С. 16-20.

  6. Никитина Т.Н. Разработка ОСО фактора некроза опухолей альфа / Авдеева Ж.И., Петухов В.Г., Масычева В.И. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва. – 2008. - С. 91.

  7. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов при иммунизации животных вакциной против гепатита В / Авдеева Ж.И. // Цитокины и воспаление. – 2009. – Т. 8, № 1. – С. 28-31.

  8. Никитина Т.Н. Цитокины как иммуноадъюванты / Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А. // Материалы XIII Всероссийскойго Научного форума с межд. участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». 8-12 июня 2009. Мед. иммунология – 2009. – Т. 11, № 4-5. – С. 328-329.

  9. Авдеева Ж.И. Отраслевые стандартные образцы определения специфической активности препаратов рекомбинантных цитокинов человека / Петухов В.Г., Никитина Т.Н., Алпатова Н.А. // Сб. Тр. Х Межд. Конгресса. «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвящ. 100-летию со дня рожд. акад. АМН А.Д. Адо, 20-23 мая 2009. Казань. – 2009. – С. 459-460.

  10. Авдеева Ж.И. Влияние цитокинов на иммуногенные свойства вакцины против клещевого энцефалита / Акользина Н.А., Алпатова Н.А., Никитина Т.Н., Ращепкина М.Н., Медуницын Н.В. // Цитокины и воспаление. – 2009. - Т. 8, № 2. - С. 16-21.

  11. Никитина Т.Н. Изучение иммуноадьювантного действия цитокинов на экспериментальных моделях / Авдеева Ж.И. // Цитокины и воспаление. - 2010. – Т. 9, № 2. - С. 31-34.


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ - антиген

АТ - антитела

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ИФ - интерферон

ИЛ - интерлейкин

КСФ - колониестимулирующий фактор

МЕ - международная единица

МСО - международный стандартный образец

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

ОСО - отраслевой стандартный образец

рчИЛ-1β - рекомбинантный ИЛ-1β человека

ФНО - фактор некроза опухолей

ЦФ - циклофосфан

NIBSC - National Biological Standards Board



1   2   3


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет