1 Зертханалық жұмыс (2 сағат) Тақырыбы

Жекеленген мүшелерді, ұлпаларды, жасушаларды және протопластарды сәтті өсірудің негізгі шарттардың бірі қатал зарасыздандыруды сақтау. Жасанды өсіруге арналған қоректік орталарда өсімдік ұлпаларда, жасушаларда микроорганизмдер жақсы дамиды да өсірілетін материалға қауіп туғызып жатады, сондықтан да мұқият зарасыздандыру өте қажет. Организмдердің тіршілік әрекеті нәтижесінде қоректік орталардың құрамы өзгереді. Одан басқа жкелеленген ұлпалар мен жасушалар протопластар ерекше тез микроорганизмдермен зақымданады. Сондықтан да барлық зертханалық жұмыстар жекелеген мүшелер, жасушаларн мен ұлпалар және өсімдік протопластары бойынша ламинар – бокстарда өткізіледі. Жұмысқа қажетті барлық материалдар, мақта пробкалары, қоректік орталар, өсімдік материалдар, ыдыстар, инструменттерді және боксты зарасыздандырылады.

Автоклафта қысым арқылы қатал зарасыздандыру өткізуге болады, себебі ылғалды ыстық микроорганизмдер мен олардың спораларын құрғақ ыстыққа қарағанда тиімдірек өлтіреді. Автоклавтан қақпағы бар стакандар, Петри ыдыстары, пипеткалар, тазартылған суы бар колбалар сияқты заттар өткізуге болады. Ыдыстарды фольгаға немесе қаптама қағазға орап, 2 атм автоклавтан 25 – 30 минут бойы өткізеді. Пипеткалардың жоғарғы бөлігін мақтамен жауып, пипеткаларды 10 данаман қағазға орайды.

Диацидті былай жасайды: жеке 330 мг этанолмеркурхлорид пен 660 мг цетилпиридинилхлоридті ыстық суда шамамен (300 мл) ерітеді, алған ерінділерді араластырып көлемін 1 литр дистилденген сумен және таға бірнеше тамшы детергент Твин-80 қосып жеткізеді.

Өсімдік ұлпаларды залалсыздандыру алдында оны тазартады. Өсімдіктердің жуан тамырларын, түйнектерді өте жақсы жылу сумен шеткамен және сабынмен жуады. Тамарлардан қабығын алады да дистилденген суда жуып бірнеше секундқа абсолютыспиртке салады. Негізгі залалсыздандаратын ерітіндінің әсерін спирт күшейтеді. Залалсыздандырған соң өсімдік объектілерін жақсылап залалсыздандырғыш заттардан жуып дистилденген суда шаяды.

Диацидтті кукурузаның астық ржи залалсыздандыруға пайдалануға,ал пергидроль фасоль, люпин, күнбағысқа, томат және т.б. залалсыздандыруға жақсы. Диацидпен тұқымды 15 -20 минут, ал пергидролмен 10 минут залалсыздандыру ауқыт алады.

Суық залалсыздандыру. Қыздыруға төзіп алмайтын органикалық сұйықтарды бактерииялардан тазартуды залалсыздандырғаш ұсақ поралы 0,45 мкм болатын бактериалды фильтрден өткізеді.

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.


Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі
1. Биотехнология зертханасында жұмыс істейтін барлық студенттер қауіпсіздік техника ережелерімен танысу керек.

2. Ыдыстарды детергент ерінділерде мұқият жуу (кір жуу ұнтағы,сабынды су).

3.Детергенттерден 8 – 10 рет жуу

4. Хромпикке 4 – 6 сағатқа салып, 10 рет жылы сумен жуып, одан кейін 5 дистелденген сумен рет шайып алу.

5. Таза ыдысты 2 сағат бойы 130-170°С кептіргіш шкафқа (сушильный шкаф) қояды.

6. Металл құрал – саймандарды өте тығыз орап қағазға салып, 170-200°С температурада 2 сағат бойы құрғақ ыстықпен заласыздандырады.

7. Құрғақ ыдыстарды, құрал заттарды целлофан немесе қағазға орап зертханалық сүрмелерде сақталуы тиіс.

8. Мурасиге-Скуга қоректік орта үшін маточный ерітіндіні дайындау. Ең алдымен макро-, микроэлементтердің және дәрумендерді маточный ерітінділерін жасау тиіс. Мурасиге және Скуга орталарға мынадай құрамды маточный ерітіндін жасаймыз: - NH₄NO₃, KNO₃, KH₂PO₄, MgSO₄ ^.7H₂O (MgSO₄ ^. 7H₂O соңғы құяды қыздырусыз соңғы құяды ол тұмбаның түсуін алдын алады.

- CaCl₂ ерітіндісі;

- темір хелат ерітіндісі ( FeSO₄ ерітіндісі және ЭДТА-Na₂, темір хелат түзілу үшін қайнағанша қыздыру керек.);

- микроэлементтер ерітнділері

Маточный ерітіндіні дайындау үшін тұз мөлшерін, сонымен қатар қоректік ортаны дайындау үшін қажетті маточный ерітіндінің мөлшерін келтірілген 1 таблицада көруге болады.

Алған ерітінділерді шыны ыдыстарда жабылатын пробкасы және этикеткасы бар тоңазытқыштарда сақтайды. Темір хелатын қараңғы шыныда сақтайды.

Концентірленген дәрумендер ерітінділерін флакондарда тоңазытқыштарда сақтайды. 1 мл бұл ерітіндіде 1 литр Мурасиге – Скуганың ерітіндіге қажетті мөлшерде дәрумен болады.

1. Залалсыздандыру дегеніміз не?

2. Ыдыстарды, құрал – саймандарды қалай залалсыздандырады?

3.Өсімдік объектілерін қандай әдістермен залалсыздандырады?

Шоғырланған жасушалар мен ұлпаларды өсіруге арналған қоректік орталарда өсімдіктерге қажетті барлық макроэлементтер, дәрумендер, көмірсулар, фитогормондар болуы тиіс. Кейбір қоректік орталарда гидролизат казеині мен белгілі бір аминқышқылдар болады. Осыдан басқа қорктік орталардың құрамына ЭДТА (этилендиаминтетрасірке қышқылы) немесе оның натрий тұзы жасушаларға темірді жеткізуге белгілі бір рН болады. Шоғырланған ұлпалар мен жасушаларды өсіру кезінде қоректік орталарда қажетті компоненттің бірі көмірсулар болып саналады, себебі олар автотрофты қоректенуге қабілетсіз болады. Әдетте көмірсулар көзі ретінде сахароза немесе глюкозаны 20 – 40 г/л концентрациясында қолданады. Жасушалар дифференциясы және жасушалық бөліну индукциялары үшін өсу реттеушілер қажет. Сондықтан да калустық ұлпаларды алу үшін қоректік орталардың құрамына жасушаның дедифференцировканы тудыратын аусиндер мен цитокиндер кіруі керек.

Әдетте қоректік орталарда ауксиндердің көзі ретінде 2,4 дихлрфиноксисірке қышқылын (2,4-Д), 1 – 10 мг/л; индолилсірке қышқылын (ИСҚ) (ИУК) 1 – 30мг/л және нафтилсірке қышқылын (НСҚ) – 0,1 – 2 мг/лпайдалынады (ИСҚ) 2,4 Д қарағанда 30 есе аздау болады. Каллус пайда болу индукциясына әдетте ауксиндердің жоғары концентрациясын пайдаланады, ал кейінгі көшіріліп отырғызу кезінде ұлпа өседі де ортадағы ауксиндердің құрамы бірнеше есе азайтлады.

Жасанды қоректіе қоспаларда цитокиндердің көзі ретінде кинетин 6 – бензилалинопурин (6-БАП),зеатин (0,001 – 10 мг/л) кинетинге қарағанда зеатин мен БАП шоғырланған ұлпалардың өсуін және органогенез индукциясын реттеуде белсендірек болады. Кейбір қорктік қоспалардың құрамына аденин кіреді.

Жеке қоректік орталарда ауксин мен цитокиндерден басқа гибберел қышқылы да (ГҚ) болады. Кейбір жағдайларда қорктік орталарға өсімдік экстрактылары мен шырындарын қосады. Өсуін ең белсендіргіш қасиеттке кокос мен сұйық кокос жаңғағының сұйық эндоспермі ие

Қатты қоректік орталарды дайындау үшін теңіз балдырлардан алатын агар – агар полисарид пайдалынады. Әдетте қатты қоректік қоспаны алу үшін ортаға 5 – 8 % қосады.

Макротұздардың микротұздардың және дәрумендердің ерітінділерін концентрленген түрде дайындау ыңғайлы. Маточный ерітінділерді тоңазытқышта, ал дәрумендерді теріс температурада сақтау керек.

Макротұздардың ерітінділерін 10 – 20 есе концентірленген, микротұздардың 100 – 1000 есе болса, ал дәрумендердің ерітінділері 1000 есе концентрленген болып дайындау керек.

Жасушаларды, ұлпаларды және өсімдіктердің белгілі бір мүшелерін өсіру үшін қоректік орталардың әр түрлі құрамын қолданады.

1, 2 кестедегі Мурасиге – Скуганың 3,4 .

Негізгі маткалық ерітінділердің макро және микроэлементтері, дәрумендер, фитогормондар, глицин, мезоноинозит, сахароза, агар (кесте 1)

50 – 1000 мл – лік химиялық стакандар және колбалар, негізгі маткалық ерітінделірді сақтау үшін 1 л пен 100 мл қақпаы тығындап жабылатын банкалар, 20 – 50 мл банкалар, 1 – 25 мл- лік өлшеуіш пипеткалар, магниттік араластырғыш зат, су банясы, автоклав, аналитикалық таразы, электроплитка.

Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі

1. 
   Макро және микроэлементтердің негізгі маткалық ерітінділерді, дәрумендерді,
   

2. 
   Мөлшері 1 л стаканға 1 л ортаны дайындау үшін питеткамен қажетті шығатын
   

3. 
   Көп мөлшерде емес дистилденген суды еріту (әрбіреуін жеке) мезо – инозит,
   

4. 
   Алынған сұйық қоректік ортаны стақаннан өлшеуіш цилиндарға құйып мөлшерін
   

5. 
   Қажетті pH – қа жеткізу. Егер pH қажетті көрсеткіштен жоғары болса бірнеше тамшы 1 H HCI, ал егер төмен болса бірнеше тамшы 1H NaON (KOH) өлшеуіш цилиндірге қосып жақсылап шайқаңыз. Ортаның біраз мөлшерін стаканға құйып pH анықтаңыз. Қажеттті көрсеткішке жеткенше pH өлшеңіз.
   
6. 
   6 -7 г пластинкалық агарды ортасы бар стақанға құйып, плитқада қыздыра отырып еріту қатты қыздыруға жеткізбеу.
   
7. 
   Қоректік ортаны 50 -60 С дейін қыздырып, агардық ыстық ерітіндімен біріктіру. Ұнтақ тәрізді агарды тікелей ортаға қосуға болады.
   
8. 
   Ортаның мөлшерін жылы дистилденген сумен 1 л – ге дейін жеткізіп, жақсылап араластырыңыз.
   
9. 
   Дайын қоректік ортаны 1/ 4 мөлшермен пробиркаларға құып, пробиркаларды мақта немесе фольга тығындысымен жауып, металл штативтерге пробиркаларды қою.
   
10. 
    Штативтерді автоклавқа қойып 15 мин бойы 0,7 – 1 атм қысымда автоклавтау керек.
    

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша

көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі

кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.
Бақылау сұрақтары :

1. Жекелеген жасушалар мен ұлпаларда қоректік орталардың құрамы қандай?

2 Қоректік орталарда ауксиедер ретінде қандай заттар қолданады?

3.Маткалық ерітінділер дегеніміз не және оларды қалай дайындайды?