Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева. Задания

1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae и аспорогннных дрожжей;

2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей;

3) определить содержание гликогена и метахроматина в дрожжевых клетках;

4) подсчитать количество нежизнеспособных дрожжевых клеток в исследуемой суспензии;

5) подсчитать количество дрожжевых клеток в исследуемой суспензии с помощью счетной камеры Горяева.

Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8^Х и 40^Х.

Оборудование и материалы: предмет­ные и покровные стекла; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см³), раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1 : 40, бензин, набор красок, раствор йода, иммерсион­ное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candi­da, Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces.
Теоретические сведения.
По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточ­ные микроскопические организмы, относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15 мкм. Они встречаются среди различных классов высших гри­бов: аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных гри­бов. Растут дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую, апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33).

Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий, включает оболочку, цитоплазму, диф­ференцированное ядро и другие фрагменты. Оболочка дрож­жей легко просматривается в обычном световом микро­скопе. Содержимое клеток дрожжей на ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появля­ются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуо­лей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры: в молодых клетках дрожжей вакуо­ли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате нарушения взаимодейст­вия коллоидов внутри клетки.

В клетках дрожжей накапливается большое количест­во запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира, а в вакуолях—волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифос­фаты.

Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При почковании на по­верхности клетки образуется один или несколько бугор­ков — почек, которые постепенно увеличиваются. Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки, после чего происходит деление ядер. В почку из мате­ринской клетки переходит часть протоплазмы и элемен­ты ядра, после чего между двумя клетками образуется поперечная перегородка и почка отшнуровывается. Иног­да почки, еще не отделившиеся, начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток (рис. 35).

При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного размножения путем почкования. Обычно спорообразование наблюдается при истощении питатель­ной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выра­щивать в постоянно обновляемой среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только почко­ванием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду, бедную питательными субстратами, как большинство кле­ток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рас­сматривается как аск (сумка), а споры — как аскоспоры.

К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты).

Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в ме­ньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, обра­зование спор у дрожжей — это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых форм.

Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования од­ной или нескольких поперечных перегородок. Такой спо­соб размножения наблюда­ется, например, у представи­телей рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces.

Дрожжи способны раз­лагать различные сахара. Поэтому они встречаются там, где происходит выделе­ние богатых сахаром соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для производства кефира.

В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces ce­revisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности.

Класс несовершенных грибов объединяет аспорогенные, (ложные) дрожжи, неспособные к половому размно­жению и образованию спор. К ним относятся представители рода Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia и др. На твердых питательных средах такие организмы так же, как и сахаромицеты, образуют колонии раз­личной консистенции. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающую их от других видов: стреловидную, треугольную, серповидную или колбовидную. Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия. Они представляют собой довольно крупные одноклеточные организмы, в среднем 5 – 9 х 7 – 12 мкм, не образуют истинного мицелия, но могут вытягиваться в длину, сое­диняясь в цепочки. Такие образования называют псевдо­мицелием. Размножаются только почко­ванием, довольно широко распрост­ранены в природе. Они встречаются в различных водое­мах, в почвах, на растениях, продуктах питания, в орга­низме человека и животных. Некоторые виды Candida вызывают заболевание, называемое кандидозом, в биотехнологии используются для получения кормового белка при вы­ращивании их на промышленных отходах (например, уг­леводородах), для получения некоторых аминокислот (Candida utilis для получения триптофана), витаминов (Candida guilliermondii для получения витамина В₂ – рибофлавина).

Широко распространенными являются также дрожжи рода Torulopsis, различные их виды используются в производстве сбраживаемых напитков типа кумыса, но вызывают болез­ни пива и некоторых других продуктов, получаемых путем броже­ния. Эти болезни проявляются в потере аромата, появле­нии неприятного запаха или ослизнения.

Для обнаруже­ния гликогена используют крепкий раствор йода в йодистом калии (7 г йода + 20 г йодистого калия + 100 см³ воды). На пред­метное стекло наносят небольшую каплю раствора йода и размеши­вают в ней петлей такую же каплю жидкой культуры дрожжей. На пре­парат накладывают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и через 2—3 мин микроскопируют. Наличие в цитоплазме бурых зернышек или крапинок указывает на присутствие гликогена. Пе­ред обработкой раствором йода рекомендуется обезжи­ривать препарат путем фиксирования в смеси спирта с эфиром (1 : 2). Это делается для того, чтобы удалить из клетки жир, который тоже отчасти окрашивается йодом. При подогревании окрашенного йодом препарата до 60° С красно-бурая окраска гликогена исчезает, а после охлаждения восстанавливается. Иногда гликогену может быть примешана гранулеза, и при слабом рас­творе йода получается синее окрашивание, при креп­ком — красно-бурое. На препарате сахаромицетов много почкующихся клеток. Поскольку гликоген активно расходуется в процессе метаболизма, то его можно обнаружить только в материнских клетках. В зависимости от количества накопленного углевода их цвет может меняться от ярко-желтого до бурого. В растущих клетках (почках) гликоген как правило не обнаруживается.

Для обнаружения волютина в дрожжах используют расу XII дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на твердой питательной среде. Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На предметное стекло наносят каплю воды, петлей в форме замкнутого кольца вносят в неё культуру дрожжей, распределяют равномерно и круговыми движениями делают тонкий мазок на площади 1 – 2 см². Препарат высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают метиленовым синим по Лёфлеру (1,5 – 2 мин), после чего смывают краситель водой и обрабатывают препарат раствором серной кислоты с массовой долей 5 % в течение 5 – 7 сек. Кислоту смывают водой, препарат высушивают и просматривают с иммерсионным объективом. Цитоплазма дрожжевых клеток при этом окрашивается в голубой цвет, а гранулы полифосфатов – в синий. Можно окрашивать фиксированные препараты 20-30 с карболовым фуксином Циля. Через 0,5-1,0 мин промыть препарат водой, обесцветить 20-30 с раствором Н₂SO₄ с массовой долей 1%, промыть, дополнительно окрасить 20-30 с метиленовым синим (1 : 40), промыть, промокнуть, просмотреть с иммерсионной системой. Гранулы волютина приобретают красный цвет, цитоплазма – синий.

Сетка камеры Горяева разделена на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата равна ¹/₂₅ мм² и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна ¹/₂₀ мм, площадь – ¹/₄₀₀ мм². Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена.

Камеру и специальное шлифованное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят не­большую каплю исследуемой суспензии, накрывают шлифованным стеклом и притирают покровное стекло к боковым площадкам. Жидкость под покровным стеклом должна растекаться по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для того чтобы объем жидкости точно соответствовал расчетному объему камеры, покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления цветных колец (можно вначале притереть стекло, а потом из пипетки осторожно заполнить камеру). Под­счет клеток рекомендуется производить через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и распо­ложились в одной плоскости. Подвижные формы микроорганизмов перед нанесением на сетку следует убить нагреванием или добавлением 0,5 % формалина.

Камеру помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают с объективом 8^Х или 40^X (в зависимости от размеров клеток изучаемого объекта). Для получения достоверных результатов подсчет следует про­водить в 5 больших или 20 малых квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре в трех препаратах. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата; клетки, расположенные вне квадрата, не учитывают.

Количество клеток в 1 мл исходной суспензии:

,
где С – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры, мм;

S – площадь квадрата сетки, мм²;

n – степень разведения исходной суспензии;

1000 мм³ = 1 мл.

1. 
   К каким группам грибов относятся дрожжи?
   
2. 
   Назовите физиологические признаки дрожжей. Где используются дрожжи?
   
3. 
   Опишите форму клеток дрожжей и способы их размножения.
   
4. 
   Дайте характеристику аспорогенных дрожжей.
   
5. 
   Какие включения клеток дрожжей Вы знаете?
   
6. 
   Как обнаруживается волютин в дрожжах?
   
7. 
   Как определить способность дрожжей к размножению?
   
8. 
   Как обнаружить гликоген в клетках дрожжей?
   
9. 
   Каким методом можно определить количество дрожжей в 1мм суспензии?