Полисахарид-k увеличивает доцетаксел-индуцированной подавления опухоли и противоопухолевый иммунный ответ в иммунокомпетентных мышиная модель человеческого рака предстательной железы

CYNTHIA A. ВЕННЕР1
MARK R. MARTZEN1
РОДОМ ЛУ3
MICHAEL R. VERNERIS2
ХУНБО ВАНГ2
ДЖОЭЛ W. SLATON2
	1Bastyr университет научно-Исследовательский институт, Kenmore, WA 98028
	2Кафедрами Детской Крови и Трансплантации костного Мозга и Урологическая Хирургия, университет Миннесоты, MN 55455
	3Противоопухолевой Вакцины Группы, Центра Трансляционной Медицины в области охраны Здоровья Женщин, University of Washington, Seattle, WA 98109, США
	Корреспонденция: Адрес для корреспонденции: Д-р Cynthia A. Веннер, Bastyr университет научно-Исследовательский институт, 14500 Хуанита Dr NE, Kenmore, WA 98028, США, E-mail: cindyw@bastyr.edu

Введение

Рак предстательной железы является второй наиболее распространенной формы рака с пятой-высшей стандартизованные по возрасту коэффициенты смертности мужчин в мире (¹). В отличие от локализованной болезни, которые можно вылечить с помощью ряда терапевтических стратегий, расширенный рак предстательной железы, метастазы и гормон-упорный имеет ограниченные возможности лечения, которые предлагают лишь временными болезнями (²).

В 2005 г. FDA одобрило препарат для лечения метастатического кастрации-упорный рака простаты после двух рандомизированных клинических исследованиях было продемонстрировано увеличение продолжительности жизни за то стандарт обслуживания, митоксантрон и поддерживающая терапия (³,⁴). Доцетаксел стала стандартной химиотерапии лечение и строительный материал для новых терапевтических подходов к метастатический гормон-трудноизлечимого заболевания. Доцетаксел актов по стабилизации микротрубочек в митотических веретен, непосредственно ингибирования процесса деления клетки (⁵,⁶). Потому что доцетаксел является цитостатическим всем деления клеток, индуцирует миелосупрессии и нейтропения в терапевтических дозах (⁷,⁸), ограничивая ее терапевтический потенциал.

Иммунотерапию предложить потенциальным средством для улучшения клинической эффективности доцетаксел, побуждая противоопухолевые иммунные реакции, в связи с доцетаксел прямое противоопухолевое действие. Несколько видов иммунотерапии в настоящее время разрабатываются или используются в лечении рака. Дендритные клетки вакцины sipuleucel-T (Provenge^®), был одобрен FDA в 2010 году после III фазы показали 38% увеличение в 3-летняя общая выживаемость с медиана выживаемости преимущество 4.1 месяцев, по сравнению с плацебо у мужчин с метастатическим кастрации-упорный предстательной железы (ЦПКР) (⁹). Клинические испытания объединения вакцины терапии и доцетаксела в прогресс (¹⁰). Второй еще более недавно одобренных FDA иммунотерапии наркотиков, ipilimumab (Yervoy^®), очеловечению анти-стга-4 наркотиков, показало, увеличение продолжительности жизни больных меланомой и несколько испытаний, чтобы оценить его эффективность при лечении рака простаты были сделать, или ведутся (¹¹-¹⁵). Эти перспективных видов иммунотерапии поддерживают гипотезу о том, что объединение фармакологических агентов Роман с иммунной терапии может привести к подавления опухоли и выживаемость.

Полисахарид-K (PSK) фармацевтического качества экстракта грибов Trametes versicolor используется во всей Азии в качестве вспомогательного лечения рака из-за своей сообщили прямое противоопухолевое действие, антиметастатической действия и иммунной модулирующее свойства (¹⁶). PSK недавно было показано, что TLR2-агонист деятельности и существенно подавлять рак груди роста в neu трансгенных мышей в CD8⁺ Клеток т - и NK-лимфоцитов-зависимым способом (¹⁷). Роль киллеров в противоопухолевого действия PSK далее подкрепляется результатами более раннего исследования, показывающие, что PSK удлиненный опухоли удваивается раз и увеличения среднего времени выживания в Т-клеток-дефицитных, но не NK-дефицитных мышей опора человеческих опухолей простаты (¹⁸). Ряд рандомизированных проспективных клинических испытаниях устные администрация PSK в сочетании с химиотерапией показал повышение выживаемости для легких (¹⁹,²⁰), молочной железы (²¹), желудка (²²,²³), и колоректального (²⁴ рака. PSK в сочетании с доцетаксел показал усиленной противоопухолевой активностью против человеческой поджелудочной железы (²⁵) и желудка (²⁶) раковых клеток, и в мышиной модели ксенотрансплантата рака желудка (²⁶,²⁷). Взятые вместе, эти результаты показывают, что сочетание PSK с доцетаксел химиотерапия может повысить доцетаксел опухоли угнетающего действия и предполагают, что PSK того, возможно увеличение Т-лимфоцитов и NK-лимфоцитов-зависимые противоопухолевой ответы.

Несмотря на эти обнадеживающие предварительные данные, последствия орального приема PSK доцетаксел-индуцированной противоопухолевой ответы в иммунокомпетентных предстательной железы установка пока еще неизвестно. Это исследование было проведено, чтобы выяснить, возможно ли совмещение перорально (PSK с доцетаксел безопасен ли он усиливает доцетаксел-индуцированной терапевтических ответы и противоопухолевой ответы в БРОДЯГУ-C2 опухоли простаты-подшипник мышей.

Материалы и методы

Реагенты

PSK был подарен Kureha Химической Промышленности (Токио, Япония) и доцетаксел, полученные от Санофи-Авентис США (Бриджуотер, штат Нью-Джерси).

Антитела и окрашивание реагентов

CD4 и CD8 основной АБС были получены от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния). Анти-Ki67 была получена от Dako (Копенгаген, Дания). ТУНЕЛИ окрашивание набор был получен от R&D Systems (Миннеаполис, MN). Азбука Вектор окрашивание набор (Вектор Labs, Бурлингейм, CA) был использован для люминесцентных вторичного окрашивание в некоторых случаях. Кролик поликлональных IgG против расщепляется каспазы-3 (Asp 175) (специально для мыши, крысы и человека расщепляется каспазы-3) был получен из Клеточных сигналов Технологии (Беверли, МАССАЧУСЕТС).

Мышиные предстательной железы модели и терапии

Мышь опухоли простаты БРОДЯГА-C2) клеток (American Type Culture Collection, Манассас, VA) вводили orthotopically в мышам линии C57BL/6 (Charles River, Wilmington, MA) после изучения протокола, утвержденными в университете Миннесоты Институциональный Уход за животными и их Использование Комитет. Эта процедура проводилась под общим наркозом (изофлюрана). Опухоли было позволено расти в течение примерно двух недель. Рост опухоли, был проведен мониторинг с помощью пальпации простаты; раковых опухолей представить, как затвердевшей массы в месте инъекции. После этого периода, мышей были рандомизированы в одну из четырех групп лечения: 1) засоленных управления; 2) доцетаксел только; 3) PSK; 4) доцетаксел плюс PSK. Контроль мыши, получившие засоленных ежедневно через оральный питья, а также два раза в неделю засоленных внутрибрюшинного (в / б.) инъекции. Доцетаксел только лечение, группа получила доцетаксел (5 мг/кг) вводили внутрибрюшинно. два раза в неделю и засоленных управления транспортным средством повседневной устной желудочный зонд. PSK только лечение, группа получила PSK (300 мг/кг) ежедневно в устной желудочный зонд и И.П. инъекции солевого два раза в неделю. Доцетаксел + PSK лечения группа получила PSK (300 мг/кг) ежедневно в устной желудочный зонд и доцетаксел (5 мг/кг) в / б. инъекции два раза в неделю. Инъекции, которые были сказаны в 100 мкл томов. Мышей были взвешены, и в любой другой день. Группы получали лечение в течение 11-13 дней до мышей были принесены в жертву и конкретные органы извлекаются для конечных точек мониторинга. Опухоли простаты были иссечены и весил, и опухоли и селезенки были использованы для определения концентрации и активности различных типов иммунных клеток. Иссекают опухоли были также проанализированы для пролиферации и апоптоза. Кровь была собрана для определения лейкоцитов и анализа печеночной и почечной функции для оценки безопасности.

Затвердевает и эозином окрашивание тканей

Чтобы проверить наличие опухоли, замороженных срезов тканей опухоли (4 мкм), были подвергнуты затвердевает и эозином окрашивание. Разделы были помещены в дистиллированной воде и ядер витражи с квасцами затвердевает в течение 4 минут (мин), затем промыть их водой. Разделы были затем обработаны с 0.3% кислоты, алкоголя и промыть. Слайды были затем обработаны с эозином в течение 2 мин, промыть, обезвоженной, установлены и исследованы на наличие опухоли.

Иммуногистохимии для Ki67 и TUNEL апоптоза анализа

Незапятнанная серийный замороженных участков опухоли были сокращены в 4-микронной толщины и помещен в фосфатный буферизованный солевой раствор (PBS). Разделы были подвержены 1-1,000 разбавления Ki67 (Dako) и выдерживают 1 час (h) в 37 градусов C. Все слайды инкубировали с соответствующими биотинилированного Вторичное антитело: козлиные анти-кроличьи IgG (Вектор), в течение 20 мин при 37 градусов C. клетки были тогда насчитали, как описано ниже. Другие близлежащие разделы использовались для иммуно-дневные окрашивание обнаружить присутствие апоптоза с помощью TUNEL апоптоза набо для анализа (R&D Systems) согласно протоколу фирмы-изготовителя. Кратко, слайды были обработаны с протеиназа-K в течение 30 мин при температуре 37 ОС и инкубируется с терминала deoxynucleotidyl трансферазы конце маркировки коктейль (терминал deoxynucleotidyl трансферазы буфера, биотин-dUTP, и терминал deoxynucleotidyl трансферазы в соотношении 90:5:5) в течение 120 минут при 37 градусов C. Это было следовать путем наложения авидин-FITC (зеленый) раствор (50 мкл) в кружок, и инкубации в темноте в течение 60 мин при 37 градусов C.

Определение WBC графов

Во время жертвоприношения, мышей были успокоительное, и сердце, пробитое с 25 калибра иглы и 500-1,000 мкл крови удалены для WBC анализ с использованием Coulter Счетчика (Beckman Coulter, Бреа (Калифорния).

Печеночная и почечная функция анализа

Для оценки токсичности различных процедур, образцы плазмы, полученных от мышей (N=4) в каждой группе лечения во время жертвоприношения (11-13 дней после лечения) были протестированы на стандартных параметров печеночной и почечной функции, в том числе аланин-трансаминазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинина (Cr), азот мочевины крови (BUN), альбумина и общего белка.

Цитокина и цитолитической гена Foxp3 экспрессии мРНК

Чтобы оценить выражение гамма-интерферона, IL-2, TNF-a, TGF-b, perforin, granzyme B и FoxP3 генов, рибонуклеиновой кислоты (РНК) был изолирован от опухолей с помощью RNAqueous4PCR kit (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). Целостность РНК была проверена с помощью хроматографа Agilent биоанализатор (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Взаимодополняющие дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) была создана 5 мкг РНК надстрочного индекса III обратной транскриптазы (Invitrogen, San Diego, CA) с олиго-dT грунтовками в соответствии с инструкциями производителя протокола. CDNA (5 мкл), разведенным 1:40 был использован в качестве шаблона для real-time PCR анализа. Праймеры и зонды (FAM-МГБ) для TaqMan на основе генной экспрессии анализы были приобретены от Applied Biosystems (Фостер-Сити, CA). Real-time ПЦР проводили в 384 хорошо тонкостенных пластины с помощью ПЦР ABI PRISM 7900HT при следующих условиях: начальный денатурация при температуре 95 C в течение 10 мин, затем по 40 циклов денатурация при температуре 95 C в течение 15 секунд, а расход отжига/добавочный шаг 60 градусов C в течение 1 мин. Анализ данных проводился с использованием SDS 2.21 (Applied Biosystems). В матричной РНК (мРНК) уровень экспрессии целевого гена был нормирован на бета-актина, используя;_Т метод. Уровень экспрессии=2^-ΔCT, где C_Т=C_{T целевого гена}-C_{T актина}. CT-это цикл порог, при котором сигнал флуоресценции кресты произвольное значение.

Проточная цитометрия для иммунофенотипирования и анализ апоптоза клеток селезенки

После жертву, селезенки, были сняты, и каждый селезенки, оказываемых одной клеточной суспензии с помощью стандартных методов (²⁸). Красные кровяные клетки были лизированных при гипотонических СМИ (ACK lysing буфера, Lonza, Inc. Walkersville, MD) в течение 3-5 минут, а затем мононуклеарных клеток промывали PBS в два раза. Примерно 10⁵-10⁶ клетки окрашивали на льду с ФК блок (BD Pharmingen, San Diego, CA) в течение 15 мин, с последующим добавлением флюрохром-меченых мат для указанной ячейки поверхностных маркеров для иммунофенотипирования, и аннексина V и пропидия анализ апоптоза. Клетки отмывали и ресуспендировали и анализируется FACSCanto проточный цитометр и FlowJo программного обеспечения (BD Biosciences, San Jose, CA).

Двойной флуоресценции для иммуногистохимии каспазы-3, а число лимфоцитов CD4/CD8

Секции замороженных опухолей (6-8 из каждой группы) были сокращены до 4 микрон толщиной. Непосредственно перед immunolabeling, разделы заново были исправлены в холодном ацетоне, уравновешиваются в PBS-сапонин и инкубировали 5% обычной козы (или осел), сыворотку в течение 1 ч при 37 градусов C. После стирки они инкубировали с кроличьими анти-каспазы-3 (1:75), 48-60 ч при 4 C, с последующим добавлением козлиные анти-кроличьи IgG биотин (1:100; Джексон ImmunoResearch Лабораторий, Западно-Гроув, штат Пенсильвания) в течение 1 ч при 37 градусов C. Анти-каспазы-3 Ab обнаруживает только большой фрагмент активации каспазы-3 (17-19 кДа), полученного в результате расщепления после Asp 175 и не признает других каспаз. Разделы были регулярно мыть в избытке PBS, pH 7,5, содержащие 0,3% сапонина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в конце каждого шага инкубации, и тот же буфер используется в качестве разбавителя образцов во все реагенты для иммуногистохимии каспазы-3. Эти разделы инкубировали с стрептавидин Техас (1:100; Джексон ImmunoResearch Лабораторий) в течение 1 ч при 37 градусов C. Каждый раздел был инкубируются с крыса антител либо CD4 или CD8. Разделы были отмыты с PBS и подвергается козлиный анти-крыс вторичных антител и свинья IgG-FITC (1:50; Джексон ImmunoResearch Лабораторий). Разделы были отмыты и подготовлены для флуоресцентной микроскопии. Слайды были изучены с Nikon ТЭ2,000-U флуоресцентный микроскоп Nikon Corp., Токио, Япония). Изображения были оцифрованы Photoshop 8.0. Десять мощных полей (ч 100) от 3-4 слайдов, каждый из 6-8 опухоли в группе лечения были просмотрены наличие флуоресцентно меченых клеток: красный (расщепляется каспазы-3), зеленый (CD4 или CD8 в 2 раздельные наборы слайдов) или двойной выражая желтый. Количество положительных клеток были подсчитаны и означает номер ячейки ± стандартная ошибка средней сообщается. Индивидуальный подсчет клеток был ослеплен лечения, группы разделов, из которых были приняты.

НК цитолитической активности

Во время жертвоприношения, спленоциты были выделены и оценены для цитолитической активности NK-лимфоцитов против КДМ-1 опухолевых клеток с помощью стандартного потока cytometric анализа. КДМ-1 меченых клеток с 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine [DiOC₁₈(³)], приобретенного от Sigma культивировали с спленоциты в течение 4 ч в трех экземплярах на эффекторные на клетки-мишени (E:T) соотношения 50:1, 25:1, 12.5:1-6,25:1. Через 4 ч, окрашивали пропидия (PI) и мыть до потока cytometric анализа. Мертвые клетки-мишени были обнаружены как DiOC⁺PI⁺ клеток. NK-лимфоцитов деятельность, определяемая как процент специфической цитотоксичности, была рассчитана на каждом E:T соотношение с помощью следующей формулы: (% DiOC⁺, ИП⁺ ячейки) _{Спленоциты+КДМ-1} - (% DiOC⁺, ИП⁺ ячейки) _{КДМ-1 в одиночку} для каждой репликации образца. Данные были проанализированы существенные различия с помощью линейной смешанной модели, анализировать данные из 17 мышей.

Статистический анализ

Непрерывные переменные, если не указано иное, были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента. Курение на всей территории непрерывных переменных (опухоли, вес) были проанализированы с использованием Mann-Whitney U-тест. Статистическая значимость была установлена на уровне p = < 0.05.

Результаты

PSK повышает доцетаксел-индуцированной подавления опухоли и апоптоз опухолевых клеток

Чтобы определить, если PSK повышает подавления опухоли, индуцированных доцетаксел, групп мышей (n=10) подшипника, установленных БРОДЯГА-C2 опухоли были обработаны с физраствором управления; субтерапевтических дозах доцетаксел (5 мг/кг в / б. два раза в неделю); PSK (300 мг/кг перорально по калийную один раз в день) или сочетание доцетаксел плюс PSK (следуя той же дозировки в качестве одного агента процедуры). В субтерапевтических дозу доцетаксела была использована, чтобы разрешить наблюдение за усиление влияния на комбинированное лечение, в соответствии с предыдущими исследованиями, что показало прямое противоопухолевое действие добавления внутрибрюшинно вводят PSK, чтобы доцетаксел лечение в мышь модели рака желудка (²⁶,²⁷). В дозах до 1000 мг/кг PSK были использованы в других исследованиях, не сообщили о токсичности (²⁹). Сочетание доцетаксел плюс PSK результате значительно меньшие опухоли, относительно засоленных управления, доцетаксел PSK или в одиночку (Рис. 1) (p<0,05), хотя PSK-лечение опухолей, не сильно отличается по сравнению с контрольной.

В целях оценки возможных механизмов, с помощью которых PSK усиливает эффект доцетаксел индуцированных регрессию опухоли, опухоли от мышей окрашивали для Ki67 (распространение) и аннексина V (апоптоз). Сочетая PSK с доцетаксел привело к сокращению Ki67 позитивных клеток по сравнению с доцетаксел в одиночку (p<0.05), так и индуцированной 3-кратное увеличение количества апоптотических, TUNEL-позитивных клеток по сравнению с терапией с PSK (p<0.01), и в 1,5 раза увеличить по сравнению с доцетаксел в одиночку (p<0,05) (Рис. 2).

Комбинированный препарат, и PSK лечения не вызывает побочных эффектов

Учитывая апоптоз-индуцированные эффекты, которые мы наблюдали, мы исследовали вес, печеночной и почечной функции у мышей, получавших PSK или доцетаксел монотерапии или в комбинации. Нет значительных различий в функции печени и почек наблюдались между группами лечения (Таблица I). Интересно, что вес был фактически эксплуатируемые с добавлением PSK к доцетаксел режим по сравнению с контрольную или доцетаксел групп (Рис. 3), что защитный эффект комбинированного лечения от опухоли вызванных потерей веса. Таким образом, без существенных токсичности наблюдалось с PSK и доцетаксел комбинированной терапии. Далее мы попросили том, что данная комбинированная терапия может развеять наблюдается иммуносупрессивный эффект доцетаксел.

PSK снижает доцетаксел-иммунного подавления

Для определения влияния PSK доцетаксел-индуцированной иммуносупрессии, WBC графов были определены. Доцетаксел только вызывает снижение на 25% в WBC, и добавлением PSK снизилось в этом подавляющий эффект примерно на 50%. Разница в WBC уровень, наблюдавшийся в ответ на PSK + доцетаксел лечения, по сравнению с доцетаксел в одиночку было статистически значимым (p=0.03) (Рис. 4). Является ли этот эффект защитной (химиотерапия подавляет-индуцированной лимфатической подавление) или восстановительная (увеличивает WBC уровнях после терапии), еще предстоит определить.

Сочетая PSK с доцетаксел повышает опухолевой инфильтрацией лимфоцитов (TIL) чисел

С PSK усиленной противоопухолевой ответы в Her2/neu рака молочной железы мыши модель (¹⁷), мы исследовали, является ли сочетание PSK с доцетаксел может усилить меры противоопухолевого иммунитета в БРОДЯГУ-модели C2. Сначала мы спросили, является ли число TILs изменилась в ответ на индивидуальные и комбинированные методы лечения. Опухоль разделы окрашивали для выражения опухолевой инфильтрацией CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. PSK и доцетаксел процедуры в одиночку приводит к увеличению числа TILs, чем в контрольных мышей, и кроме PSK, чтобы доцетаксел увеличилась как опухолевой инфильтрацией CD4⁺ Т-клеток по сравнению с PSK или доцетаксел в одиночку (p<0.05) и CD8⁺ T сотовых номеров по сравнению с доцетаксел в одиночку (p<0,05) (Рис. 5), предполагающее усиление эффекта комбинированного лечения опухолевой инфильтрацией Т-клеток.

Последствия PSK и доцетаксел процедуры по экспрессии мРНК цитокинов и цитолитической генов и FoxP3

Учитывая наблюдение PSK и доцетаксел-индуцированной TIL повышение, мы в дальнейшем анализироваться ли какие-то изменения в гамма-интерферона, IL-2, TNF-a, TGF-b, perforin, granzyme B и FoxP3 экспрессии мРНК в опухоли микро-среды можно было наблюдать в ответ на лечение. БРОДЯГА-C2 опухоли простаты от 4 лечения различных групп мышей были оценены с использованием от-ПЦР на наличие мРНК цитокинов и других противоопухолевый иммунный ответ организма маркеров, а также для Т-регуляторных клеток маркер, FoxP3. Доцетаксел только лечение не привело, гамма-интерферона. Значительные индукции интерферона-гамма (IFN-G) экспрессия мРНК в БРОДЯГУ-C2 опухоли произошло у мышей, получавших PSK, как в одиночку (p=0,04) или с доцетаксел (p=0,01) по сравнению с солеными управления (Рис. 6A). Никаких существенных различий между группами наблюдались в других маркеров осмотрел. Тем не менее, означает, IL-2 экспрессии мРНК в ответ на сочетании PSK и доцетаксел лечения была выше, чем доцетаксел лечения в одиночку (Рис. 6Б). Средние уровни фактора некроза опухоли-Альфа (TNF-a) мРНК в ответ на доцетаксел или PSK лечения в одиночку или в сочетании отклонялись в сторону увеличения по сравнению с контролем (p=0,09) (Рис. 6C). Нет значительных различий в perforin, granzyme B, TGF-b или FoxP3 экспрессии мРНК наблюдались между группами лечения (данные не показаны).

PSK и доцетаксел процедуры не затрагивают иммунных клеток селезенки населения в процентах или апоптоз Т-клеток селезенки

С PSK усиленной доцетаксел-индуцированного апоптоза опухолевых клеток, далее мы исследовали ли этот эффект был характерен для опухолевых клеток или если PSK лечения также модулирует индукции апоптоза иммунных клеток селезенки подмножества. Иммунофенотипирование была использована для анализа распределения лимфоцитов селезенки подгрупп населения, в одиночку и с аннексина V, маркеров апоптоза. Нет значительных различий в распределении Т-клеток селезенки, NK-клеток, в-клеток или дендритных клеток (ДК) между группами лечения не наблюдалось (данные не показаны). Далее уровни апоптотических клеток среди селезенки группах существенно не различались в ответ на процедуры по сравнению с контролем. Таким образом, PSK и доцетаксел процедуры в одиночку или в сочетании, как представляется, не индуцировать апоптоз клеток селезенки.

Мы попытались использовать аналогичный подход для оценки эффекта PSK и доцетаксел процедуры на апоптоз опухолевых проникают в T-клетки. Мы были не в состоянии отделить образцов опухолей достаточно для создания отдельных клеточных суспензий, необходимых для проточной цитометрии. В качестве альтернативной стратегии, 8 замороженных опухоли разделы от мышей в каждой группе лечения были обработаны для двойной иммуногистохимии, пятная для каспаза-3 апоптоза маркер CD4 или CD8 Т-клеток, маркеры. Сравнительно мало апоптоза среди CD4 или CD8 клеток наблюдалось, независимо от вида лечения (данные не показаны).

PSK в сочетании с доцетаксел повышает селезенки цитолитической активности NK-лимфоцитов

Селезенки были собраны и сохранены от дополнительных мышей из каждой группы по лечению оценить влияние PSK в одиночку, так и в сочетании с доцетаксел на активности NK-лимфоцитов против КДМ-1 опухолевые клетки-мишени. PSK и доцетаксел комбинированной терапии была наибольшие NK-лимфоцитов-индуцирующим действием (Рис. 7). Селезеночной активности NK-лимфоцитов у мышей, получавших комбинацию PSK и доцетаксел была значительно выше, чем у контрольной группы мышей на 50:1 E:T соотношение (р=0,045).

Обсуждение

БРОДЯГА C2 опухоли-подшипник мыши модель часто используется в качестве модели для разработки новых предстательной железы цитостатической и иммунотерапии подходов (³⁰-³³). В этом исследовании мы использовали эту модель для оценки модуляторные эффекты комбинированной терапии с PSK и доцетаксел лечения. Наши результаты показывают, что добавление PSK, чтобы доцетаксел имеет несколько полезных эффектов. Помимо PSK к стандартной химиотерапии (доцетаксел) enhanced регрессию опухоли, рак простаты апоптоза и пролиферации по сравнению с доцетаксел в одиночку. Сочетание PSK и доцетаксел также иммунозащитные, в том животных, получавших комбинацию оставалось все меньше уменьшение WBC по сравнению с теми, получавших препарат в одиночку. Это сопровождалось увеличением числа CD4 -⁺ и CD8⁺ Т-клеток в опухоли. PSK лечения в одиночку или с доцетаксел значительно расширенная гамма-интерферона экспрессии мРНК в опухоли по сравнению с почти полным отсутствием в опухоли из-под контроля и доцетаксел групп. PSK в сочетании с доцетаксел также расширение селезенки цитолитической активности NK-лимфоцитов против опухолевых клеток-мишеней.

Эти результаты согласуются с опубликованными исследования, показывающие емкость PSK для усиления экспрессии генов цитокинов (³⁴) и побудить TLR2-зависимой активации пути вождения противоопухолевого иммунного ответа (¹⁷). PSP, похожие proteopolysaccharide экстракт изолированы от Т. лишай как сообщалось, вызывать гамма-интерферона производства и увеличить NK-лимфоцитов tumoricidal активность в экспериментах на животных моделей рака (³⁵). Гамма-интерферона повышение, полисахарид, содержащих экстракты из Ganoderma lucidum (Рейши) и Grifola frondosa (Маитаке) видов грибов также сообщалось (³⁶-³⁸). В этом исследовании показано, что при назначении в сочетании с традиционной фронтовой доцетаксел терапии, администрация PSK был связан с меньшего размера опухоли, более аденокарциномы апоптоза и большее количество TILs. В совокупности, эти результаты подтверждают клинические испытания сочетание PSK с taxol терапии, такие как docetaxol.

Исследования, проведенные в других моделей рака сообщили PSK-усиление влияния доцетаксел-индуцированного апоптоза опухолевых клеток (²⁶,²⁷). Эти исследования индукции апоптоза механизмы предполагают, что это апоптоз-усиление эффекта может быть результатом PSK ингибирования NFκB-индуцированной экспрессии survivin, что приводит к повышению уровня доцетаксел-индуцированной каспазы-3 активации в опухолевых клетках (²⁵,²⁶). Эти исследования не оценить последствия PSK дополнение к доцетаксел на индукции апоптоза в клетках иммунной системы, так ли такие эффекты : опухоль-специфичные неизвестно. В этом исследовании, мы были не в состоянии обнаружить существенные изменения в иммунных клеток селезенки подгруппе населения, в процентах от общего мононуклеарных клеток (данные не показаны). Таким образом, мы заключаем, что эта комбинация, как представляется, не влияет на нормальные лимфоциты. Кроме того, T апоптоза клеток в опухоли образцы была низкой из всех терапевтических группах. Таким образом, способность PSK для защиты от апоптоз опухолевых инфильтрацией лимфоцитами было непонятно. Доцетаксел сообщалось индуцировать апоптоз митоген-активированный человека мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) ex vivo не затрагивая продукции цитокинов Th1 (³⁹). Дальнейшее изучение этого вопроса более подробно необходимы, чтобы определить апоптоз-индуцированные эффекты в сочетании PSK и доцетаксел лечения опухоль-специфичные.

Иммуномодулирующий эффекты доцетаксел также не поступало. Доцетаксел, как известно, вызывают миелосупрессии и снизить WBC засчитывается в зависимости от дозы, способа (⁷,⁸,⁴⁰) и данные этого исследования свидетельствуют о том, что PSK могут смягчить эти последствия, в то время как повышение противоопухолевого ответы. Что касается непосредственной иммунологические эффекты, доцетаксел лечения у мышей, несущих сингенных перевиваемых опухолей, индуцированных значительное увеличение Т-лимфоцитов и NK-клеток, при проникновении в опухолей (⁴¹). В этом исследовании, доцетаксел индуцированное увеличение, как CD4⁺ и CD8⁺ TILs более засоленных лечения, эффект, который был расширен за счет добавления PSK. Markasz et al сообщила, что препарат в терапевтических концентрациях эффективно подавлял НК клеточный убийство без влияющих на жизнеспособность клеток NK (⁴²). Мы не наблюдали ингибирование литической активности NK-лимфоцитов против опухолевых клеток в ответ на доцетаксел только в лечении, в БРОДЯГУ-C2 опухоли модели. Однако способность PSK для повышения активности NK-лимфоцитов, повышает возможность того, что администрация PSK могут возразить, доцетаксел-индуцированной NK-лимфоцитов торможения.

Доза PSK (300 мг/кг), используемый в сочетании с доцетаксел в этих мышиных экспериментов несколько выше, чем были использованы в клинических испытаниях (около 75 мг/кг) (⁴³-⁴⁵). На этих более высоких дозах, мы не наблюдали никаких побочных эффектов повседневной устной администрация PSK. Другие исследователи протестировали орального применения-до 1000 мг/кг PSK в мышиных рака легких модели и обнаружили меньше, связанных с лечением, смертей в PSK-лечение животных (²⁹). Кроме того, более высокие дозы Trametes versicolor препаратов (до 9 граммов в день) были хорошо переносится в суд человеческий больных раком молочной железы (Стэндиш, неопубликованные данные). В совокупности результаты этого исследования в БРОДЯГУ-C2 мышиная модель человеческого рака предстательной железы свидетельствуют, что сочетание режима PSK и доцетаксел требует дальнейшего изучения в людях, чтобы определить, если эта комбинированная терапия является клинический эффект при лечении поздних стадиях рака простаты. Фазы Ib повышение дозы препарата клинические испытания для определения максимальной переносимой дозы PSK в сочетании с доцетаксел, идет полным ходом.

Выражение признательности

Авторы хотели бы выразить признательность Kureha Corp. за предоставление PSK и финансирования этого исследования, и д-р маса Sasagawa и Лорен Procopio за помощь в подготовке рукописи. Это исследование также было поддержано Национальный Центр дополнительной и Альтернативной Медицины (NCCAM) Национальных Институтов Здравоохранения грантов U19-AT019980 и U19-AT006028.

Аббревиатуры

ALT	аланин-трансаминазы
АСТ	аспартат-амино-трансферазы
БУЛОЧКА	азот мочевины крови
КДНК	взаимодополняющие дезоксирибонуклеиновая кислота
Cr	креатинин
CRPC	кастрация-упорный рака предстательной железы
Гамма-интерферона	интерферон-гамма
IgG	иммуноглобулин G
ИЛ-2	интерлейкин-2
И.П.	внутрибрюшинного
мРНК	посланник рибонуклеиновая кислота
НК	natural killer
МКПК	мононуклеарных клеток периферической крови
ПЦР	цепная реакция полимеризации
PSK	полисахарид-K
TGF-b	трансформирующего фактора роста-бета
СЕЗАМ	опухолевой инфильтрацией лимфоцитами
TLR	Толл-подобный рецептор
TNF-a	фактор некроза опухоли Альфа
БРОДЯГА	трансгенные аденокарцинома предстательной железы мыши
WBC	белые клетки крови

Ссылки

1.	Ferlay J,син HR,Bray F,Форман D,Mathers C,Паркин DM. Оценки заболеваемости раком во всем мире в 2008 году: GLOBOCAN 2008Int J Cancer12728932917Год: 201021351269
2.	Ласси K,Доусон НС. Обновление на кастрировать-упорный предстательной железы: 2010Curr ОПИН Oncol22263267Год: 201020177381
3.	Petrylak DP,танген СМ,Хуссейн MH,et al. Доцетаксел и estramustine по сравнению с митоксантрон и преднизон для продвинутых огнеупорных предстательной cancerN Engl J Med35115131520Год: 200415470214
4.	Теннок,ЕСЛИ Де Вит R,Берри WR,et al. Доцетаксел плюс преднизон или митоксантрон плюс преднизон для продвинутых предстательной cancerN Engl J Med35115021512Год: 200415470213
5.	Gueritte-Voegelein F,Guenard D,Лавель F,ле Гофф MT,Mangatal Л,П. Потье Связей между структурой taxol аналогов и их антимитотическую activityJ Med Chem34992998Год: 19911672159
6.	Bissery MC,Guenard D,Gueritte-Voegelein F,Лавель Ф. Экспериментальных противоопухолевой активностью Таксотер (RP 56976, НБК 628503), taxol analogueCancer Res5148454852Год: 19911680023
7.	Майк S,Харрисон C,Coles B,Staffurth J,Будешь TJ,Мейсон MD. Химиотерапии для гормон-огнеупорные предстательной cancerCochrane Базы данных Syst ред.Год: CD005247Год: 2006
8.	Quartino AL,Фриберг LE,Карлссон MO. Синхронный анализ времени-курс лейкоцитов и нейтрофилов ниже доцетаксел администрирования с использованием полу-механистической миелосупрессии modelInvest Новых лекарственных ПрепаратовМесяц: 12 День: 14 Год: 2010 г. (E-pub ahead of print).
9.	Kantoff PW,Higano CS,до Берега ND,et al. Sipuleucel-T иммунотерапии для кастрации-упорный предстательной cancerN Engl J Med363411422Год: 201020818862
10.	МФД предлагает D,Tiserova Ч,Fucikova J,et al. ФОКУС на от выбора черты бедности: комбинированная химио-и иммунотерапии для лечения гормоном-огнеупорные метастатическим раком предстательной cancerClin Immunol131110Год: 200919201656
11.	Фонг L,Kwek СС,О'Брайен S et al. Потенцирующее эндогенных противоопухолевый иммунитет к раку простаты с помощью комбинированной иммунотерапии с CTLA4 " блокада " и " GM-CSFCancer Res69609615Год: 200919147575
12.	Ходи FS,O ' SJ", " Макдермотт " DF,et al. Повышение выживаемости с ipilimumab у пациентов с метастатическим melanomaN Engl J Med363711723Год: 201020525992
13.	Небольшой EJ,Tchekmedyian NS,Рини BI,Fong L,Лоуи я,Элисон JP. Пилотное испытание стга-4 блокаду человеческие анти-стга-4 у больных с гормонально-огнеупорные предстательной cancerClin Рака Res1318101815Год: 200717363537
14.	Bristol-Myers SquibbPhase 3 Исследование Иммунотерапии для Лечения Расширенных Предстательной CancerClinicalTrialgov [Интернет]Бетесде (Мэриленд)National Library of Medicine (США)Год: 2000. [цит. 20110824]. Доступно: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01057810. NCT01057810.
15.	Bristol-Myers SquibbStudy Иммунотерапии для Лечения Расширенных Предстательной CancerClinicalTrialsgov [Интернет]Бетесде (Мэриленд)National Library of Medicine (США)Год: 2000. [цит. 20110824]. Доступно: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00861614. NCT00861614.
16.	Кобаяси Ч,Мацунага (K), Огучи Ю. Антиметастатической эффекты PSK (Крестин), в белком полисахарид, полученный из basidiomycetes: overviewCancer контроль Биомаркеров Prev4275281Год: 19957606203
17.	Лу Ч,Ян Y,гад E,et al. Полисахарид Роман крестин TLR2 агонист, приводящий к торможению роста опухоли через стимулирование CD8 Т-и NK-клеток cellsClin Рака Res176776Год: 201121068144
18.	Микки DD,Bencuya PS,Foulkes к. влияние иммуномодулятора PSK на рост человеческого аденокарциномы предстательной железы при иммунодефицитных miceInt J Immunopharmacol11829838Год: 19892599718
19.	Хаякава K,Mitsuhashi N,Сайто Y,et al. Эффект Крестин в качестве адъювантного лечения следуя радикальной лучевой терапии в немелкоклеточного рака легких patientsCancer Обнаружить Prev217177Год: 19979043766
20.	Хаякава K,Mitsuhashi N,Сайто Y,et al. Эффект крестин (PSK) в качестве адъювантного лечения на прогноз после радикальной лучевой терапии у пациентов с немелкоклеточным cancerAnticancer Res1318151820Год: 19938267386
21.	Iino Y,Yokoe T,Maemura M,et al. Immunochemotherapies сравнению с химиотерапией в качестве адъювантной терапии после лечебной резекции исправных груди cancerAnticancer Res1529072911Год: 19958669887
22.	Оба K,Teramukai S,Кобаяси М,Мацуи (T,Кодера Y,Сакамото J. Эффективность адъювантной immunochemotherapy полисахарид с K для пациентов с лечебной резекции желудка cancerCancer Immunol Immunother56905911Год: 200717106715
23.	Nakazato Ч,Коикэ,Саджи Ы,Н Огава,Сакамото J. Эффективность immunochemotherapy в качестве адъювантной терапии после лечебной резекции рака желудка. Исследовательская Группа Immunochemotherapy с PSK для Желудка CancerLancet34311221126Год: 19947910230
24.	Сакамото J,Морита S,оба K,et al. Эффективность адъювантной immunochemotherapy полисахарид с K для пациентов с низкими дозами резекции рака прямой кишки: мета-анализ централизованно рандомизированных контролируемых клинических trialsCancer Immunol Immunother55404411Год: 200616133112
25.	Чжан Ч,Морисаки T,Nakahara C et al. PSK-опосредованной NF-kappaB торможение увеличивает доцетаксел-индуцированного апоптоза в человеческих клеток поджелудочной железы, НИ-P1Oncogene2220882096Год: 200312687011
26.	Киношита J,Fushida S,Харада S et al. PSK повышает эффективность доцетаксел в желудка человека, раковые клетки за счет ингибирования ядерный фактор-kappaB активации и survivin expressionInt J Oncol36593600Год: 201020126979
27.	Ямасаки,Shoda М,лиджима H,et al. Белок-связанными полисахарид, PSK, повышает подавления опухоли, индуцированных доцетаксел в раке желудка ксенотрансплантат modelAnticancer Res29843850Год: 200919414318
28.	Vremec D,Shortman к. Дендритных клеток подтипы мыши в лимфоидных органах: кросс-корреляции поверхностных маркеров изменения с инкубации, и различия между тимуса, селезенки и лимфатических nodesJ Immunol159565573Год: 19979218570
29.	Katoh R,Takenoshita S,Shimizu Y,Танака S,Yajima Y,Нагамачи Ю Воздействие на хост-модифицированных PVP терапии в сочетании с биологическими модификаторы реакции в легких cancerOncol Rep5103107Год: 19989458302
30.	Каштелу-Бранку P,Прохожий BJ,Buhrman JS,et al. Для онколитических herpes simplex virus вооруженные xenogeneic гомолога простатическая кислая фосфатаза повышает противоопухолевую эффективность в предстательной cancerGene Ther17805810Год: 201020220784
31.	Dzojic Ч,Loskog,Totterman Й,Essand м. Аденовирус-опосредованной CD40 лиганда терапии индуцирует апоптоз опухолевых клеток и системного иммунитета в БРОДЯГУ-C2 мыши предстательной железы modelProstate66831838Год: 200616491482
32.	Редди КР,Гуань Y,Цинь G,Чжоу Z,Цзин н. Комбинированного лечения таргетинга HIF-1альфа и Stat3 является мощным стратегии лечения рака предстательной железы, therapyProstate7117961809Год: 201121480310
33.	Yi Ч,Ю, Х,Гуо C,Manjili MH,Repasky EA,Ван Ху. Приемные клеточной терапии рака предстательной железы с помощью самок мышей-производные Т-клетки, которые вступают в реакцию с предстательной antigensCancer Immunol Immunother60349360Год: 201121088965
34.	Като М,Хиросэ K,Hakozaki M,et al. Индукция экспрессии генов для иммуномодулирующее цитокинов в мононуклеарах периферической крови в ответ на перорально (PSK, иммуномодулирующий белком polysaccharideCancer Immunol Immunother40152156Год: 19957728773
35.	Нг ТБ. Обзор исследований по белком полисахарид (polysaccharopeptide, PSP) из гриба Coriolus лишай (Basidiomycetes: Polyporaceae)Gen Pharmacol3014Год: 19989457474
36.	Кодама N,Mizuno S,Nanba Ч,н Сайто Потенциальной противоопухолевой активности низкомолекулярных белковых фракций из Grifola frondosa через повышение цитокинового productionJ Med Food132030Год: 201020136432
37.	Масуда Y,иноуе М,Miyata,Mizuno S,Nanba H. майтаке бета-глюкан усиливает терапевтический эффект и снижает myelosupression и нефротоксичность цисплатин в miceInt Immunopharmacol9620626Год: 200919249389
38.	Рубель R,Далла Санта-HS,Bonatto С.Я., et al. Лекарственного гриба Ganoderma lucidum (Leyss: Fr) Karst. триггеры иммуномодулирующее действие и уменьшает синтеза оксида азота в miceJ Med Food13142148Год: 201020136448
39.	Si-MS,Imagawa DK,Ji P,et al. Иммуномодулирующий эффекты доцетаксел по правам lymphocytesInvest Новых Drugs21281290Год: 200314578678
40.	Suzuki Y,Токуда Ю. DocetaxelGan к Kagaku Ryoho2813631367Год: 200111681243
41.	Мейсон K,Стааб,Охотник N,et al. Повышение опухоли radioresponse по доцетаксел: участие иммунной systemInt J Oncol18599606Год: 200111179493
42.	Markasz L,Skribek Ч,Uhlin M,et al. Эффект часто используется химиотерапевтических препаратов на цитотоксическую активность человека цитотоксических Т-lymphocytesJ Immunother31283293Год: 200818317359
43.	Огден CL,Fryar CD,Кэрролл MD,Flegal КМ. Значит, масса тела, рост, индекс массы тела, Соединенные Штаты 1960-2002Adv Data117Год: 200415544194
44.	Хироно М,Yoshinaka K,Мацуки K,et al. Хирургическое лечение Borrmann тип 4 (диффузных) желудка cancerGan Не Rinsho30717723Год: 19846431142
45.	Кидд PM. Использование грибов глюканов и протеогликанов в рак treatmentAltern Med Rev5427Год: 200010696116