Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств 14. 04. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

Жданова Алина Валитовна

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Самара – 2011

доктор биологических наук,

профессор Аввакумова Надежда Петровна
Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Первушкин Сергей Васильевич
доктор химических наук,

профессор Халилов Леонард Мухибович

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «____»____________ 2011 г.

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Живой организм, как открытая термодинамическая система, активно реагирует на негативные изменения биосферы, и вместе с тем, характеризуется высоким постоянством состава внутренней среды. Поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза, как неотъемлемого свойства живых организмов, обеспечивается комплексом взаимосвязанных биохимических процессов. Нарушение функций редокс-систем тканей и органов является важным звеном патогенеза ряда заболеваний, к которым относятся сахарный диабет, гепатиты различной этиологии [Мехтиев С.Н., 2008], патологии сердечно-сосудистой системы [Барсель В.А., 1998; Решетова Г.Г., 2004; Tang M., 1996], множество онкологических [Бурлакова Е.Б., 1979, Fukushima M, 2001] и аутоиммунных заболеваний, в том числе, ревматоидный полиартрит, склеродермия и другие [Маянский Д.Н., 1991; Меньщикова Е.Б., 2008]. Сказанное обуславливает активный поиск средств лечения окислительно-восстановительных нарушений и коррекции свободнорадикального статуса организма. С этой целью широко используются синтетические антиоксидантные препараты, такие как ионол [Репин В.С, 1998], пробукол (фенбутол) [Оковитый С.В., 2005; Burkitt M.J., 1996], диметилсульфоксид, мексидол [Воронина, 2000] и другие, применение которых ограничено рядом противопоказаний. Причинно-следственные отношения между терапевтическим эффектом и побочными действиями синтетических препаратов остаются недостаточно изученными. Иногда токсическое действие лекарственных средств на организм становится источником серьезных патологий. Вместе с тем, далеко не полностью исчерпаны возможности по разработке и внедрению в фармацевтическую практику терапевтических препаратов на основе природных соединений. Приоритетной задачей фармации в настоящее время является создание инновационных лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов.

Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений. Гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия, что подтверждается экспериментальными исследованиями последних лет. Специфические органические вещества обладают адаптогенным [Бузлама А. В., 2010], антитоксическим [Агапов А. И., Аввакумова Н.П., 1999], противомикробным [Жернов Ю.В., 2010], диуретическим [Дубищев А.В., 2010], противовоспалительным [Агапов А.И. 1999; Аввакумова Н.П., 2002; Катунина Е.Е., 2007] действием, а также являются универсальной матрицей, позволяющей ввести в организм человека необходимые микроэлементы в активной форме [Аввакумова Н.П., 2002; Кривопалова М.А., 2010].

Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии гуминовых веществ пелоидов на окислительно-восстановительные процессы обуславливает актуальность и новизну проведенного исследования.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. 
   Выделить и идентифицировать по общепринятым критериям гуминовые вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты.
   
2. 
   Исследовать структурные компоненты гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей физико-химическими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
   
3. 
   Разработать методы количественного анализа гумусовых кислот и их компонентов: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот.
   
4. 
   Охарактеризовать в сравнительном аспекте про- и антиоксидантные свойства отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях «in vitro».
   
5. 
   Оценить биодоступность отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.
   
6. 
   Изучить антиоксидантную активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов по основным гематологическим характеристикам в условиях «in vivo».
   

Впервые уточнена и детализирована природа парамагнитных центров в молекулах гуминовых веществ пелоидов, свидетельствующая об их высокой реакционной способности. Установлены соотношения электронодонорных и электроноакцепторных свойств гуминовых веществ пелоидов.

Получены новые данные о влиянии гуминовых веществ пелоидов на динамику окислительного стресса в эксперименте. Выявлена антиоксидантная активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов, раскрывающая перспективность их использования в фармацевтической практике.

Впервые предложен способ количественного определения гуминовых веществ пелоидов методом амперометрии, который может быть использован для стандартизации лекарственных субстанций.

Совокупность сведений о составе, структурной организации, а также количественные характеристики антиоксидантной активности и биодоступности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей являются необходимой базой для создания стандартизированных субстанций и лекарственных препаратов с целью дальнейшего использования в медицинской и фармацевтической практике.

Внедрение результатов работы позволит создать новый для России класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой.

Преимуществами применения пелоидопрепаратов, по сравнению с нативным грязелечением, является уменьшение противопоказаний и возможность использования лечебного фактора вне курортных зон.

По результатам исследований оформлено рационализаторское предложение:

- удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра».

• 
  В учебный процесс на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011);
  

• 
  В учебный процесс на кафедре химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011).
  

1. 
   Принадлежность субстанций выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей к классу гуминовых веществ, а именно: фульвовым, гиматомелановым и гуминовым кислотам, по общепринятым идентификационным признакам: элементному составу, ИК-спектроскопии, коэффициенту цветности.
   
2. 
   Генетическое сходство представителей веществ гуминового ряда по совокупности результатов, полученных физико-химическими методами анализа: инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса.
   
3. 
   Антиоксидантная активность в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro по результатам амперометрического, манометрического и хемилюминесцентного методов.
   
4. 
   Результаты определения биологической доступности отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.
   
5. 
   Методика количественного анализа фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов как основа для стандартизации лекарственных субстанций.
   
6. 
   Сравнительный анализ антиоксидантной активности в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях in vivo.
   

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований в области гуминовых веществ, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению состава, свойств и применения специфических органических соединений.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики элементного, фотоколориметрического, спектроскопического, хемилюминесцентного, мано- и амперометрического, биохимического и гистологического изучения гуминовых веществ пелоидов.

В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований элементного состава, компонентов молекулярной структуры, антиоксидантной активности в условиях «in vivo» и «in vitro» фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов. Полученные результаты обработаны статистически и представлены в виде таблиц, формул и рисунков, приведенных в тексте диссертации.

В заключении проведен сравнительный анализ полученных данных, установлены особенности молекулярной структуры и закономерности изменения антиоксидантных свойств в генетическом ряду гуминовых веществ пелоидов.

Объектом нашего исследования явились гуминовые вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» ФМБА России, Самарская область.

Фракции фульвовых (ФК), гиматомелановых (ГМК), гуминовых (ГК) и гумусовых кислот (ГсК) были получены из пелоидов по авторским методикам, разработанным на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России» (патенты РФ № 2043107 от 20.07.1992; № 2122414 от 27.11.98).
Идентификация и изучение структурных компонентов гуминовых веществ пелоидов. Идентификацию гуминовых веществ осуществляли по общепринятым критериям: элементному составу, коэффициентам цветности: Е₄/Е₆, характеристическим полосам поглощения ИК– спектров. Полученные результаты сравнивали с литературными данными.

Определение элементного состава гуминовых веществ, а именно, содержание углерода, водорода, азота, серы и кислорода проводили на анализаторе фирмы «Carlo Erba EA-1108» при температуре 1010⁰С в постоянном потоке гелия. Согласно результатам элементного анализа содержание углерода находится в интервале 28,6-59,5% (масс.), водорода 3,7-6,2 % (масс.), кислорода 31,3–58,9% (масс.).

Таблица 1

Элементный состав (в пересчете на беззольное вещество), степень окисленности, бензоидности и коэффициенты цветности гуминовых веществ пелоидов

Определяемый показатель		ФК	ГМК	ГК	ГсК
Углерод	Масс.	28,580,17	59,490,19	55,181,70	55,780,01
	Мольн	19,010,15	40,210,17	42,890,20	41,600,74
Водород	Масс.	6,180,19	5,220,12	3,560,36	4,011,30
	Мольн	49,341,60	42,330,05	33,210,24	35,881,42
Азот	Масс.	2,101,84	1,831,69	5,160,79	4,160,91
	Мольн	1,210,67	1,060,54	3,440,14	2,660,58
Кислород	Масс.	58,900,61	31,260,14	34,100,16	34,970,14
	Мольн	29,380,14	15,840,05	19,880,05	19,560,07
Сера	Масс.	4,241,47	2,20,17	2,000,01	1,080,32
	Мольн	1,060,16	0,560,05	0,580,25	0,300,46
Н/С		2,59	1,05	0,77	0,86
О/С		1,55	0,39	0,46	0,47
Степень окисленности		+0,50	-0,26	+0,15	+0,08
Степень бензоидности		6,87	20,01	32,69	26,97
Коэффициент цветности		7,50	5,30	2,70	2,60

Содержание азота колеблется в диапазоне 1,8-5,6% (масс.), серы 1,08 –4,2% (масс.). Полученные результаты соответствуют критериям элементного состава гуминовых веществ, принятым международным гуминовым обществом (IHSS).

На основании результатов элементного анализа были рассчитаны величины степени бензоидности и окисленности, а также атомные соотношения Н/С и О/С (табл.1). Максимальная степень бензоидности характерна для гуминовых и минимальна для фульвовых кислот. Это коррелирует со значениями коэффициентов цветности (табл.1), значения которых обратно пропорциональны степени ароматизации фракций. Величина Н/С, указывающая на соотношение ароматических и алифатических компонентов, свидетельствует о том, что в фульвовых кислотах превалируют алифатические, а в гуминовых кислотах – ароматические составляющие.

Степень окисленности, показывающая относительное соотношение кислорода, водорода и углерода, указывает (табл.1) на ярко выраженный окисленный характер фульвокислот и достигает значения +0,50. Группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительных свойств (степень окисленности равна -0,26). Для гуминовых кислот характерно значение степени окисленности близкое к нулю, что свидетельствует об их высокой окислительно-восстановительной буферности.

Качественное сравнение относительной интенсивности полос ИК – спектров, снятых спектрометре Spectrum 100 (Perkin Elmer) в диапазоне 400-4200 см^-1, позволяет утверждать, что в фульвовых кислотах преобладают алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп, а гуминовые кислоты содержат сопряженные ароматические структуры со значительным содержанием карбоксильных групп (рис.1).


а)

б)

в)

Гиматомелановые кислоты, по сравнению с гуминовыми и фульвовыми, по результатам ИК-спектроскопического исследования можно отнести к наиболее ненасыщенной фракции, содержащей значительное количество непредельных фрагментов алифатического и ароматического характера. Анализ относительной интенсивности полос позволяет предположить превалирование кислотных свойств в фульвовых и гиматомелановых кислотах по сравнению с гуминовыми и гумусовыми кислотами. Гуминовые вещества пелоидов характеризуются присутствием в молекулярной структуре ароматического углеродного скелета с различными функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные, метоксильные и алкильные. Помимо ароматической части, в гуминовых веществах присутствуют алифатические фрагменты различной степени выраженности, обогащенные полисахаридными группам.

Спектры ЯМР ¹Н и ЯМР ¹³С регистрировали на спектрометре Bruker Avance-400 (400,13 мГц и 100,62 мГц ) в растворе D₂O с числом накоплений N=128 и 30000 соответственно, цифровое разрешение 0,2 Гц/т.

Таблица 2

Регистрация спектра ЯМР ¹Н в растворителе NaOD в D₂О позволяет провести дифференцированную оценку трех типов атомов водорода: карбоксильных групп (в области от 2,5 м.д. до 4,0 м.д.), ароматических (в области от 6,5 до 8,0 м.д.) и алифатических фрагментов (в области от 0,5 до 2,5м.д.).

Анализ спектров ЯМР ¹Н и ЯМР ¹³С (табл.2) показал, что в фульвовых кислотах преобладают разветвленные алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп. Молекулярная структура гуминовых кислот представляет собой ароматический каркас, в котором боковые алифатические заместители включают карбоксильные и спиртовые группы. Установлено, что гиматомелановые кислоты по своей молекулярной структуре имеют существенные отличия от структур других фракций, прежде всего, присутствием не менее четырех типов карбонильных атомов углерода различной природы: хиноидной, сложноэфирной, еноловой, кетонной. Указанная особенность молекулярного строения гиматомелановых кислот определяет наиболее выраженную степень сопряжения структурных фрагментов, и их можно, по-видимому, условно отнести к наиболее ненасыщенной фракции пелоидов.

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) в виде первой производной сигнала поглощения получали на спектрометре "Bruker EMX plus Х" (~9.75 ГГц). Спектры ЭПР исследуемых фракций имеют приблизительно одинаковый вид (рис.2). В спектрах идентифицируется одна интенсивная широкая линия с g=2,003 (табл.3), свидетельствующая о явном присутствии свободных радикалов в структуре гуминовых веществ. Концентрация парамагнитных центров рассчитывалась по известной концентрации спинов угольного пека, которая составляет 3,66·10¹⁵ спин/г.


б)


Рис. 2. ЭПР спектры а) фульвовых б) гиматомелановых

в) гуминовых кислот пелоидов

Анализ концентраций парамагнитных центров (табл.3) показывает, что минимальное число свободных радикалов содержат молекулы фульвовых кислот пелоидов. Концентрация парамагнитных центров в гиматомелановых кислотах повышается в 6 раз и достигает максимального значения в гуминовых кислотах, возрастая в 34 раза. Концентрация свободных радикалов в гумусовых кислотах принимает промежуточное значение равное 15·10¹⁶ спин/г.

Таблица 3

Значения g-фактора и концентрации парамагнитных центров

в гуминовых веществах пелоидов

Фракция	g-фактор	Полуширина синглетной линии, (ΔН,Гс)	Концентрация ПМЦ, (в спинах/г)* 1016
Фульвовые кислоты	2.00345	3,6	0,8
Гиматомелановые кислоты	2.00330	3,6	4,8
Гуминовые кислоты	2.00310	3,1	27
Гумусовые кислоты	2.00320	3,1	15

Концентрация парамагнитных центров возрастает в ряду фульвовых – гиматомелановых – гуминовых кислот и изменяется симбатно степени ароматичности фракций, рассчитанной на основании результатов элементного анализа.

Манометрическое определение антиоксидантной активности проводили на модельной реакции радикально-цепного инициированного окисления 1,4-диоксана в стандартных условиях при температуре 348 К и скорости инициирования V_i= 1·10^-7 моль/л•с в кинетическом режиме окисления [Денисов Е.Т, 1997]; в качестве инициатора окислительных процессов выбран азодиизобутиронитрил (АИБН) с использованием модифицированной установки типа Варбурга. Скорость окисления V₀ определяли по тангенсу угла наклона кинетической кривой поглощения кислорода (рис.3). Ингибированное окисление 1,4-диоксана проводили в присутствии ионола и фракций гуминовых веществ пелоидов. В этом случае скорость ингибирования V₀ определяли по начальному участку кинетической кривой.

Гуминовые кислоты обладают как антиоксидантными, так и прооксидантными свойствами в интервале концентраций от 1 до 30 г/л и от 30 до 70 г/л соответственно. Максимальная степень торможения окислительного процесса составляет 80,8%.

Гумусовые кислоты характеризуются схожими с гуминовыми кислотами антиоксидантными свойствами, но в меньшей степени замедляют процессы ингибированного окисления. Это связано, по-видимому, с более сложной, стохастической структурой, в которой функциональные группы находятся внутри глобулярной макромолекулы, что затрудняет их участие в общей цепи сопряжения.

Фульвовые кислоты обладают менее выраженными антиоксидантными свойствами, так как в их структуре преобладают карбоксильные и спиртовые группы, которые, по-видимому, менее активно взаимодействуют с радикалами и обрывая цепь окисления.

Зависимость параметра ингибирования F от концентрации фракций гуминовых веществ определяли в координатах уравнения:

,

где – начальная скорость поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в отсутствии ингибитора;

[AO] – концентрация добавки АО;

Между параметром ингибирования и концентрацией исследуемых кислот в интервале 0,25-30 г/л наблюдается линейная зависимость и, следовательно, предложенное уравнение удовлетворительно выполняется для всех изученных веществ (коэффициент корреляции > 0,95). Величина была определена по тангенсу угла наклона зависимости параметра ингибирования F от концентрации гуминовых веществ для каждого образца (рис.3). На основании полученных данных была рассчитана эфффективная константа скорости ингибирования, которая имеет наибольшее значение для гиматомелановых кислот и составляет 8,5 л/г·с. Гуминовые кислоты по эффективной константе скорости ингибирования окислительного процесса уступают гиматомелановым в 2,8, гумусовые кислоты - в 5,0 и фульвовые кислоты - в 6,5 раза, и составляют 3,0 л/г·с, 1,7 л/г·с, 1,3 л/г·с соответственно.

Таким образом, гиматомелановые кислоты характеризуются наибольшими значениями манометрических показателей, что указывает на их высокую антиоксидантную активность.

Для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в биологических объектах использовали амперометрическое определение, которое проводили на приборе «Цвет Яуза АА-01». Условную массовую концентрацию антиоксидантов измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации кверцетина, который использовался в качестве стандарта. Максимальное количество антиоксидантов содержится в гиматомелановых кислотах и изменяется от 0,2*10^-3 мг/мл при концентрации 0,001% до 73,5*10^-3 мг/мл при концентрации 1,0%. В гуминовых кислотах содержание антиоксидантов меньше, чем в гиматомелановых кислотах 2 раза, в гумусовых кислотах - в 3,3 раза, в фульвовых кислотах - в 10 раз (табл.4).

Таблица 4

Значения величин суммарного содержания

антиоксидантов (ССА) амперометрическим методом

	Концентрация раствора (масс. %)	ГМК	ГК	ГсК	ФК
ССА *10-3 мг/мл	0,001	0,20±0,05	0,10±0,01	0,06±0,02	0,02±0,01
	0,010	2,10±0,02	0,58±0,01	0,52±0,01	0,32±0,01
	0,100	9,98±0,02	3,87±0,03	2,18±0,04	1,02±0,02
	1,000	73,50±0,01	25,6±0,04	10,6±0,01	5,46±0,03

Проведенные исследования показали, что суммарное содержание антиоксидантов прямолинейно зависит от концентрации гуминовых веществ, что позволяет использовать амперометрию для количественного определения гуминовых веществ пелоидов (табл. 5). Нами разработана методика, которая может служить одним из способов стандартизации гуминовых веществ пелоидов. Массовую концентрацию антиоксидантов в гуминовых веществах измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации гуминовых веществ.

Таблица 5

Результаты амперометрического определения

суммарного содержания антиоксидантов в гуминовых веществах пелоидов

Фракции	Линейность, мг/мл	Метрологические характеристики n=15
Фульвовых кислот	от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,996)	Х±∆Х=0,00507±0,00017 ε, % =3,4
Гиматомелановых кислот	от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,997)	Х±∆Х=0,00994±0,00026 ε, % =2,7
Гуминовых кислот	от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,999)	Х ±∆Х=0,0042±0,0003 ε, % =4,5
Гумусовых кислот	от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,996)	Х ±∆Х=0,0042±0,0003 ε, % =4,5

Для построения градуировочного графика гуминовых веществ последовательно регистрировали сигналы стандартных растворов в порядке возрастания их концентрации. Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли пять последовательных измерений для каждого из пяти градуировочных растворов.

Предлагаемая методика валидирована по основным критериям, она линейна и воспроизводима. В ходе проведенных исследований показана возможность применения жидкостного хроматографа «Цвет Яуза АА-01» для определения суммарного содержания антиоксидантов в субстанциях гуминовых веществ.

Исследование антиоксидантной активности методом Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции проводили по методике Ю.А. Владимирова. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 0,05М раствора железа (II) сульфата, ускоряющего процессы окисления. Определяли спонтанное свечение, амплитуды быстрой и медленной вспышки, светосумму свечения (табл.6). Величины показателей выражали в условных единицах.

Таблица 6

Биологическую доступность гуминовых веществ пелоидов определяли фотоэлектроколориметрическим методом диализа через биологические мембраны животного происхождения. По результатам эксперимента рассчитана степень диализа, которая имеет при физиологической кислотности (рН 7,4) максимальное значение у фульвокислот (0,5), а минимальное - у гуминовых кислот (0,2). Гиматомелановые кислоты характеризуются промежуточным значением степени диализа равным 0,35. Введение диметилсульфоксида и ионов металлов повышает биодоступность всех фракций гуминовых веществ, что, по-видимому, обусловлено изменением макромолекулярных конформационных форм.

Проведенные исследования доказывают высокую биологическую доступность гуминовых веществ, несмотря на высокое значение их молекулярных масс.