ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік кешені өсімдіктер биотехнологиясы 5В070100

Семей

1. 
   ГЛОССАРИЙ
   

2. 
   ДӘРІСТЕР
   

Американдык ғалым Ф. Скуг кұрамында минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер бар коректік ортада темекі сабағынын кесінділерінін осуін зерттеді. Ол коректік ортанын күрамына табиғи косынды кокос сүтінін орнына экзогендік фитогормон-дарды енгізді. Онын істеген тәжірибелерінде кейде каллус пайда болуы, ал кейбір жағдайда бүршіктердін калыптасуы байкалды. Коректік ортаға ауксин косылғанда каллус түзілген де, бүршік-тердін пайда болуы және осуі тежелген. Ал адениңді косканда, керісінше, бүршіктер пайда болған, яғни аденин ауксинның тежеуші әсерін бәсеңдетеді. Зерттеушілерге бүл тәжірибелер кокос сүтіндегі өсу факторынын күрамында пуриндік заттардың болуы мүмкін деген ой салады. Себебі аденин нуклеин кышкылдарынын күрамына кіретін пуриндік негіз. Сондыктан олар ен алдымен нуклеин кышкылдарының әсерін талдауға кіріседі. Сонда сельдь балығынын спермасынан болініп алынған ДНҚ коректік ортаға косылса, ол темекі клеткаларынын тез бөлінуіне әсер ететіні аныкталды. Мүндай нәтижені үзак сакталған ескі ДНҚ препараты көрсетті. Шамасы, өсу факторы ДНҚ молекуласынын ыдырау кезінде пайда болғаны.

Ф. Скуг әріптестерімен бірге ашыткыдан физиологиялык \ активті зат боліп алды. Ол зат ауксиннін катысымен темекі саба-ғының езекті паренхимасы клеткаларының тез бөлінуінін, каллус үлпасынын тузілуін және онда бүршіктердін дамуын камтамасыз. Клетка болінуін үдететін осы затты олар кинетиндеп атады. К{інетин озінін химиялык күрылысы жағынан аденинге оте жакын, ол да пуриндік негіз болып есептеледі. Осылар сиякты физиологиялык әрекетшіл заттар тобына цитокиниңдер деген ат 5ерілді- Осы ғылыми жаналыкты ашу аркасында Т. Мурасиге _мен Ф- Скуг 1962 жылы өздерінің атакты коректік ортасын дайындады. Бүл орта осімдіктердің көп түрлерінін алуан үлпаларын және мүшелерін осіруге колайлы болып шыкты, казіргі уакытта кен колданылады.

Осы зерттеулер нәтижесіңде есімдіктердің клеткаларының осуі мен дамуы үшін ауксин мен цитокининнің манызы зор екендігі көрсетілді және осімдік клеткасы физиологиясынын бүл бағыты тез дами бастады. Сойтіп, клеткалары іп уігго жағдайында өсірілетін өсімдіктердін түрлерінін саны кебейе берді. Дегенмен, кандай да болмасын өсімдік түрін іп уііго өсіре бастағанда, оның өзі түрмак, тіпті сол бір өсімдіктін әрбір мүшелері мен үлпалары әр түрлі коректік ортаны кажет ететіндігін ескеру керек. Сондыктан, тәжірибе аркылы күрамы іріктеліп алынған коректік орталардын саны әте кеп және бүл жүмыс одан әрі жалғасып келе жатыр.

Өсімдіктер клеткаларын өсіру әдістерін толык жетілдіру бағытында кол жеткен күнды жетістіктердің бірі - жеке клеткаларды өсіру болды. Соның негізінде клеткалык суспензияны алу және өсіру әдістері мүкият зерттелуде. Клеткалар суспензиясы - бүл жеке клеткаларды немесе клеткалардың кішігірім топтарын сүйык ортада арнаулы аппараттарды колдана отырып, олардын аэрациясын және араластыруын камтамасыз етіп өсіру. Осындай әдіспен әсірілген жалғыз клеткадан түтас өсімдікті өндіріп шығаруға мумкіндік туды. Яғни, өсімдік клеткасынын тотшютенттік касиеті туралы Г. Габерландтын айтылған ойы, осы әдіске суйене отырып 1960-шы жылдары ғана жүзеге асты. Әсіресе, 1958 жылы сәбіздін бір клеткасынан бутін өсімдік өсіріп шьіғарған Ф.Стюардтын әріптестерімен бірге откізген тәжірибелерін ерекше айтып, ескеру керек. Клеткаларды өсіру әдісінің келесі елеулі кезеңі, ағылшын ^Ғалымы Э. Кокинг жүмыстарымен байланысты. Ол 1961 жылы томат тамыр клеткаларынын кабыкшаларын бірінші болып Ферментативті гидролизбен ыдыратып, протопластарды болді.
Дәріс 2. Өсімдік жасушаларын жасанды қоректік ортада өсіру әдістері. Қоректік орталар. Каллус алу. Каллусты өсіру. Жасушаларды сұйық қоректік орталарда өсіру

Өсімдіктен эксплантты бөліп алуды және оны коректік ортаға отырғызуды ламинар боксінде өткізеді. Бүл бокстің ішіне фильтрден өткізіліп, микроорганизмдерден тазартылған ауа беріліп тұрады. Әр түрлі тәсілмен залалсыздандырылған және дистилденген суда бірнеше мәрте жуылған объектілерден керекті улпалар бөлініп алынады. Оларды стерильденген катты немесе сүйык ортаға отырғызады. Стерильдеу үшін автоклавты колда-нады. Сөйтіп, өсімдіктердің әр түрлі үлпалары мен мүшелерін өсіруге болады. Олардьі ойдағыдай осіру үшін ең алдымен колайлы коректік орта керек/ Өсімдіктің әрбір түрі, тіпті сол бір түрінің кез келген мүшелері мен үлпалары жаксы өсу үшін белгілі коректік ортаны талап етеді. Онын үстіне, каллус пайда болу үшін, онын осуі үшін және каллуста морфогенез процесінің жүруіне түрткі жасау үшін коректік ортанын күрамы әр жолы взгеше болуы керек) Соған байланысты, әр ғалым озі зерттейтін объектісіне колайлы коректік ортаны мүкият талдап дайындауға ^тьірысады. Сондыктан, әр түрлі максатка бейімделген коректік °рта рецептерінін саны жылдан жылға көбеюде. Коректік орталар Коректік ортанын күрамына минералды түздар, көмірсулар, ^Ватаминдер, фитогормоңдар, амин кышкылдары кіреді. Клеткалар ¹¹¹ ^ітго жағдайында комірсутегіне мүктаж, себебі олар гетеротрофты коректенеді. Көмірсутегі ретінде сахароза немесе глюкоза косылады.

Көптеген орталардың күрамында витаминдер бар. Олардың ішінде ен маңыздылары В тобына жатады: В,-тиамин, В₂-рибофлавин, В₆- пиридоксин. Көп клеткалар сонымен катар нйкотин, фолий, пантетон кышкылдарын, мезо-инозитты кажет етеді. Клеткалардың өзінде витаминдер түзіледі, бірак аз мөлшерде. Сондыктан*|коректік ортаға косылған витаминдер метаболизм реакцияларынын тежелмей өтуіне ыкпалын тигізіп, клеткалардын өсуіне әсер етеді.( Барлык физиологиялык процестерді реттейтін фитогормондар , болғандыктан, олар коректік ортаның маңызды компоненттері. I Клеткаларға бөліну және дифференциялану үшін әсіресе ауксин мен цитокинин кажетГТек кана ісік клеткалары мен «калып-таскан» үлпалар гормондары жок ортада өсе алады. «Калыптаскан» каллус клеткалары гормондарды кажет етпейді, блар гормондарға прототрофты келеді, себебі өздерін-өздері камтамасыз ете алады. (Алғашкы каллусты шығару үшін және оны өсіру үшін мына ауксиндер пайдаланылады; |}-индолилсірке кышкылы (ИСК),

Каллусты алу және оны өсіру

Клеткалардын ретсіз бөлінуі нәтижесінде пайда болған үлпаны ^аллус деп атайды. Клеткалардын бөліну аркылы көбейіп өсуін пролиферация дейді. Каллус - үлпаның ерекше түрі, бүтін өсімдіктің закымданған жері (жарасы) біте бастаған кезде түзілетін "ілеуленген бүлтык. Ол закым болған жерді әр түрлі инфекциядан ^КоРҒайды. Каллус үлпасында коректік заттар жиналып, арнаулы °рғаныш кабат пайда болады немесе жойылған мүше кайта пайда °^ЛаДы, яғни регенерация процесі өтеді. каллусты алуға көбінесе өскіндердің үлпалары мен жағдаиында маманданған (дифференцияланған), бөлшу кабшеті м_{үшелерін пайдаланады}. Каллустың түзілуі алынған экспланттын тежелгенклеткаларкаитаданбөлщебастаиды,яғңимеристемалы| физиологиялык полярлығына да байланысты болады. Мысалы, күише оралады. Мамандыш белпленген дифференцияланғаіі эксллант ретінде алынған сабак кесінділерінде каллус тезірек онын клеткаларда пролиферация (бөлшу аркылы көбею) кабшетінЛ төмен, тамырға караған базаль жағында түзіледі. Соны ескере каита паида болуы дедифференциялану процесі деп аталады. АлЯ оты_рып, бүндай эксплантты аударып, бас жағын коректік ортаға дифференциялану деген даму процесшде біртекті меристемалыЯ кір, _{ізіп ОТ}ырғызады. Сонда коректік ортанын бетінде эксплантты клеткаларданморфологияльщкүрыльшыжәнеаткаратынкьізмеЯ базаль жағы орналасады да каллустын пайда болуына женілдік (функциясы) әр түрлі маманданған клеткалардын түзілуьі пы.

Мысалы, дифференциялану нәтижесінде меристемадан пайді каллустарды Петри табакшаларында, пробиркаларда, колба-болған маманданған клеткалар (мезофилл, эпидермис т.с.с.) со4| _{флакондарда өсіреді} ү_ш._{төрт апта өскен сон калЛ}у_СТЫ

шығарып алып, майда кесектерге бөліп, жана коректік ортаға _{2 4} Кдеткаларды сүйык коректік ортада өсіру көшіреді. Мұны пассаж деп атайды. Өйткені, ескі коректік ортанын нәрі азаяды, каллустын ішкі жағындағы клеткалардың сұйык ортада өсірілетін клеткаларды клеткалар суспензиясы коректенуі және ауамен камтамасыз етілуі нашарлайды. Сұйык орта ішінде клеткалар батпай, жүзген күйде кошіріп отырғызатын коректік ортанын күрамы, колданады. Мысальі, «үлпа-ене», «бағушы» деген тәсіл. Жаксы _барлык клеткаларға біркелкі әсер ететін жағдай туғызу өсіп жаткан каллустын ыкпал етуін екінші бір каллусты осіру _{суСГіеН}зиялык өсіру әдісімен жүзеге асырылады. Бүл әдістін тағы үшш пайдаланады. Ол үшін нашар өскен, немесе өсу кабшеті пайдалы жері -клеткалар өздері беліп шығаратын зиянды мүлдем төмен каллусты жаксы өсетін каллустын үстіне салады метаболиттерден онай арылады және де әр түрлі факторлардыңда, олардың екі арасына коректік ортаға алдын ала малынып _бүл ютеткалардың зат алмасу мен осу процестеріне тигізетін әсерін

алынған сүзгіш кағазды кояды. Кейде бір ьщыстың ішінде әр _{бакылап отьір}у женілденеді. Суспензияда өсетін клеткалар түрлі өсімдіктердің клеткаларын катар өсіреді. Анда-санда биохимия және молекулалык биология түрғысынан зерттеулер үлпаларды бір-біріне теледі. Сейтіп, каркынды оскен каллустан _Жү_Ргізуге колайлы келеді. Суспензиядан оз ерекшеліктері бар

бөлініп шығатын активті әлдекандай заттар баска каллустын _Тү_Ракты клеткалык популяция алуға болады. өсуіне жағымды ыкпалын тигізеді.;

Сонымен, барлык өсімдіктердің жасанды коректік ортада Клеткалар суспензиясын алу өсірілетін клеткалары, кебінесе каллус клеткалары болып келеді.Жоға_Рыда сипатталған айла-әрекеттер есімдіктін кез келген, Әдетте, клеткалар суспензиясын алу үшін каллус үлпасы кандай да болмасын тірі клеткасын үзак мерзім осіруге пайдаланылады. Кейде эксплантгын өзін сүйык ортаға салып өсіру мүмкіншілік береді. Каллус клеткаларында морфогенездінәртүрлі ар_КЫлы да клеткалык суспензия алуға болады мысалы,

процесте_Рі өтуі мүмкін. Олардың сомалык эмбриогенез немесе тозаңкаптардан. Өсу кезінде экспланттын сыртында түзілген органогенез жолдарымен даму кабілеті бар. Ол үшін коректік I каллус клеткалары узіліп түсіп сүйык ортаға шығады да, олардан ортанын күрамын озгертіп, каллус үлпасын белгілі бір даму суспензия пайда болады. Бірак бүл үзак және тиімсіз процесс.. Соның аркасында жеке-дара клеткадан Каллустан жеке клеткаларды ферменттік мацерациямен ьщыратып бүтін регенерант осімдік өндіріп шығаруға болады. Бүлі ^һөл_ш алуға да болады. Тек кана, мүндай жағдайда клеткалар регенерация процесі өсімдік клеткасының бірегей касиетш зақымдануы мүмкін сондыктан, үзак уакыт тіршілік етеді. Борпылдак каллусты өсіргенде коректік ортаға А Косады, ал цитокининнің мелшерін азайтады немесе оны

тіпті коспайды. Тағы бір шарт - коректік ортада кальций ионы I болмауы ксрек, себебі ол кальций пектинатынын түзілуіне әсер ] етеді. Кальций пектинаты клеткаларды өзара байланыстырып 1 түратын негізгі зат. Одан кұтылу үшін каллуска пектиназа I ферментімен әсер ету керек.

Борпылдак каллусты сүйык ортада жиі шайкап, араластырғандаі ол жеке клеткаларға ыдырайды және кішігірім клеткалықі агрегаттарға бөліне бастайды. Бөлінбей калған тығыз каллустыңі калдыктарын және ірі агрегаттарды 1 -2 кабат дәке немесе нейлон I аркылы сүзіп алып тастайды. Немесе суспензияны бірнеше минуті козғалтпай койып, оны түндырып, устіңгі жағында батпай калғані жеке клеткалар мен майда клетка топтарын бөлек күйып алады. Суспензиянын үстінгі жағындағы женіл фракциясын жаңа ортаға жиі-жиі көшіріп өсірсе, жеке клеткалардың саны көбейеді. Оған коректік ортанын күрамы, аэрация және араластыру әдістері де әсер етеді. Бірак канша күш салғанмен, тек біркелкі жеке клеткалардан түратын суспензияны алу мүмкін емес. Ең жаксы деген суспензияда жеке клеткалар үлесі 50-60%-тен аспайды, калғаны 2-10 клеткадан түратын, тіпті одан да көп клеткалар топтасқан агрегаттар болады. Өте ірі агрегаттардын сырткы кабатындағы клеткалары мен ішкі жағында орналаскан клеткаларының коректену және аэрация жағдайлары өзгеше болатындығын ескерген жөн.

Жеке клеткалары көп, яғни жаксы дисперленген суспензияны алу максатьшен көбінесе коректік ортаның күрамын бакылауға I тырысады. Бар мәліметтер бойынша, ауксиндер клеткалардын I бір бірімен жабыспауына, жеке-дара болуына (диссоциация- I лануына) дүрыс әсер етеді, ал цитикининдер, керісінше, ол ! процесті тежейді. Демек, клеткалардын созылып өсуіне колайлы і және олардын бөлінуін тежейтін жағдайлар суспензиядағы клеткалар топтарыньщ барынша бөлшектеніп, майдалануына мүмкіндік туғызады. Коректік ортадағы көмірсулар клетканын сырткы кабығындағы полисахаридтердін күрамын өзгерту аркылы клеткааралык байланыстарға әсер етуі мүмкін. Мысалы, коректік ортаға галактоза, рафиноза немесе сахароза косылғаңца раушангүл суспензиясындағы клеткалар онай топтасып, өте ірі агрегаттар 1 күрған. Клетка кабығындағы целлюлозаны ыдырататын I ферменттер (целлюлаза, мацерозим) осмотикпен бірге косылып әсер еткенде суспензиядағы клеткалардын диссоциациялануы арта _түееді. Мүлде жеке клеткалардан түратын суспензияны өсіру каншама тартымды да, кызығарлыктай болса да, бүл максатка жету биология түрғысынан алып карағанда өсімдік клеткалары үшін тіпті мүмкін емес. Себебі, тек жеке клеткалардан түратын суспензия алу үшін клеткалар бөліне сала бір-бірінен тез ажырап _кетуі кажет. Бірак бүл өсімдік клеткасына тән касиет емес, сондыктан оны жасанды жағдайда іске асыру киынға соғады. $Каксы суспензияда морфология жағынан біркелкі, шағын көлемді «леткалар үсак агрегаттарға бірігіп топтасады (шамамен Ю клеткалы топтар). Каркынды өсуді камтамасыз ету үшін суспензияда клеткалардын тығыздығы бір миллилитр ортада 10⁵-ІО⁶ клетка болуы кажет.

Сүйык ортада өскен клеткаларды, алғашкы каллуска карағанда, жиірек жана коректік ортаға көшіреді. Жана коректік ортаға көшіретін суспензиянын бөлігін инокулюм деп атайды. Оны стерильденген пипеткалармен, шприцтермен немесе, жоғарыда айтылғандай, суспензияны түндырып, онын үстінгі жағындағы батпай калған клеткаларды іркіп күйып алады.