Примерная программа дисциплины "Молекулярная биология"

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

Понятие генетической рекомбинации - перераспределение генетического материала, приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Обеспечение генетической изменчивости. Типы рекомбинации. Гомологичные молекулы ДНК.

Гомологичная, или общая рекомбинация (кроссинговер). Ее единые принципы, наличие общей гомологии между рекомбинирующими ДНК и участие большого набора специальных белков. Разрыв – перевоссоединение цепей. Формирование гетеродуплекса. Случаи гомологичной рекомбинации – в профазе первого деления мейоза, в соматической клетке на стадии G1, после конъюгации или трансдукции бактериофагом у E.coli (вблизи обеих концов линейного фрагмента).

Эктопическая рекомбинация между гомологичными участками одного генома как частный случай гомологичной рекомбинации. Возникновение делеций, инверсий и дупликаций.

Общая модель кроссинговера (модель Холидея). Полухиазма Холидея, ее удлинение («миграция ветвления»), изомеризация и разрешение. Равная вероятность образования некроссоверных (с внутренним гетеродуплексом) и кроссоверных хроматид. Универсальность модели Холидея. Ее экспериментальное подтверждение. Резолвазы и белки, осуществляющие миграцию ветвления. Конверсия гена – коррекция гетеродуплекса по типу эксцизионной репарации.

Общая рекомбинация у E.coli. Генетический контроль и молекулярный механизм. Функция главного рекомбинационного белка Rec A (продукт гена rec A) in vitro – приводить во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичным дуплексом. Rec A как ДНК-зависимая АТФаза, имеющая два сайта связывания ДНК. Rec A – ДНК-филамент: его последующее связывание с «голой» ДНК; образование D-петли.

Основной путь рекомбинации у E.coli: Rec BCD. Инициация рекомбинаций Rec BCD-нуклеазой (ДНК-зависимая АТФаза, хеликаза, экзо- и эндонуклеаза). Образование рекомбиногенного одноцепочечного 3'-конца в хи-сайте, роль SSD белков; связывание Rec A. Разрезание D-петли, образование полухиазмы. Залечивание бреши и разрывов ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. Миграция ветвления и разрешение полухиазмы с участием белков RuvA, RuvB, RuvC.

Роль гомологичной рекомбинации. Пострепликативная, или рекомбинационная репарация прокариот: незастроенная брешь против повреждения. Митотическая рекомбинация у эукариот: репарация двуцепочечного разрыва, генная конверсия протяженных вставок (или делеций) у дрожжей. Мейотическая рекомбинация в профазе первого деления. Синаптонемный комплекс. Рекомбинационный узелок. Хиазмы – морфологический результат произошедшего кроссинговера. Неравный кроссинговер. Модель мейотической рекомбинации. Ее экспериментальное подтверждение.

Биологическое значение гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная репарация. Вклад в генетическую изменчивость путем перекомбинации генов. Перестройки хромосом (в первую очередь дупликации) за счет эктопической рекомбинации. Возникновение новых генов за счет дивергенции. Мультигенные семейства.

Онтогенетические перестройки генетического материала, участвующие в регуляции работы генов. Специализированные системы гомологичной рекомбинации. Борьба паразитов с иммунной системой хозяина. Смена типа спаривания у гаплоидных дрожжей.

Сайт-специфическая рекомбинация. Наличие коротких участков гомологии (15-30 п.н.). Интеграция умеренных фагов в хромосомы бактерий. Переключение активности генов в результате инверсии участков ДНК: штаммовая специфичность фага MU за счет инверсии G-сегмента; смена фаз у сальмонеллы в результате фазовой вариации генов H1-H2. Участие сайт-специфичных изомераз типа I. Единственный случай сайт-специфической рекомбинации у многоклеточных животных – перестройки в иммуноглобулиновых ДНК у позвоночных, приводящие к перестройкам в ДНК.

Другие типы рекомбинации без гомологии. Транспозиции: перемещение подвижных генетических элементов, содержащих гены транспозазы, в ДНК-мишени. Незаконная рекомбинация: соединение разорванных концов негомологичных молекул ДНК. «Закономерные перестройки» как механизм регуляции работы генов (в основном у одноклеточных). Структурная организация некоторых подвижных элементов: IS-элементы и транспозоны, ретротранспозоны. Их повсеместная распространенность среди всех систематических групп живого мира. Их участие в инактивации и изменении активности генов, в «горизонтальном» переносе генов, в хромосомных перестройках. Общая схема рекомбинации при транспозициях. Основные механизмы транспозиций: репликативная транспозиция, перемещение ретротранспозонов.

Транскрипция у эубактерий. Понятие оперонов и полицистронных мРНК. Строение РНК-полимеразы эубактерий. Понятия «полного» и «core» фермента. Семейство сигма-субъединиц РНК-полимеразы прокариот. Промотор и терминатор транскрипции. Примеры регуляции активности генов с использованием набора сигма-субъединиц. Структура промоторов: области нуклеотидов (–35) и (–10). Структура терминаторов.

Инициация транскрипции: этапы. Понятие абортивного синтеза. Оперон как способ регуляции транскрипции. Примеры оперонов: оперон рРНК, опероны рибосомных белков и «лишние» гены в составе этих оперонов. Регуляция активности генов E.coli, утилизирующих лактозу. Lac-оперон E.coli. Схема Жакоба-Моно. Понятия “репрессор”, “активатор”, “оператор”. Способы изменения активности репрессоров и активаторов. Примеры регуляции активности оперонов на стадии инициации. Факторы, действующие на значительном расстоянии. Сопряжение транскрипции и трансляции. Понятие «аттенюации». Элонгация: факоры элонгации. Понятие «паузы элонгации». Терминация: фактор-зависимая и фактор-независимая. Фактор терминации ро. Постановка задачи об изучении регуляции транскрипции на уровне целой клетки. Современные подходы к ее решению.

Транскрипция у эукариот. Транскрипционная активность гетеро- и эухроматина. Созревание РНК и транспорт РНК из ядра в цитоплазму. РНК-полимеразы клеток эукариот. Функции РНК-полимераз I, II и III в клетке. Субъединичный состав РНК-полимераз I, II и III. Общие субъединицы. Промоторы РНК-полимеразы II. Типы промоторов, особенности их строения. Понятие: «основные факторы инициации» транскрипции. Основные факторы инициации транскрипции РНК-полимеразы II. Этапы инициации транскрипции на примере РНК-полимеразы II. Взаимодействие основных факторов транскрипции при инициации. Дополнительные факторы инициации, места связывания факторов транскрипции. Удаленные места связывания факторов. Способы изменения активности факторов. Транскрипционная активность гена есть результат свзаимодействия активаторов и ингибиторов транскрипции. Особенности регуляции транскрипции в многоклеточных организмах. Гены «домашнего хозяйства». Элонгация. Факторы элонгации. Терминация транскрипции. Примеры нарушения регуляции транскрипции генов в многоклеточных организмах. Постановка задачи об изучении регуляции транскрипции на уровне целой клетки. Современные подходы к ее решению.

Понятие процессинга. Редактирование как частный случай процесинга. Некоторые типы редактирования РНК. Разрезание и подравнивание рРНК и тРНК бактерий; участие рибозима. Процессинг рРНК эукариот - метилирование рибозы, образование рибонуклеопротеида, расщепление по концам спейсеров. Обнаружение интрона в 28S-рРНК инфузории; сплайсинг. Механизм самосплайсинга; интрон как рибозим. Созревание тРНК эукариот: процессинг как у прокариот, самосплайсинг.

Процессинг мРНК эукариот из гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Кэпирование 5'-концевой области: повышение эффективности трансляции и защита транскрипта от деградации. Строение «кэпа». Расщепление и полиаденилирование 3'- области. Сигнал полиаденилирования. ПолиА-полимераза- фермент расщепления и полиаденилирования. Деградация 3'-концевой области. Значение полиаденилирования для стабилизации транскрипта и его транспорта в цитоплазму. Регуляция экспрессии гена на стадии процессинга 3'-конца: наличие нескольких сигналов полиаденилирования. Процессинг 3'-конца транскриптов гистоновых генов с участием U7РНК.

Экзон-интронное строение кодирующей области предшественника мРНК эукариот. Сплайсинг экзонов. Правило сплайсинга. Фенилкетонурия и талассемия как результат нарушения сплайсинга. Механизм сплайсинга с образованием лассо-интрона. Сплайс(е)осома. Участие РНК-полимеразы II в процессинге гяРНК в ядре; ферменты кэпирования и полиаденилирования как факторы элонгации. Высокая скорость распада гяРНК в ядре; присоединение РНК-связывающих белков и мяРНП. Механизм сплайсинга с участием нескольких мяРНК; пространственная структура взаимодействующих участков РНК обеспечивает катализ разрыва – воссоединения связей. Экспорт мРНК в цитоплазму после завершения сплайсинга. 5'-нетранслируемая лидерная область, открытая рамка считывания и 3'-нетранслируемая область зрелой мРНК. Значение нетранслируемых областей мРНК: присутствие регуляторных элементов матричной активности; определение времени жизни мРНК и ее внутриклеточной локализации.

Регуляция экспрессии генов путем альтернативного сплайсинга. Образование тканеспецифических изоформ белка. Экономичное использование РНК-предшественника. Включение и выключение генов. Регулируемый белками каскад процессов альтернативного сплайсинга, определяющий становление пола у дрозофил. Интроны как предшественники мяРНК. Пересмотр понятия «один ген – один белок». Современное определение гена.

Транссплайсинг фрагментов РНК, синтезированных на разных генах. Миниэкзоны трипаносом и нематод. Механизм транссплайсинга с участием Y-интермедиата.

Генетический код. Экспериментальная расшифровка генетического кода в опытах Бреннера и Крика на мутантах бактериофага T4 (1961 г.). Понятие кодона. Триплетность, вырожденность, неперекрываемость кода без запятых. Установление «универсального» кодового словаря (бактерии, цитоплазма эукариот). Терминаторные кодоны. Семьи кодонов. Различия между «универсальным» и митохондриальными генетическими кодами. Особенности митохондриального кода млекопитающих, дрозофилы, дрожжей, растений. Краткая характеристика митохондриальных геномов.

Транспортные РНК. Доказательство Шапвиллем адапторной гипотезы Крика. Понятие антикодона тРНК. Его расположение во вторичной и третичной структуре тРНК. Кодон-антикодоновые взаимодействия. Стереохимия кодон-антикодонового комплементарного комплекса. Минорные нуклеотиды тРНК. Гипотеза нестрогого соответствия Крика: неоднозначное спаривание первого нуклеотида антикодона с третьим нуклеотидом кодона. Особенности этих положений антикодона и кодона. Правила кодон-антикодонового спаривания Крика и их некоторые следствия.

Понятие трансляции. Химические реакции биосинтеза белков. Типы образующихся связей. Энзимология процесса. Энергетический баланс биосинтеза белков. Энергетическая избыточность реакций обеспечивает высокие скорости и надежность синтеза белков.

Транспортные РНК. Адапторная гипотеза Крика и ее доказательство. Изоакцепторные тРНК. Структура тРНК. Первичная структура: длина цепей, 3'-конец, «минорные» нуклеотиды, консервативные участки; вторичная структура: «клеверный лист», двуспиральные и односпиральные участки, каноническое и неканоническое спаривание оснований. Третичная структура: L-форма, влияние комплексообразования с аминоацил-тРНК-синтетазой. Дорибосомный этап белкового синтеза. Реакции аминоацилирования тРНК: активирование аминокислот с образованием аминоациладенилатов и перенос аминоацильных остатков на тРНК.

Аминоацил-тРНК-синтетазы: специфичность, разнообразие, субъединичная структура. Особенности эукариотических синтетаз. Позиционная (2', 3') специфичность синтетаз по отношению к гидроксилам концевого аденозина тРНК и деление синтетаз на два класса. Консервативные мотивы в каждом из классов. Субстрат-связывающие центры ферментов и их взаимодействие. Специфичность аминоацилирования тРНК по отношению к аминокислоте и по отношению к тРНК. Ошибки при активации аминокислот и механизмы коррекции. Каскадное усиление специфичности в отношении аминокислот. Отбор «правильных» тРНК. «Второй генетический код» – уникальная структура тРНК, обеспечивающая ее акцепторные функции. Элементы, определяющие «индивидуальность» отдельных тРНК. Роль антикодона, нуклеотида-дискриминатора, первых трех пар нуклеотидов акцепторного стебля, некоторых неконсервативных нуклеотидов D- и T-петель тРНК. Структурная комплементарность тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз.

Рибосомный этап трансляции. Стадии трансляции: инициация, элонгация и терминация. Последовательное считывание мРНК рибосомами. Полирибосомы. Рабочий (элонгационный) цикл рибосомы.

Структура рибосомы. Локализация рибосом в клетке. Свободные и мембраносвязанные рибосомы. Прокариотический и эукариотический типы рибосом. Рибосомы митохондрий и хлоропластов. Размер и подразделение рибосом на две субчастицы. Детальная форма рибосомных субчастиц. Модели объединения субчастиц в целую рибосому.

Рибосомные РНК. Значение рибосомной РНК. Виды рибосомных РНК: высокополимерная РНК большой и малой субчастиц; 5S РНК большой субчастицы. Первичные и вторичные структуры. Гомология первичной структуры рРНК различных организмов и систематика. Структурные домены и компактная самоукладка молекул РНК. Рибосомные белки. Разнообразие, номенклатура. Кооперативные группы рибосомных белков. Взаимодействие с рибосомными РНК. Взаиморасположение рибосомной РНК и белков. Периферическое расположение белков на ядре РНК.

Функциональные активности и функциональные участки рибосом. Функции связывания: связывание и удержание матричного полинуклеотида (мРНК-связывающий участок); удержание пептидил-тРНК или деацилированной тРНК (тРНК-связывающий Р-участок); связывание аминоацил-тРНК (тРНК-связывающий А-участок), связывание белковых факторов трансляции и ГТФ (фактор-связывающий участок). Каталитические функции: ГТФаза; пептидил-трансфераза. Функции перемещений лигандов (транслокация).

Элонгационный цикл рибосомы. Участие фактора элонгации (EF-Tu эубактерий или EF-I эукариот) в связывании тРНК. EF-Tu и его взаимодействия; связывание тройного комплекса с рибосомой; роль гидролиза ГТФ. Последовательность событий и молекулярные механизмы: перебор тРНК; узнавание антикодона; отбор правильного кодон-антикодонового комплекса. Транспептидация (образование пептидной связи). Транслокация. Участие фактора элонгации (EF-G эубактерий или EF-2 эукариот) в транслокации. Сопряжение транслокации с EF-G - опосредованным гидролизом ГТФ (Винтермайер, 1997 г.). Пре- и посттранслокационное состояние рибосомы. Передвижение матрицы при транслокации. Данные рентгеноструктурного анализа факторов элонгации. РНК-белковая мимикрия. Модель динамической работы рибосомы в элонгационном цикле.

Инициация трансляции. Значение инициации трансляции. Инициирующие кодоны и их положение в мРНК про- и эукариот. Инициаторные тРНК и инициаторы трансляции. Белковые факторы инициации. Состояние рибосом перед инициацией. Инициация трансляции у прокариот. Ассоциация прокариотической 30S-субчастицы рибосомы с матричным полинуклеотидом. Последовательность событий в процессе инициации у прокариот. Инициация трансляции у эукариот. Образование прединициаторного 40S-комплекса эукариотической малой субчастицы. Связывание 40S субчастицы с инициаторной тРНК. Ассоциация рибосомной 40S субчастицы с мРНК. Образование инициаторного 48S-комплекса.

Терминация трансляции. Про- и эукариотические белковые факторы терминации; узнаваемые ими терминирующие кодоны. Связывание факторов терминации в А-участке рибосомы. Гидролиз пептидил-тРНК. Освобождение лигандов. Диссоциация субчастиц.

Регуляция трансляции у прокариот. Скорость распада мРНК в изменяющихся условиях среды и регуляция использования мРНК на стадии инициации. Участок связывания рибосомы (RBS) мРНК: инициаторный кодон; последовательность Шайна-Далгарно, связывающая 3'-конец 16S-РНК малой субчастицы рибосомы. Энхансеры за пределами RBS. Изменение вторичной структуры мРНК: трансляционное сопряжение, вовлечение в шпильки инициаторных и терминирующих кодонов. Трансляционные репрессоры: аутогенная регуляция трансляции структурными белками рибосом E.coli.

Регуляция трансляции у эукариот на стадии инициации. Включение активности кэп-связывающего инициаторного белка 4E путем фосфорилирования его самого и его репрессора; зависимость активности соответствующих киназ от условий и фазы роста клеток. Регуляция активности метионил-тРНК-связывающего фактора инициации 2 по механизму фосфорилирования его альфа-субъединицы протеинкиназой R. Подавление трансляции в ответ на вирусную инфекцию.

Взаимодействие рибосомы и растущего пептида с мембраной. Котрансляционный трансмембранный транспорт секреторных и интегральных мембранных белков. Синтез белков свободными и мембрано-связанными полирибосомами; их локализация. Способы соединения рибосомы с мембраной. N-концевая сигнальная последовательность растущего полипептида. Сигнал-узнающие частицы и их мембранные рецепторы.

Котрансляционные модификации белка: деформилирование, диметионилирование, отщепление N-концевой последовательности, тиол-дисульфидный обмен (образование дисульфидных связей), N-гликозилирование, гидроксилирование. Пост-трансляционный транспорт, компартментализация и модификация белков. Сворачивание полипептидной цепи в нативную конформацию. Роль шаперонов и шаперонинов в сворачивании.

ФОРМИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Роль белковых молекул в функционировании живых организмов. Первичная структура белков. Аминокислотные остатки – мономеры белковых цепей. Аминокислоты, входящие в состав белков, их строение. Заменимые и незаменимые аминокислоты. Редкие аминокислоты, входящие в состав белков. Аминокислоты, не встречающиеся в белках. Пептидная связь. Полипептидная цепь. Структура и кислотно-основные свойства пептидов. Природные пептиды.

Уровни организации белковой молекулы. Первичная структура как уровень организации белка. Доказательство индивидуальности белка. Микрогетерогенность белков. Количественное определение аминокислотного состава белков. Использование автоматических анализаторов. Гидролитическое расшепление белка с помощью протеолитических ферментов. Расщепление белковой цепи по метиониновому остатку бромистым цианом. Разделение и анализ пептидов. Идентификация N- и С-концевых остатков в белках и пептидах. Определение первичной структуры пептидов. ДНФ метод Сенгера. Метод Эдмана. Автоматические секвенаторы. Стыковка пептидов.

Значение изучения первичной структуры белков для решения проблем эволюции и систематики организмов. Эволюция первичных структур глобинов, цитохромов, иммуноглобулинов.

Вторичная структура белка. Структурные особенности пептидной связи, определяющие формирование регулярной вторичной структуры. Стерические ограничения и вторичная структура пептидной связи. Роль водородных связей в формировании вторичной структуры. Виды регулярной вторичной структуры. Спиральные и бета-структурные участки в глобулярных белках. Соотношение между первичной и вторичной структурами. Статистические закономерности в распределении аминокислотных остатков в спиральных, бета-структурных и нерегулярных участках глобулярных белков. Возможность предсказания вторичной структуры. Проблема стабильности вторичной структуры. Экспериментальные методы изучения вторичной структуры белков. Рентгеноструктурный анализ. Оптические методы изучения вторичной структуры. Метод кругового дихроизма. Дисперсия оптического вращения.

Третичная структура белков. Стабильность пространственной структуры белка.

Компактность формы. Наличие гидрофобных ядер и полярной оболочки. Присутствие гидрофобных аминокислот в оболочке, их функциональное значение. Природа сил, стабилизирующих трехмерную структуру белка. Гидрофобные взаимодействия. Водородные и солевые связи. Ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Роль дисульфидных связей в стабилизации третичной структуры некоторых белков. Форма, компактность и динамика молекулы белка. Методы исследования пространственной структуры белка. Особенности рентгеноструктурного анализа как главного источника информации о пространственной структуре белка. Ядерный магнитный резонанс. Доменная структура белков. Образование третичной структуры белка из элементов вторичной структуры. Топология полипептидных цепей в белках и классификация пространственных структур. Соотношение между пространственной структурой белка и аминокислотной последовательностью. Схематическое представление пространственной структуры белка. Трехмерная структура некоторых белковых модулей (доменов). Особенности структуры мембранных белков. Фибриллярные белковые структуры.

Четвертичная структура белка. Геометрия четвертичной структуры белка. Гомомерные и гетеромерные белки. Формирование множественных форм гетеромерных белков. Взаимодействия между субъединицами, стабилизирующие четвертичную структуру. Структурная организация контактов между субъединицами. Способы исследования четвертичной структуры белка. Функциональное значение четвертичной структуры белка.

Денатурация белков. Разрушение нативной конформации белков изменением температуры, рН, обработкой мочевиной, гуанидинхлоридом. Действие детергентов, спиртов, электролитов.

Самоорганизация пространственной структуры белковых молекул. Ренатурация белка in vitro. Предопределенность пространственной структуры белка его аминокислотной последовательностью. Этапы пространственной сборки белка in vivo. Интермедиат («расплавленная глобула»). Участие шаперонов и шаперонинов. Сверхсинтез чужеродных белков в бактериальных клетках. Тела включения. Белки теплового шока. Ферменты, облегчающие свертывание полипептидных цепей в компактную структуру.

Некоторые функции белков. Классификация белков. Ферменты, трансферные белки, сократительные белкаи, защитные белки крови, гормоны, структурные белки, резервные белки, регуляторные белки.

Транспорт и сортировка белков в клетке. Сигнальная гипотеза транспорта белков в клетке. Секреторный путь синтеза и сортировки белков. Убиквитин-зависимая система протеолиза.

Основные понятия генной инженерии: клонирование, трансформация, вектор. Основные свойства векторов, используемых в генной инженерии. Векторы замещения. Инсерционные векторы.

Векторы на основе плазмид. Участок ori, селективные маркеры, полилинкер. Система селекции с использованием альфа цепи бетта-галактозидазы. Компетентные клетки. Сравнительная характеристика различных штаммов. Бактериофаг М13. Эффективность трансформации, ее зависимость от длины плазмиды. Векторы на основе фага лямбда. Векторы ВАС, РАС, YAC. Области применения рассматриваемых векторов.

Система модификации-рестрикции бактерий. Рестриктазы второго типа. Изошизомеры. Другие ферменты, используемые в генной инженерии: ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа фага Т4, фосфатазы. Способы встраивания чужеродной ДНК в вектор. Геномные клонотеки. Представительность клонотеки, минимальное число анализируемых клонов.

Анализ нуклеиновых кислот с помощью электрофореза. Разрешающая способность геля. Агарозные и акриламидные гели. Методы визуализации нуклеиновых кислот в геле. Конформация молекул нуклеиновой кислоты при электрофорезе. Денатурирующий электрофорез. Капиллярный электрофорез. Импульс-электрофорез.

Плавление ДНК. Температура плавления, интервал плавления. Гибридизация. Примеры «+» и «-»-гибридизации. Мембраны для иммобилизации нуклеиновых кислот. Получение ДНК- и РНК- зондов для гибридизации, Саузерн- и Нозерн-гибридизация. Использование изотопов и флюоресцентных красителей. Создание геномных клонотек, покрывающих геном. Скрининг геномных клонотек.

Картирование. Физические карты, генетические карты. Масштаб физической и генетической карты. Рекомбинационные единицы. Клонотеки, представляющие отдельные хромосомы. "Шаги" и "прыжки" по хромосоме. Энциклопедии генов.

Определение последовательности нуклеотидов. Метод полимеразной достройки ДНК с использованием модифицированных нуклеотидов-терминаторов (метод Сэнгера), метод специфической химической модификации оснований с последующим расщеплением ДНК (метод Максама-Гильберта). Автоматическое секвенирование. Определение последовательностей нуклеотидов длинных фрагментов ДНК.

Полимеразная цепная реакция. Области применения. Основные параметры реакции. Термостабильные ДНК-полимеразы.

Подходы к картированию геномов высших эукариот. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), ДНК-маркирующие сайты (STS). Различные нуклеотидные повторы и их использование для картирования. Микросателлитные маркеры. Геномная дактилоскопия. Определение полной последовательности нуклеотидов организмов. Программа «Геном человека».

Создание клонотек кДНК. Методы скрининга клонотек кДНК: гибридизация нуклеиновых кислот, иммунологическая детекция специфических антигенов, гомологичная рекомбинация, отбор по продуцированию биологически активных молекул. Определение точки начала транскрипции. Метод «футпринтинга».

Основы биоинформатики: сравнение последовательностей нуклеотидов, сравнение последовательностей аминокислотных остатков. Гомология. Идентификация функциональных областей генома на основе нуклеотидного состава. Базы данных. Знание полной последовательности нуклеотидов генома: что это дает?

Клонирование новых генов. Открытые рамки считывания. Переход к последовательности аминокислотных остатков. Анализ экзон - интронной структуры. Определение хромосомной локализации. Поиск регуляторных элементов. Предсказание функции клонированного гена по первичной структуре.

Позиционное клонирование. Ген-кандидат. Анализ сцепления. Генетические маркеры. Прямая и непрямая генная диагностика.

Генная инженерия высших эукариот. Модельные организмы. Генная терапия: задачи, подходы, векторные системы. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регуляция экспрессии внесенных генов. Морально-этические проблемы генной терапии. Оценка и возможное уменьшение биологического риска, связанного с созданием и распространением рекомбинантной ДНК.

Получение продуцентов интересующих белков. Векторные системы. Способы оптимизации продуцентов. Выделение и очистка слитных белков. Получение белков в активной форме. Посттрансляционная модификация.

Взаимосвязь генов в клетке. Генные сети. Методы изучения экспрессии генов. Подходы к изучению экспресси генов на уровне целой клетки. Array, EST. Проблемы интерпретации полученных результатов.

Протеом.