Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии»

Молекулярная организация клетки

Настоящий курс не ставит цель охватить все современные направления молекулярной организации клеток; его главная задача, – опираясь на основополагающие представления клеточной биологии о клеточном цикле, позволяющие описывать жизнь клетки во всей ее полноте, показать студентам прежде всего особенности молекулярного и биологического поведения наиболее важных структурных компонентов клетки таких, как цитоскелет и интегрированные с ним белки, а также показать основные механизмы регуляции цитоскелета в разных состояниях клетки. Продемонстрировать те успехи, которые достигнуты в понимании роли факторов роста и других регуляторных экзо- и эндогенных молекул в их влиянии – на состояние фенотипа клетки, разнообразие форм движения клетки, ее адгезивные свойства, генотипические особенности. При знакомстве с этими фундаментальными явлениями в жизни клетки достаточно подробно рассматриваются особенности молекулярной организации главных компонентов внеклеточного матрикса, всех классов молекул адгезии, важнейших семейств факторов роста. Кроме того, в курсе представлены материалы о протоонкогенах и онкогенах, о регуляторном влиянии их продуктов на жизнь клетки. Значительное внимание уделено обзору структуры и молекулярным особенностям основных классов белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, а также другим важнейшим структурам и регуляторным молекулам, которые вовлечены в этот процесс. В каждом разделе курса особое внимание обращается на причины нарушений течения тех или иных регуляторных процессов в нормальной клетке, которые приводят к патологическим изменениям в ее биологическом поведении.

Три типа филаментов участвующих в организации цитоскелета и строящих сложную двухмерноорганизованную сеть: микрофиламенты (актиновые филаменты), микротрубочки и промежуточные филаменты. Многообразие структурных и функциональных ролей каждого из типов филаментов в поведении клетки. Проблемы изучения взаимодействия элементов цитоскелета друг с другом и с плазматической мембраной; группы специфических белков, участвующих в организации таких связей. Самосборка микрофиламентов и микротрубочек; роль нуклеотидтрифосфатов. Цитоскелет и эпигенетическая информация.

Актин - один из наиболее широко представленных белков у эукариотических клеток. Актин – это прототип цитоскелетных белков. Структура молекулы актина; G-актин. Эволюционная консервативность структуры актина. Главные (основные) изоформы актинов млекопитающих. Три класса типов актина: ,  и . Уникальность одной из изоформ актина для определенного типа ткани. Актиновые филаменты - F-актин. Полимеризация актина in vitro и in vivo. Полярность актинового филамента. Скорость роста актинового филамента с «+» и «-» концов. Актин-АТФ и актин-АДФ, их участие в процессе полимеризации. Роль гидролиза АТФ в росте актинового филамента. Конформационные изменения молекул актина в формах, связанных с АТФ или АДФ. Деление механизма полимеризации актина на три стадии. Вещества, влияющие на поли- и деполимеризацию актинового филамента: цитохалазин A,B,C,D,E, фаллоидин, латринкулин A, B. Краткий обзор функций основных типов белков, связывающих актин и актиновые филаменты: связывающие мономеры актина, кэппируюшие, желатинирующие, связывающие актиновые филаменты в пучки; соучаствующие в поддержании структуры и функции филаментов; белки, ассоциирующие F-актин с плазматической мембраной, миозин. Доменная организация актин-связывающих белков: сходства и отличия. Понятие кортекса клетки, участие сети актиновых филаментов в его организации. Заякоривание актиновых филаментов на плазматической мембране, роль белков – понтикулина, кальпактина и липокортина. Спектрин – высоко специфический белок, участвующий в организации кортекса эритроцитов млекопитающих; его структура. Другие белки кортекса эритроцита: «bandIII» и гликофорин; анкирин, тропомиозин, белок 4.1, аддуцин; их структура и роль в организации кортекса эритроцита. Изоформы спектрина: эритроцитарные и неэритроцитарные формы – фордин и TW260/240.

Роль актиновых филаментов в индукции формирования и сборки сайтов адгезии – фокальных контактов и фокальной адгезии. Зависимость течения фагоцитоза от специфической связи рецепторов фагоцитоза с актиновыми димерами.

Структурная и функциональная роль актиновых филаментов в процессе сокращения эукариотических клеток. Миозиновая и актиновая регуляция сокращения клеток. Миозин II из скелетной мускулатуры. Тонкая организация саркомера. Структура молекулы миозина II. S1 фрагменты головки миозина; «декорирование» S1 фрагментами актиновых филаментов. Эссенциальные и регуляторные легкие цепи головки миозина; их роль в гидролизе АТФ при взаимодействии миозина с актином. Миозин – это АТФаза. Механизм движения головки миозина II вдоль актинового филамента. Структура хвоста миозина II, роль в ассоциации и образовании «толстых филаментов» саркомера. Общая схема миозиновой регуляции поперечно-полосатой мускулатуры. Роль альфа-актинина и десмина в структурной организации саркомера. Структура тропомиозина, его изоформы. Структура тропонинов T, I, С, их взаимодействие с тропомиозином и их роль. Взаимодействие комплекса тропонинов с тропомиозином и с актиновыми филаментами. Механизм регуляции мышечного сокращения, участие Са²⁺ , тропониновой системы, тропомиозина и F-актина. Изоформы миозина II - возможные функции у эукариотических клеток.

Миозин I – миозин немышечных и гладкомышечных клеток. Структура и изоформы миозина I, сравнение с миозином II. Особенности поведения молекулы миозина I в акте сокращения: активация легких цепей путем фосфорилирования; роль киназы легких цепей миозина; роль Са²⁺ и кальмодулина; структура и функции кальмодулина. Фосфорилирование легкой цепи изоформ миозина I у немышечных клеток. Молекулярные механизмы миозиновой и актиновой регуляций сокращения немышечных и гладкомышечных клеток. Роль кальдесмона и кальпонина; структура и молекулярные свойства этих белков. Семейство миозинов I неспособных образовывать филаменты: их транспортная роль в клетке.

Кортикальный F-актин и роль миозина I в сокращении сократительного кольца (кольца деления) у ана-телофазных клеток и в организации опоясывающих десмосом у интерфазных клеток, а также в движении и подвижности плазматической мембраны.

Амебоидное движение и подвижность немышечных клеток: сходство и различия, роль субстрата для этих двух типов движения клеток. Амебоидное движение амеб и макрофагов; роль внеклеточных стимулов для образования псевдоподий. Структура псевдоподий; экто- и эндоплазма, переходы золь-гель. Роль актиновых филаментови альфа-актинина в образовании геля; структура альфа-актинина: доменная организация, особенности взаимодействия с актиновыми филаментами. Цитоплазматический золь – двумерноорганизованная структура, где решающая роль принадлежит группе актин-фрагментирующих белков – северину, гельзолину. Структура гельзолина, его изоформы, три актин-связывающих сайта гельзолина, роль ионов кальция в поведении гельзолина. Кэпирование гельзолином «+»концов фрагментов филаментов.

Роль миозинов I и II в потоке цитоплазмы при амебоидном движении. Триггерная роль ионов кальция и инозитолфосфатов в индукции образования и роста псевдоподий. Роль пула G-актина в образовании клеточно-поверхностных выпячиваний. Структура и роль белков, связывающих мономеры актина в регуляции полимеризации кортикальных актиновых филаментов: (1) семейство тимозинов; (2) семейство ADF/кофилин; (3) профилин, локализация в клетке, влияние на конформацию молекулы актина, роль в обмене AДФ на АТФ в молекуле актина.

Использование Shigella flexneri другого механизма для сборки актиновых хвостов. IcxA – белок бактериальной стенки Shigella. Источником ABM-1 последовательности является винкулин клетки-хозяина. Протеолиз винкулина и обнажение ABM-1. Взаимодействие IcxА с р90 полипептидом винкулина, содержащем ABM-1; взаимодействие последнего с комплексом тетрамер VASP-профилин; индукция полимеризации актина и формирование актинового хвоста Shigella.

Роль микротрубочек в жизни эукариотических клеток. Их значение для поддержаниия симметрии клетки и в определении ее полярности; участие в движении и морфогенезе клеток. Стабильность микротрубочек - сравненис с F-актиновым.

Микротрубочки – ассоциированные белки (МАРs). Разнообразие МАРs; роль в контроле полимеризации микротрубочек; уникальные МАРs, характерные для определеных типов клеток или для различных участков одной клетки. Роль МАРs в определении уникальности тех структур, которые собираются из микротрубочек. “tau”-белок, разнообразие изоформ; роль “tau”-белка в усилении полимеризации тубулина и стабилизации микротрубочек аксонов. Нервные клетки содержат МАР1А и В, МАР2А и В.

Низкая страбильность микротрубочек; эксперименты, демонстрирующие рост и турновер микротрубочек in vivo. Срудняя продолжительность жизни микротрубочек в клетке. Популяции стабильных и нестабильных (динамичных) микротрубочек; возможная их роль в жизни клетки. Гипотеза динамичной нестабильности микротрубочек. ГТФ-кэп и ГДФ-кэп у полимеризующихся микротрубочек. Конформационные изменения -субъединиц, связавших ГТФ; роль этих изменений в полимеризации тубулина; гидролиз ГТФ в составе полимера.

Гетерогенность - и -тубулинов. Доказательства существования различных изотипов - и -тубулинов. Число генов - и -тубулиновСравнительный анализ кДНК, кодирующих шесть различных типов - и -тубулина. Экспрессия шести классов изотипов -тубулина в различных тканях птиц и мышей; степень гомологии этих изотипов. Тканеспецифическая экспрессия III, IVa, IVb и VI классов -тубулинов. Различные МАРs связываются с определенными классами -тубулинов. Особенности экспрессии изотипов -тубулинов при формировании жгутиков спермиев млекопитающих в норме и патологии.

Посттрансляционная ковалентная модификация -тубулинов. Ацетилирование лизинового остатка -тубулинов;их участие в морфогенезе ресничек. Деацетилирование -тубулина. Отщепление тирозинового остатка от COOH-концевого участка -тубулина. Детирозиназы. Стабильная популяция микротрубочек и детирозинированный -тубулин. Влияние внешних сигналов (факторов роста и др.) на быструю перестройку и дезагрегацию микротрубочек, связанную с движением клетки, изменением ее полярности; роль стабильной популяции микротрубочек в этих процессах. Стабильные микротрубочки, обогащенные детирозинорованным -тубулином, участники начальных этапов установлении ассиметрии (апикальная-базальная части) эпителия. Посттрансляционные модификации -тубулинов – маркеры высоко стабильных микротрубочек. Роль кэпирования «+»-концов микротрубочек для достижения их стабильности.

Роль промежуточных филаментов в жизни клетки: формирование высокостабильной скелетной сети в составе цитоскелета. Главное отличие промежуточных филаментов от актиновых филаментов и микротрубочек – высочайшая стабильность. Структура субъединиц белков промежуточных филаментов и сборка цитоплазматических филаментов. Шесть классов белков промежуточных филаментов. Тканеспецифический характер экспрессии белков этих классов. Значение паттерна экспрессии промежуточных филаментов для ранней диагностики патологических изменений тканей. Субъединица белков промежуточных филаментов - -спиральный димер; гомо- и гетеродимеры; полимеризация димеров, протофиламенты; их антипараллельность; аполярность протофибрилл; сборка филамента. Доменная организация мономерных белков протофиламентов: голова, хвост, -спиральный центральный домен; вариабельные и константные части мономера; тандемные повторы аминокислотных остатков; их роль во взаимном скручивании и латеральных взаимодействиях при димеризации мономеров. Сравнение структуры мономеров кератина, виментина, нейрофиламентов и ядерной ламины. Положение потенциальных сайтов фосфорилирования киназой p34^cdc2.

Клеточноспецифическая экспрессия белков, входящих в состав промежуточных филаментов: виментина, десмина, трех белков нейрофиламентов – NF-L, NF-M, NF-H, кислого фибриллярного белка, ядерной ламины, кератинов. Особенности молекулярной организации кератинов: гетеродимеры. Примеры тканеспецифической экспрессии белков промежуточных филаментов в процессе развития и ходе дифференцировки: кератинов у эмбриональных тканей и кожного эпителия человека; виментина – при развитии производных мезодермы, дифференцировке мезенхимы и нервной ткани; транзиторный характер экспрессии виментина; десмина – в ходе развития сердечной, поперечнополосатой мускулатуры и гладкомышечных клеток; -интернексина – в развитии ЦНС, периферина – в развитии периферической нервной системы; нестина – экспрессия в нейроэпителиальных стволовых клетках зародыша человека и мыши. Белки промежуточных филаментов – как тканеспецифические маркеры in vivo в норме и при патологии. Изменение паттерна экспрессии белков промежуточных филаментов при культивировании клеток. Диагностика типа раковых опухолей и стадий ракового перерождения путем типирования белков- маркеров промежуточных филаментов.

Особенности расположения «скелетной» сети промежуточных филаментов в клетке или ее отростках. Механические свойства цитоскелета, построенных промежуточными филаментами. Роль промежуточных филаментов в интеграции клеток в эпителиальные пласты; десмосомы; короткие десмосомы, интеркалярные диски, плотные тельца гладкомышечных клеток, гемидесмосомы, их структура, молекулярный состав, распространение и функции.

Роль экстрацеллюлярного матрикса (ЭцМ) в поддержании целостности тканей и органов. Разнообразие типов ЭцМ у многоклеточных животных и многообразие выполняемых функций: механическая, фильтрационная, адгезионная. Специализированные формы ЭцМ – базальные мембраны. Основные компоненты ЭцМ: коллагены, фибронектин, ламинины, протеогликаны и гликозамингликаны. Продукция клетками типоспецифического по составу матрикса; примеры: рыхлая и оформленная соединительная ткань. Информационная роль ЭцМ в жизни клетки: влияние на поведение клетки адгезионных молекул ЭцМ – при морфогенезе тканей и органов в ходе развития, при миграции клеток на ранних этапах онтогенеза; при ранозаживлении, влияние на течение воспалительных процессов; роль в онкогенезе. Матрикс - ассоциированные информационные молекулы – факторы роста, их роль в поведении клетки. Обновление ЭцМ, роль различных классов внеклеточных протеиназ: сериновые протеиназы, эластаза, коллагеназа и другие металлопротеиназы, липопротеинлипазы, гиалуронидаза и другие.