Активация аминокислот для белкового синтеза

Процесс состоит из двух стадий, протекающих в активном центре фермента. На первой стадии в результате взаимодействия аминокислоты и АТФ образуется аминоациладенилат, на второй – аминоацильный остаток переносится на соответствующую тРНК.

Ход реакций:

1. 
   Аминокислота (R) +АТФ + фермент (E^R)  E^R (аминоацил-аденилат)+ФФН
   
2. 
   E^R (аминоациладенилат) + тРНК^R  Аминоацил-тРНК + АМФ + E^R
   

Аминокислота (R) + тРНК^R + АТФ аминоацил-тРНК^R + АМФ + ФФ_Н

Эфирная связь между аминоацилом и тРНК является высокоэнергетической, энергия используется в синтезе пептидной связи.

Так образуются в цитоплазме клетки все необходимые для биосинтеза белка активированные аминокислоты, соединенные с соответствующими им адапторами − разнообразные аминоацил-тРНК (аа-тРНК ). Они используются в белковом синтезе на стадиях инициации и элонгации.

Синтез мРНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК − промотора. После присоединения к нему РНК-полимеразы прилежащий виток спирали ДНК раскручивается, две цепи ДНК расходятся в результате разрыва водородных связей между комплементарными основаниями цепей на расстоянии примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Так образуется транскрипционная вилка, в которой матрица доступна для фермента. По одноцепочечной матрице РНК-полимераза синтезирует цепь РНК из свободных рибонуклеотидов, причем против аденина в ДНК встает комплементарный ему урацил. По мере продвижения РНК-полимеразы пройденные ею участки ДНК вновь объединяются в двойную спираль. Матрицей для транскрипции служит одна из цепей ДНК, ее называют кодогенной. Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит специальную нуклеотидную последовательность − терминатор (стоп-кодон). В этом участке фермент отделяется и от матрицы, и от новообразованной молекулы мРНК. Синтезированная молекула РНК содержит точную копию информации, записанную в соответствующем участке ДНК (рис. 8).

Рис. 8. Схема механизма транскрипции. В присутствии РНК-полимеразы двойная спираль ДНК раскручивается в результате разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, при использовании свободных рибонуклеозидтрифосфатов строится полинуклеотидная цепь мРНК. Она комплементарна транскрибируемой цепи ДНК, которая служит матрицей.

У прокариот к образующейся цепи мРНК сразу же присоединяются рибосомы, начиная белковый синтез (рис. 9).

В эукариотических клетках мРНК сначала "дозревает" в ядре, а затем соединяется со специальными белками, которые обеспечивают ее прохождение через поры ядерной оболочки в цитоплазму.

Рис. 9. Процесс транскрипции и образование полисомы у бактерий. А – Электронная микрофотография участка хромосомы, на которой можно видеть последовательные стадии образования мРНК и присоединения рибосом. Б – Схематическое изображение структуры вроде показанной на фотографии.

В клетке присутствует несколько σ -частиц, обладающих неодинаковым сродством к промоторам разных генов. В смене σ -субчастиц РНК-полимеразы заключается один из механизмов регуляции синтеза разных белков.

Типичный промотор прокариот имеет три основных компонента: точку старта транскрипции, выше нее, примерно на 10 нуклеотидов располагается домен Прибнова ТАТААТ, и в положении -35 вторая консервативная последовательность ТГАЦ (рис. 10 а,б).

Рис. 10. Элементы организации транскрипции у прокариот (а, б) и эукариот (в): а – единица транскрипции, содержащая различные элементы гена; б – схема наиболее типичного промотора прокариот, имеющего три основных компонента: консервативные последовательности нуклеотидов в положениях -10 и -35, то есть на 10 и 35 нуклеотидов выше точки старта транскрипции, и точку старта транскрипции; в – схема расположения некоторых функциональных участков в молекуле мРНК эукариот. КЭП – структура, присоединенная с 5’ - конца мРНК после транскрипции гена; 5’- и 3’-НТО – нетранслируемые области соответственно на 5’- и 3’-концах мРНК; поли(А) – полиаденилированный 3’-конец мРНК.

Промотор РНК полимеразы II эукариот имеет большую протяженность и более сложное строение. ТАТА-бокс (первый промоторный элемент) отделен от стартовой точки транскрипции приблизительно на 25 пар нуклеотидов, а вторая промоторная последовательность – СААТ-бокс – примерно на 40 (иногда до 120) пар от него. В промоторе содержатся и другие регуляторные участки, с которыми взаимодействуют разнообразные регуляторные факторы.

РНК-полимераза II у эукариот не может самостоятельно инициировать транскрипцию. Для ее активирования необходимо большое число белков, называемых общими факторами транскрипции. Прежде чем начнется транскрипция, они должны объединиться в комплекс. Сборка начинается на ТАТА - домене промотора. В присутствии источника энергии – АТФ один из белков фосфорилирует РНК-полимеразу П, в результате чего ее молекула изменяет конформацию и становится готовой к транскрипции. В регуляции активности РНК-полимеразы П принимают участие как факторы транскрипции, так и многочисленные регуляторные белки (рис. 11).

Рис. 11. Схема организации контролирующего района типичного гена эукариот, состоящего из регуляторных последовательностей и промотора.

Свою сложную специфическую структуру мРНК приобретают уже после транскрипции в результате процессинга.

Рис. 12. Процесс передачи информации от ДНК до белка, кодируемого расщепленным геном

Кэп обеспечивает: 1. инициацию трансляции, так как только в его присутствии рибосома распознает инициирующие кодоны мРНК − АУГ, ГУГ; 2.защиту мРНК от нуклеаз клетки, удлиняя тем самым время ее жизни; 3. работу ферментативной системы, проводящей сплайсинг.

У большинства транскриптов 3’-конец тоже подвергается модификации, при которой специальным ферментом наращивается поли-(А)-«хвост», состоящий из 100 - 200 остатков адениловой кислоты. Поли-(А)- последовательность облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме.

Важнейшее событие процессинга − сплайсинг − это соединение конец в конец экзонов и удаление интронов с образованием зрелых мРНК. Он протекает при участии малых ядерных РНП (мяРНП). Малые ядерные РНК (мяРНК) связываются с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров, образуют мяРНП. Последние взаимодействуют с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта, образуя сплайсосому. Ее каталитическая активность обусловлена РНК-составляющими (такие РНК называются рибозимами). На концах интронов имеются специфические последовательности нуклеотидов – сайты сплайсинга, которые обеспечивают точное удаление интронов из молекулы пре-мРНК (на 5’ − АГГУ, на З' − ГАГГ ). На первой стадии одни мяРНП связываются с сайтами сплайсинга, затем к ним присоединяются другие мяРНП – формируется сплайсосома. При этом концы экзонов сближаются и соединяются, а интроны удаляются (рис. 13). Так образуются «зрелые» мРНК, которые служат после выхода в цитоплазму матрицами для синтеза белков в процессе трансляции.

Рис.13. Сплайсинг РНК. В процессе сплайсинга принимают участие различные мяРНП, которые формируют сплайсосому. мяРНП, взаимодействуя с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта. Каталитическая функция сплайсосом обусловлена РНК-составляющими; такие РНК называют рибозимами.

Начало считывания мРНК находится несколько отступя от начала цени мРНК, и рибосома должна сесть непосредственно на участок, содержащий инициирующий кодон АУГ. Малая субчастица рибосомы должна соединиться с мРНК таким образом, чтобы стартовый кодон АУГ располагался в области субчастицы, соответствующей П-центру. Соединиться со стартовым кодоном и занять место в недостроенном П-центре может только инициирующая тРНК, несущая аминокислоту метионин. После этого присоединяется большая субчастица рибосомы, и формируются П- и А-центры. К концу фазы инициации полная рибосома связана с мРНК, в П-центре стоит метионил-тРНК, в А-участке стоит второй кодон мРНК, остальная часть его свободна.

Прокариоты и эукариоты используют два разные пути к инициирующему кодону.

У прокариот происходит внутренняя инициация, когда малая рибосомная субчастица связывается непосредственно с инициирующим кодоном мРНК, независимо от его удаленности от начала кодирующей последовательности. Если цепь мРНК содержит несколько кодирующих областей для различных белков (полигенная мРНК), то этот способ обеспечит инициацию трансляции сразу нескольких белков независимо друг от друга. Эукариоты могут использовать путь внутренней трансляции в некоторых специальных случаях: например, когда мРНК кодирует несколько регуляторных белков, необходимых для эмбрионального развития.

У эукариот малая рибосомная субчастица, как правило, сначала присоединяется на 5'-конец мРНК, а затем движется вдоль цепи и сканирует (просматривает) ее, пока не встретит инициирующий кодон. Этот способ получил название терминальной инициации. Для осуществления этого пути эукариотическая клетка обладает набором специальных белков − факторов инициации, которые служат для определения рибосомной частицей 5'-конца мРНК и ее дальнейшего движения (рис.14).

Рис. 14. Схематическое представление двух способов выхода рибосомной частицы (малой рибосомной субчастицы) на стартовую позицию трансляции мРНК: способ терминальной инициации, свойственной эукариотам (вверху), и способ внутренней инициации, используемый в основном прокариотами (внизу)

Рис. 15. Образование инициирующего комплекса в ходе синтеза белка у эукариот. Мет-тРНК_i^Мет объединяется с малой субъединицей рибосомы в форме тройного комплекса: тРНК^Мет, elF-2 и ГТФ. Образовавшийся более сложный четырехкомпонентный комплекс присоединяется к 5’-концу мРНК с помощью нескольких дополнительных факторов, и малая субъединица начинает скользить по мРНК до тех пор, пока антикодон тРНК^Мет не свяжется с инициирующим кодоном AUG. При этом в комплексе происходит изменение состава инициирующих факторов, и ускоряется присоединение 60S субъединицы рибосомы, сопровождающееся гидролизом ГТФ. тРНК_i^Мет занимает на рибосоме Р-центр.

Далее начинается самый продолжительный этап белкового синтеза – элонгация. В ходе элонгации рибосома с помощью транспортных РНК «читает» кодоны мРНК, наращивая полипептидную цепочку за счет последовательного присоединения аминокислот. Элонгация начинается от момента образования первые пептидной связи и заканчивается после включения в полипептидную цепь последней аминокислоты.

Функция рибосомы заключается в том, чтобы удерживать в нужном положении мРНК, тРНК, аминокислотные остатки и белковые факторы элонгации до тех пор, пока между соседними аминокислотами не образуется пептидная связь. Элонгация − это повторяющийся процесс. Присоединение каждого аминокислотного остатка к растущей полипептидной цепи происходит в 3 стадии:

1. связывание с А-центром рибосомы аа-тРНК, соответствующей очередному кодону;

2. образование новой пептидной связи за счет присоединения пептида, находящегося в Р-центре, к аминогруппе аа-тРНК, находящейся в А-центре;

3. перемещение пептидил- тРНК из А-центра в Р-центр в результате передвижения рибосомы по мРНК на один кодон.

Так, по окончании инициации в Р-центре стоит метионил-тРНК, а в А-центре очередной кодон. К нему присоединяется аминоацил-тРНК, антикодон которой комплементарен кодону и взаимодействует с ним. Благодаря особенностям трехмерной организации тРНК вторая аминокислота встает в А-центр, но вблизи от ранее включенной аминокислоты метионина, находящейся в Р-центре. Сразу после этого протекает реакция образования пептидной связи (реакция транспептидации), которую катализирует 28S рРНК, входяшая в состав большой субъединицы рибосомы. Таким образом, 28S рРНК является рибозимом.

Метионин теряет связь со своей тРНК. В Р-центре остается "пустая", не нагруженная тРНК, которая уходит в цитоплазму. Рибосома перемещается вдоль цепи мРНК на один кодон. Нагруженная полипептидной цепочкой пептидил-тРНК переходит из А-центра в Р-центр. В А-центре устанавливается следующий кодон.

Цикл повторяется столько раз, сколько аминокислотных остатков содержится в полипептидной цепи. В процессе участвуют белковые факторы элонгации:EF1 необходим для связывания аа-тРНК в А-центре, а ЕF2 - для перемещения рибосомы по мРНК к 3’-концу за счет энергии гидролиза ГТФ. На присоединение каждой аминокислоты затрачивается энергия двух молекул ГТФ, которые гидролизуются до ГДФ и Ф_н. Растущая полипептидная цепь все время остается связанной с тРНК, соответствующей последней включенной аминокислоте (рис. 16).

Для терминации (окончания) синтеза полипептидной цепи необходим специальный сигнал в мРНК - терминирушжй кодон (УАГ, УАА или УГА ). С кодоном терминации, стоящим в А-центре, взаимодействуют особые белки − факторы терминации – рилизинг-факторы (от англ. release – высвобождать). С кодоном терминации связывается RF1 (или RF2), а RF3 взаимодействует с пептидилтрансферазным центром. В результате этого последний катализирует реакцию взаимодействия пептидил-тРНК с молекулой воды. Связь полипептида с конечной тРНК гидролизуется, полипептид освобождается в виде готового белка. тРНК выходит из Р-центра, а рибосома диссоциирует на субчастицы, готовые к синтезу новой полипептидной цепи (рис.17).

В случае полигенной мРНК малая субчастица может задерживаться на мРНК, скользить по ней и инициировать трансляцию следующей полипептиднои цепи.

Несмотря на большую сложность, биосинтез белковых: молекул протекает с чрезвычайно высокой скоростью: так, полипептидная цепь из 100 аминокислотных остатков синтезируется за 5 с. Скорость биосинтеза может увеличиваться в несколько раз за счет того, что на одной мРНК могут вести синтез одновременно несколько рибосом. Группы рибосом, соединенных друг с другом одной молекулой мРНК, называют полирибосомами или полисомами.

Таким образом, матричная природа процесса трансляции проявляется в том, что включение аминокислот в полипептидную цепь однозначно определяется порядком расположения кодонов вдоль цепи мРНК. Субъединиы рибосом выполняют в процессе трансляции разные функции: малая субъединица присоединяет мРНК и декодирует информацию с помощью тРНК, а большая отвечает за катализ образования пептидных связей.

У различных белков процессинг протекает по-разному. При этом может происходить отщепление ферментами "лишних" аминокислотных остатков (например, инициирующих), введение в определенные аминокислотные остатки фосфатных, метильных, карбоксильных, олигосахаридных или простетических групп.

Например, гормоны поджелудочной железы инсулин и глюкагон синтезируются в виде неактивных предшественников. Сначала из них удаляются сигнальные пептиды, в результате чего образуются прогормоны. Затем уже в секреторных гранулах прогормоны превращаются в активные гормоны.

Новообразованные белки направляются в ту часть клетки, где они выполняют свои функции: некоторые поступают просто в клеточный цитозолъ, другие − к различным клеточным органеллам, третьи секретируются из клетки, наконец, некоторые встраиваются в ту или иную клеточную мембрану, где работают в качестве ферментов или переносчиков. Роль сигналов, направляющих белки к месту их функционирования, выполняют лидерные последовательности, расположенные в начале полипептидной цепи. Они образуются в процессе биосинтеза белка на рибосоме первыми и узнаются особыми участками внешней поверхности мембран нередко даже раньше, чем рибосома завершит синтез белка.

Рибосомы, связанные с шероховатой эндоплазматической сетью, участвуют в биосинтезе белков, которые либо временно остаются в клетке, либо сразу же выводятся из нее. Белки проталкиваются внутрь цистерн, откуда в конечном итоге выводятся во внеклеточное пространство.
9. Регуляция биосинтеза белка
В каждой клетке и живом организме в целом синтезируются специфические белки и с неодинаковой скоростью. Благодаря регуляции синтеза в конкретных условиях среды образуется лишь необходимое число молекул данного белка.

Все соматические клетки многоклеточных организмов содержат в ДНК одинаковую генетическую информацию, однако отличаются друг от друга по составу белков. Так, клетки эритроцитов содержат большое количество гемоглобина, кожи − коллагена, скелетных мышц − актина и миозина, клетки печени содержат ферменты синтеза мочевины, которые отсутствуют у всех других клеток. Таким образом, в клетках каждого типа экспрессируется только часть структурных генов.

Исследования показали, что большая часть генома находится в неактивном, репрессированном, состоянии. Спектр функционирующих генов зависит от типа клетки, периода ее жизненного цикла, стадии индивидуального развития организма. У большинства организмов активно транскрибируются только 2 - 10 % генов.

Гены, которые транскрибируются постоянно, не подчиняясь каким-либо регуляторным воздействиям, называются конститутивными. Обычно это гены, обеспечивающие синтез белков общего назначения (белки рибосом, гистоны, тубулины и др.), а также тРНК и рРНК.

Включение и выключение других генов зависит от различных метаболитов, эти гены называются регулируемыми.

Наиболее эффективна регуляция на уровне инициации транскрипции. В ДНК имеется несколько областей, которые участвуют в регуляции действия генов. Промотор - участок ДНК, с которым может связываться РНК-полимераза, инициируя тем самым транскрипцию. Оператор - область ДНК, которая взаимодействует с белком-репрессором, благодаря чему регулируется экспрессия гена или группы генов. Регуляция осуществляется или путем стимуляции, или путем запрещения соединения РНК-полимеразы с промотором гена с помощью белков-регуляторов. За синтез этих белков отвечают гены-ретуляторы. Ген-регулятор может находиться на некотором расстоянии от тех генов, на которые он оказывает влияние. Белок-регулятор, включающий транскрипцию данного гена, называется активатором, а выключающий - репрессором. В регуляции транскрипции могут принимать участие вещества небелковой природы – эффекторы. Взаимодействуя с белками-регуляторами, они изменяют их способность соединяться с нуклеотидными последовательностями. Если в результате такого взаимодействия транскрипция запускается, то вещество называют индуктором, а если прекращается, то корепрессором, поскольку оно переводит неактивный репрессор в активную форму.

Если белок-регулятор взаимодействует с оператором, занимающим часть промотора или расположенным между ним и структурной частью гена, то это не дает возможности РНК-полимеразе II соединиться с промотором и осуществить транскрипцию (репрессия синтеза). В этом случае осуществляется негативный контроль экспрессии гена со стороны гена-регулятора, белок-регулятор называется репрессором.

Если промотор обладает слабой способностью соединяться с РНК-полимеразой, а ему предшествует область, узнаваемая белком-регулятором, то присоединение последнего непосредственно перед промотором к молекуле ДНК облегчает связывание РНК-полимеразы с промотором, вслед за чем следует транскрипция. Такие белки называются активаторами, а контроль экспрессии гена - позитивным.

Впервые изучение регуляции генной активности было проведено на бактериях французскими микробиологами Ф.Жакобом и Ж.Моно (1961), результатом чего было создание модели оперона. Оперон - это последовательность структурных генов, определяющих синтез группы белков, участвующих в одной метаболической цепи, имеющих общий промотор и оператор. Транскрипция мРНК со всех структурных генов оперона, в виде одного транскрипта, на котором в дальнейшем синтезируются отдельные пептиды, является особенностью бактерий.

В опытах Жакоба и Моно была использована кишечная палочка (Е.соli). Она быстро растет на культуральной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. После переноса клеток на среду, содержащую вместо глюкозы лактозу, рост сначала замедляется, а затем возобновляется с высокой скоростью. При этом бактерии синтезируют три необходимых для усвоения лактозы белка: ферменты β-галактозидазу, гидролизующую лактозу до глюкозы и. галактозы, и лактозопермеазу, способствующую быстрому поглощению клеткой лактозы из среды, а также белок А (тиогалактозидазу).Все они закодированы в одном лактозном опероне.

Было показано, что при отсутствии в среде сахара лактозы ген-регулятор синтезирует активный белок-репрессор, который связывается с оператором, препятствуя соединению РНК-полимеразы с промотором, и препятствует процессу транскрипции. Синтез ферментов не идет из-за отсутствия, матрицы.

При добавлении в среду лактозы (индуктора) она соединяется с другим специфическим участком репрессора (центром связывания индуктора), инактивирует его, что приводит к снижению сродства репрессора к операторному участку ДНК и освобождению последнего. Как только индуктор-репрессорный комплекс покидает ДНК, РНК-полимераза начинает транскрипцию, что приводит к синтезу β-галактозидазы и других белков, участвующих в усвоении лактозы. Так происходит индукция синтеза ферментов, оперон называют индуцибельным (рис. 18).

Рис 18. Схематическое изображение lac-оперона. Три структурных lac-гена z, y и a расположены рядом. Перед ними находятся два регуляторных участка – р (промотор) и о (оператор).

Некоторые опероны, отвечающие за использование углеводов (катаболизм), содержат кроме оператора еще один регуляторный участок, составляющий часть промотора и предназначенный для связывания особого регуляторного белка. Например, в лактозном опероне имеется участок, препятствующий использованию лактозы в том случае, если в питательной среде присутствует глюкоза. Подавление глюкозой синтеза белков лактозного оперона - это один из примеров катаболитной репрессии.

Промотор лактозного оперона состоит из двух участков: к оператору примыкает "вход для РНК-полимеразы", в котором происходит первоначальное связывание этого фермента; вторая часть промотора представляет собой участок связывания 6елка, активирующего катаболитный ген (БАК или САР), связанного с цАМФ (циклическим АМФ). РНК-полимераза может войти в участок связывания лишь при условии, если САР-участок занят. Это происходит в том случае, если в среде глюкозы нет, в среде нарастает количество цАМФ («сигнал голода») и образуется комплекс между цАМФ и САР-белком. Комплекс соединяется со вторым участком промотора и дает возможность РНК-полимеразе попасть в участок первоначального связывания. Если в среде присутствует лактоза, то оператор открыт, и начинается транскрипция лактозного оперона.

Если же в среде присутствует глюкоза, то концентрация цАМФ в клетке резко понижается, и не образуется комплекса цАМФ с САР-белком. Тогда САР-участок свободен, и РНК-полимераза не может связаться с промотором и начать транскрипцию, синтез белков лактозного оперона выключен (рис.19).

Рис. 19. А. Регуляторные участки lac-оперона. САР-участок промотора способен связывать САР лишь в том случае, если он находится в комплексе с сАМР. РНК-полимераза может попасть в участок первоначального связывания только при условии, если САР-участок занят. Б. Три структурных гена z, y и a lac-оперона транскрибируются при условии, что в среде нет глюкозы, а присутствует лактоза. В этом случае оператор свободен от репрессора и комплекс САР-сАМР соединяется с промотором, позволяя РНК-полимеразе попасть в участок первоначального связывания, «спуститься» к инициирующему кодону и начать транскрибировать три структурных гена. В. Если глюкозы в среде много, то сАМР не образуется и САР поэтому не в состоянии связаться с промотором. В этих условиях РНК-полимераза не может получить доступ к промотору и lac-гены не транскрибируются.

Таким образом, лактозный оперон находится как под негативным (0-участок), так и под позитивным (р-участок) контролем.

Наряду с индуцибелъными, у бактерий изучены также репрессируемые ферменты, биосинтез которых подавляется продуктом катализируемой ими реакции. Действие этих оперонов также контролируется белками-репрессорами, но они синтезируются изначально в неактивной форме и активируются в результате присоединения к ним конечного продукта цепи реакций, который играет роль корепрессора. Активный репрессор связывается с оператором, что приводит к прекращению транскрипции и синтеза белка и соответственно к торможению всей цепи реакций. Примером могут служить опероны, кодирующие структуру ферментов, катализирущих реакции синтеза аминокислот, азотистых оснований и т.п.

У бактерий существуют также механизмы, позволяющие регулировать скорость синтеза белка, например, ее замедлять. Таким образом, они обладают тончайшими механизмами регуляции синтеза ферментов, что позволяет им приспосабливать свой метаболизм к изменяющимся условиям среды в соответствии с принципом максимальной экономии.
9.2. Особенности регуляции белкового синтеза в эукариотических клетках.

Геномы эукариотических клеток отличаются огромными размерами и большой сложностью, поэтому механизмы регуляции биосинтеза белков у них разнообразны. Регуляция осуществляется на разных уровнях. Так; стойкую репрессию генов вызывает компактная упаковка хроматина, включая взаимодействие с гистонами, образование нуклеосом и элементарных фибрилл. В гетерохроматине для транскрипции доступно менее 1% генов, в эухроматине, имеющем более рыхлую укладку − значительно большее. В разных типах клеток в области эухроматина попадают неодинаковые гены, что обеспечивает стабильную репрессию одних ге­нов и дерепрессию других на протяжении всей жизни клетки.

Изменение количества генных продуктов - белков в клетках позвоночных животных может происходить вследствие амплификации (то есть увеличения числа генов). Например, у человека 20% генома состоит из генов, кодирующих различные виды РНК. Количество генов может увеличиваться в ответ на воздействие вредных экологических факторов. Например, повышение концентрации тяжелых металлов в крови приводит к увеличению числа генов белка металлотионеина, обладающего свойством связывать тяжелые металлы и защищать таким образом клетки от их воздействия

Изменение спектра синтезируемых клеткой белков происходит в результате перестройки генов - генетической рекомбинации, которая включает в себя перемещение генов между хромосомами или внутри хромосом, а также объединение генов с образованием измененных хромосом, которые способны к репликации и транскрипции. Подобные разнообразные изменения в структуре геномов проявляются у В-лимфоцитов, кодирующих разнообразные иммуноглобулины (антитела).

Но большинство генов эукариот подвергаются, подобно прокариотическим генам, адаптивной регуляции - то есть индукции и репрессии, которые осуществляются на уровне транскрипции. Вследствие огромной протяженности и сложности эукариотической ДНК специфические регуляторные участки ДНК и взаимодействующие с ними белки-регуляторы весьма многочисленны. Выявлено более 100 различных белков, способных взаимодействовать с регуляторными последовательностями ДНК и тем самым влиять на сборку транскрипционного комплекса и скорость транскрипции. Эти белки содержат ДНК-связывающие домены, отвечавшие за узнавание специфических участков в молекуле ДНК, а также домены, активирующие транскрипцию. Последние связываются с транскрипционными факторами, либо с РНК-полимеразой. Регуляторные белки могут иметь в своем составе антирепрессорные домены, которые взаимодействуют с гистонами нуклеосом, освобождая от них участки ДНК. Эти белки могут содержать в себе также домены, связывающие лиганды - индукторы транскрипции (стероидные гормоны, гормоны щитовидной железы, производные витаминов). После связывания лиганда конформация белка изменяется, и он образует участок, узнающий в регуляторной зоне ДНК специфическую последовательность и индуцирующий транскрипцию определенного гена.

Важную роль в регуляции активности генов играют участки ДНК, располагающиеся в 1000 и более пар оснований от промотора. Энхансеры – участки ДНК размером 10 - 20 пар оснований, присоединение к которым регуляторных белков увеличивает скорость транскрипции ( от enhance – усиливать).

Рис. 20. Адаптивная регуляция транскрипции у эукариот. Промоторы эукариотических генов находятся под контролем большого числа регуляторных участков на молекуле ДНК: ТАТА-, СААТ-, GC-последовательностей, энхансеров, сайленсеров − последовательностей, к которым присоединяются комплексы белков с различными лигандами (цАМФ, стероидными гормонами, метаболитами, ионами металлов и т. д.).

Во всех генах имеются участки, необходимые для установления контакта РНК-полимеразы с ДНК, прочного связывания и начала транскрипции. Прежде, чем транскрипция начинается, происходит формирование комплекса РНК-полимеразы − и общих факторов транскрипции. В состав комплекса входят также белки, которые связываются с большой субъединицей РНК-полимеразы, помогают ей разрушить нуклеосомы и декомпактизировать молекулу ДНК. Всего в состав собранного на промоторе транскрипционного комплекса входит до 50 белков, комплекс называется транскриптосома.

Регуляция транскрипции осуществляется как на уровне сборки транскрипционного комплекса, так и после его сборки с помощью регуляторных белков. Связываясь с регуляторными последовательностями ДНК − энхансерами или сайленсерами, белки непосредственно взаимодействуют либо с молекулой РНК-полимеразы, либо с одним каким-либо фактором транскрипции, либо с другим белком, в результате чего включаются или выключаются гены, изменяется скорость транскрипции (рис.21). Существуют десятки различных регуляторных белков, которые связываются с сайтами регуляторной зоны. Их наборы отличаются в разных клетках и у разных генов. С их помощью каждый ген специфически выключается и включается.

Рис. 21. Распределение белков в типичном промоторе эукариот. Активаторы АR, связанные с энхансерными элементами в молекуле ДНК, стимулируют транскрипцию за счет белок-белковых взаимодействий между активирующими доменами (изогнутые концы) активаторов, РНК-полимеразой и общими факторами транскрипции. GAL11, SIN4 и RGR1 – компненты РНК-полимеразного комплекса, их функции до конца не выяснены. Длинный концевой хвост РНК-полимеразы II изображен на рис. в нефосфорилированном (свободном) состоянии; D, A, B, E, F и H –общие факторы транскрипции. SWT, SNF, SRB − белки, которые помогают РНК-полимеразе разрушить нуклеосомы и декомпактизировать молекулу ДНК.

Рис.22. Регуляция экспрессии многих генов эукариот одним белком-регулятором

Пример такой регуляции − гены, чувствительные к стероидным гормонам, гены бел­ков теплового шока и др.

Регуляция на уровне транскрипции наиболее экономична, но она осуществляется недостаточно быстро. Поэтому важное значение имеет регуляция на других этапах реализации генетической информации.

Важное значение в обеспечении разнообразия белков имеет альтернативный сплайсинг. На многих эукариотических генах, имеющих полиэкзонное.строение, после транскрипции и процессинга образуются несколько вариантов зрелой мРНК, когда зкзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в другом. Это приводит к образованию разных мРНК и соответственно разных белков с одного первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы в ходе транскрипции гена гормона кальцитонина образуется первичный транскрипт мРНК, который имеет в своем составе шесть экзонов. мРНК кальцитонина образуется путем сплайсинга первых четырех зкзонов. Этот же первичный транскрипт в клетках головного мозга в ходе альтернативного сплайсинга образует другую мРНК, кодирующую белок, не обладающий гормональной активностью.

На состав белков клетки оказывает влияние также неодина­ковая стабильность мРНК. Время жизни эукариотических мРНК составляет от нескольких часов до нескольких дней. Стоящий на З'-конце фрагмент поли-(А) увеличивает продолжительность жизни молекул мРНК и соответственно количество белка.

Регуляция синтеза белка осуществляется и на уровне трансляции. Разные мРНК имеют неодинаковое сродство к рибосомным субчастицам, поэтому в полирибосоме содержится много или мало рибосом. Так определяется соотношение белков в клетке. Наконец, может происходить подавление инициации трансля­ции всех мРНК клетки. Например, это может происходить при действии теплового шока, стрессах, недостатке железа,вирусной инфекции и т.п. Стрессовый фактор индуцирует фосфорилирование второго фактора инициации, тем самым инактивирует его и, следовательно, трансляцию.
Заключение
Все многоклеточные организмы, в том числе и человек, построены из клеток разнообразных типов. Различия между ними обусловлены главным образом тем, что они синтезируют свой набор белков. В то же время в ядрах всех, за небольшим исключением, клеток содержится полный набор последовательностей ДНК, характерный для вида. Следовательно, набор специфических белков обусловлен изменением набора экспрессируемых генов. Спектр функционирующих генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от периода ее жизненного цикла, от стадии индивидуального развития организма. Контроль синтеза специфических белков осуществляется на всех уровнях экспрессии генетической информации: транскрипции, трансляции, транспорта, процессинга, посттрансляционной модификации и других.

Все механизмы регуляции биосинтеза белка лежат в основе дифференцировки клеток.

1. 
   Биология. Учебник для медиц. специальн. вузов. Книга I. Под ред. В.Н. Ярыгина. М.:ВШ. − 2003. 430 с.
   
2. 
   Биохимия. Учебник для вузов. Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-МЕД. − 2003. 784 с.: (Серия «XXI век»).
   
3. 
   Грин Н., Стаут У., Тейлр Д. Биология. М.: Мир, 1990. т. 1-3.
   
4. 
   Дмитриев Р.И. и др. Тканеспецифичность продуктов альтернативного сплайсинга мРНК мыши // Биоорганическая химия, 2005. Т. 31, №4. С. 363-371.
   
5. 
   Жимулев И.Ф. Современные представления о структуре гена у эукариот // Соровский образовательный журнал, 2000. Т. 6, №7. С. 17-24.
   
6. 
   Основы биохимии. Под ред. А.А. Анисимова. М.: ВШ, 1986. 550 с.
   
7. 
   Спирин А.С. Мир РНК и его эволюция // Молекулярная биология, 2005. Т. 39, №4. С. 550-556.