Еуразиялық экономикалық комиссия
Иммуногендік әдістерінің және оны бағалаудың
жүктеу/скачать 0.89 Mb.
|
| Иммуногендік әдістерінің және оны бағалаудың
сипаттамасына қойылатын ТАЛАПТАР І. Антиденелерді сандық тұрғыдан айқындау түрлері 1. Скрининг әдістері Үлгілердің салыстырмалы түрде көп санына қатысты скринингтің қажеттілігі автоматтандырылу дәрежесі жоғары, өнімділігі мол талдамалық әдістемелерді пайдалануды талап етеді. Бұл әдістерге иммунологиялық әдістер, сондай-ақ радиоиммунопреципитация мен үстіртін плазмалық резонанс жатады. Олардың барлығы антигендер мен антиденелердің арасындағы өзара әрекеттесуді (байланысуды) анықтауға бағытталған, бірақ әртүрлі ғылыми (техникалық) принциптерге негізделген. Иммунологиялық талдау түрлері әдістемелердің үлкен тобын білдіреді және әрқилы табу тәсілдері мен жүйелеріне негізделеді. Оларға тікелей байланысуды анықтайтын талдамалық әдістемелер, байланыстырушы әдістемелер, қармап алу әдістемелері (сэндвич-талдау) және радиолигандтық, ферменттік, флюоресценттік, хемилюминесценттік және электр-химиялық люминесценттік табу жүйелеріне негізделген бәсекелес иммунологиялық талдаулар жатады 2. Антиденелердің бар екенін растайтын әдістер Бұл мақсаттар үшін скрининг әдістерімен салыстырғанда көлемі шағын әртүрлі талдамалық әдістемелерді, талдануға тиіс үлгілер санын пайдалануға болады, бұл жерде жоғары өнімділік үлкен рөл атқармайды. Өзіндік ерекшелікті растау мақсатында оны бағалауға мүмкіндік беретін әдістемелерді қосу қажет. Мысалы, байланыстыру әдістемелерімен жұмыс басталғанға дейін үлгіге антигеннің басы артық санын қосу антиденелердің абсорбциясына және соның салдарынан шынайы серопозитивті үлгілерден берілетін оң сигналдар жиілігінің азаюына алып келеді. Кейбір талдамалық әдістемелерде иммуноглобулиндерді талданатын зат ретінде анықтау, мысалы антииммуноглобулиндік реактивтерді пайдалану жолымен анықтау шынайы серопозитивті үлгілерді табуға көмектесе алады. Кейбір қиын жағдайларда скрининг әдістерінде пайдаланылатыннан өзгеше ғылыми (техникалық) принциптерге негізделген талдамалық әдістемелерді пайдалану ұсынылады. Бұған қоса, пайдаланылатын әдістемелер сипаттамаларының әрқилылығын, мысалы, олардың әрқилы сезімталдығын ескеру керек. 3. Антиденелердің өзіндік ерекшелігін межелеу әдістері Анықталған антиденелердің өзіндік ерекшелігін саралау үшін иммуноблоттинг және радиоиммунопреципитация сияқты талдамалық иммунологиялық әдістер пайдаланылады. 4. Бейтараптандырушы белсенділікті айқындау әдістері Антиденелердің бейтараптандырушы белсенділігін айқындау үшін дәрілік препараттың қасиеттеріне қарай сандық тұрғыдан айқындаудың функционалдық әдістерін қоса алғанда, биологиялық әдістерін пайдалануға болады. Әдетте, талдау үшін биологиялық дәрілік препараттың белгілі бір концентрациясы таңдап алынады, ал оның араластырылымы антиденелердің концентрациясы төмендеген кезде ингибирлеуші әрекетті бағалау үшін пайдаланылады. Бұл бейтараптандырушы дозаны айқындауға және әрбір үлгі үшін антиденелердің бейтараптандырушы қабілетін (титрін) есептеуге мүмкіндік береді. 5. Жасушалық иммундық жауапты бағалау әдістері Биологиялық дәрілік препараттан туындайтын жасушалық иммундық жауапты бағалау стратегиясы, әдетте, гуморалдық жауапты бағалауға қарағанда күрделірек. Егер мұндай сынақтар қажет етілетін болса, оларды арнайы әзірлеу және әрбір нақты жағдай үшін әдісті жеке-дара таңдау талап етіледі. Көпшілік жағдайларда ІgG қатысатын тиімді жауаптың дамуы антигендік өзіндік ерекшелікті Т-хелперлердің қатысуына байланысты болады. Т-жасушалардың ынталандырылуын (пролиферациясын) айқындау әдістері, сондай-ақ цитокиндердің (мысалы, IL-2, IL-4, ИФН-гамма) түзілуін (босатылуын) бағалау әдістері жасушалық иммундық жауапты табу (бағалау) үшін пайдаланылатын сандық тұрғыдан айқындау әдістерінің мысалдары болып табылады. Бұл Т-жасушаларды пайдалануды, кейде Т-жасушаларды басқа популяциялардың жасушаларымен, мысалы, дендритті жасушалармен бірге өсіруді көздейді. Бұл мақсаттар үшін әдетте иммуноферменттік дақтар әдісі (Elispot) мен ағымды цитометрия пайдаланылады. Кейбір жағдайларда цитоуыққтылықты жасушалық-жанама талдау пайдаланылады. Кейде жасушалық иммундық жауапты бағалауды қамтитын неғұрлым егжей-тегжейлі зерттеулерді пайдалану қажет. Жадының В-жасушаларын (кейбір жағдайларда жадының Т-жасушаларын) зерделеу иммундық жауаптың табиғаты туралы пайдалы ақпарат беруі мүмкін, зерттеу нәтижелерінің де зерттелетін дәрілік препараттың әлеуетті иммуногендігіне қатысты болжамдық құндылығы болуы мүмкін. Осы мақсатта пептидтерді немесе ақуыздарды (талдаудың түріне және оның мақсаттарына қарай) пайдалана отырып зерттеу жүргізілуі және иммуноферменттік дақтар әдісі пайдаланылуы мүмкін. Басқа жағдайларда жасушалық иммунитетті анағұрлым күрделі зерттеу, мысалы, реттеушілік Т-жасушаларды зерделеу пайдалы болуы мүмкін. Осындай зерттеулерге деген қажеттілік мақсаттар мен міндеттерге қарай жеке-дара қарастырылуға тиіс. ІІ. Талдамалық әдістердің сипаттамасы Сынақтардың нәтижелерін таңдауды, оңтайландыру мен талдауды алға қойылған міндеттерге сәйкес орындау керек. Әдістердің сипаттамаларына берілетін маңыз бен қойылатын талаптар (олардың кейбірінің тізбесі жоғарыда «Скрининг әдістері» деген кіші бөлімде келтірілген) пайдаланылатын әдістемеге байланысты болады. Мысалы, егер әдісті белгілі бір биологиялық дәрілік препаратпен емдеуге жауап ретінде түзілген антиденелердің қамтылуын айқындау үшін пайдаланбаса, оның жоғары сезімталдығына қажеттілік болмауы мүмкін. Осындай антиденелерді айқындау үшін, әсіресе, егер әдістің сезімталдығына басқа маңызды сипаттамаларға, мысалы өзіндік ерекшелікке, орнықтылыққа залал келтіріле отырып қол жеткізілсе, сезімталдығы жоғары әдістерді әзірлеу және пайдалану орынсыз болып табылады. Барлық талаптарды қанағаттандыратын ең қарапайым әдісті таңдау, әсіресе, үлкен өнімділіктің маңызы жоғары болған кезде, мысалы, скрининг кезінде қисынды тәсіл болып табылады. Дегенмен оның иммуногендікті бағалаудың басқа сатыларына теріс әсер етпеуін мұқият қадағалап отыру керек. Мысалы, планшет ойықтарының беткі жағына иммобилденген антигенмен жасалатын тікелей иммуноферментті талдау (ИФТ) сынақтың ең қарапайым түрін білдіреді, бірақ жалған жағымды нәтижелердің көп санымен сипатталады. Оның үстіне, бұл әдістерге аффиндігі төмен антиденелерді немесе олардың белгілі бір изотиптерін немесе кіші сыныптарын қамтитын үлгілерін пайдаланған кезде жалған теріс нәтижелердің жиілігі жоғары болуы тән. Жоғарыда аталған проблемаларды болдырмау үшін талдаудың неғұрлым лайықты түрін, мысалы, «байланыстырушы» әдістерді, электрхемилюминесценцияны немесе үстіртін плазмалық резонансты таңдау қажет. Скринингтік әдістің эпитоптардың бүркемеленуінен туындайтын жалған теріс нәтижелері кездесуі мүмкін. Оны болдырмау үшін тиісті стратегияны ұстану, мысалы, орындалуы кезінде белгілі бір эпитоптардың өзіндік ерекшелікті бүркемеленуі мүмкін болмайтын әдістерді пайдалану керек. ІІІ. Стандарттау, стандартты материалдар, өздерін жақсы танытқан бақылаулар және әдістемелерді валидациялау Әдістемелердің барлық түрлері үшін серопозитивті стандартты үлгілер (материалдар, бақылаулар) қажет. Олар әдістеменің әсерін растау және оны калибрлеу (межелеу) үшін пайдаланылады. Олар, мүмкіндігінше, ұзақ уақыт пайдалану үшін жеткілікті көлемде алынған антиденелердің қамтылуы жоғары адам қанының препараттары болып табылуға тиіс. Олардың қасиеттері жақсы сипатталуға тиіс; мұндай материалдарды сақтау тиісті жағдайларда (лайықты температураларда лиофилизат түрде немесе мұздатылған түрде) жүзеге асырылады. Сандық тұрғыдан айқындаудың биологиялық әдістеріне арналған, бейтараптандырушы белсенділікті айқындауға бағытталған стандартты препараттар жоғары бейтараптандырушы қабілетке ие болуға тиіс, бірақ валидация жүргізу үшін бейтараптандырушы қабілеті жоқ антидене препараттарының болуы қажет. Бірқатар жағдайларда қажетті стандартты препараттарды дайындау үшін қолдағы адам плазмасының саны жеткілікті болмай қалуы мүмкін. Бұл жағдайда үлгілерді біріктіру белгілі бір донордың ерекшеліктеріне орай проблемаларды болғызбауға мүмкіндік беретін ең үздік тәсіл болып табылады. Кейде адам плазмасының көлемі біріктіруге жетпейтінімен қоймай, ол тіпті, мысалы, әзірлеудің ерте сатысында болмай қалуы да мүмкін, мұндай жағдайларда жануарлардың плазмасын пайдалану бірден-бір ықтимал шешім болып табылады. Бұл ретте жануар түрін мұқият таңдау талап етіледі, ал мұндай плазманы қолдану адам қанынан алынған стандартты препараттармен салыстырғанда шектеулі сипатта болады. Мысалы, адамның иммуноглобулиндеріне антиденелерді пайдалануды қамтитын иммундық-химиялық талдаулар адамдық емес антиденелермен инкубация кезінде жалған нәтиже беруі мүмкін, ал кез келген зерттеулердің нәтижесі адам плазмасында қамтылған адам антиденелерін зерделеу кезінде алынған нәтижелерден ерекшеленуі мүмкін. Стандартты үлгілерде және сынамаларда қамтылған иммуноглобулиндердің құрылымының гетерогендігіне, өзіндік ерекшелікті және авидті екендігіне орай иммунологиялық талдау әдістерін калибрлеу (градуирлеу) қиын міндет болып табылады. Бұл сыналатын үлгілер мен стандартты материалдардың, әсіресе, массасы бойынша тікелей дұрыс салыстырылуының күрделілігін негіздейді және мүмкіндігін жоққа шығарады. Соның салдарынан мұндай талдау әдістерін калибрлеуді жақсы сипатталған, қабылдауға келетін, негізделген тәсілдерді пайдалана отырып жүзеге асыру қажет. Иммунологиялық талдау әдістерінің нәтижелерін титрдің мәнін стандартты есептеу процедураларына негізделген титр түрінде ұсыну тәсілдердің бірі бола алады. Сыналатын үлгілер мен оң бақылаудағы антиденелердің салыстырмалы концентрациясын есептеу басқа тәсіл болып табылады. Антиденелердің бейтараптандырушы қабілетін бағалау үшін пайдаланылатын биологиялық талдау әдістерін халықаралық стандартты үлгілер (стандартты препараттар) (бар болған кезде) көмегімен калибрлеу қажет. Бұл дәрілік препараттың (қан препаратының) биологиялық белсенділігінің ұғынықты бірліктеріндегі бейтараптандырушы белсенділікті білдіруге және талдамалық әдістемелерді валидациялау үшін қажетті ақпарат алуға мүмкіндік береді. Көрсетілген стандарттар қолжетімді болмаған кезде меншікті препараттарды әзірлеу қажет. Көпшілік жағдайларда үлгілердің бейтараптандырушы қабілетін олардың препараттың тұрақты биологиялық белсенділігін бейтараптандыруға қажетті көлемде, мысалы, плазманың миллилитрлері немесе биологиялық препараттың күні бұрын берілген биологиялық белсенділік бірліктері арқылы білдіру ұсынылады. Өзге жағдайларда препараттың биологиялық белсенділігін бейтараптандыру үшін қажетті үлгілердің (титрдің) араластырымын пайдалануға жол беріледі. Сондай-ақ құрамында антиденелердің әрқилы көлемін бар жинақ пен қасиеттері әртүрлі антиденелер бар жинақтың болуы табанды түрде ұсынылады, оларды талдамалық әдістемелердің сипаттамаларын белгілеу және валидациялау үшін пайдалануға болады және олар осы әдістердің функционалдығының көрсеткіштері ретінде қызмет ете алады. Олар мүмкіндігінше, құрамында антиденелер аз (анықтаудың төменгі шегіне жақын) 1 немесе одан да көп препаратты және авидтілігі төмен антиденелер препараттарын қамтуға тиіс. Талдамалық әдістеменің бастапқы параметрлерін айқындау, сипаттамаларды белгілеу мен валидациялау мақсатында теріс стандартты үлгілер мен олардың бақылаулары қажет. Дені сау субъектілердегі талдамалық әдістеменің бастапқы параметрлерін оның нәтижелерін осындай субъектілердің жеткілікті санынан алынған үлгілерді талдау кезінде айқындау және оларға статистикалық тұрғыдан сенімді бастапқы мәндерді алу мақсатында талдау жасау арқылы оңай анықтап алуға болады. Алайда бұл тәсіл пациенттерден алынған үлгілерді талдау кезінде талдамалық әдістеменің бастапқы параметрлерін сипаттауға мүмкіндік бермеуі мүмкін, сондықтан да мұндай параметрлерді пациенттерден емдеу басталғанға дейін алынған үлгілерді немесе басқа сәйкес келетін субъектілерден алынған үлгілерді пайдалана отырып, бөлек айқындауға тура келеді. Не болғанда да кейбір субъектілердің (пациенттердің) үлгілерінде емдеу басталғанға дейін түзілген антиденелер немесе елеулі жалған оң нәтижелер бере алатын басқа да заттар қамтылуы мүмкін, сондықтан да емдеу басталғаннан кейін алынған нәтижелерді дұрыс интерпретациялауды қамтамасыз ету мақсатында пациенттердің скринингі қажет. Талдауда пайдаланылып жүрген реактивтер, ең болмағанда маңызды реактивтер үшін талаптарды белгілеп, қолайлы өзіндік ерекшеліктерді іріктеу қажет. ІV. Нәтижелердің интерпретациясы Үлгілерді серопозитивтіге және серонегативтіге бөлудің нақты критерийлерін, сондай-ақ оң нәтижені растау критерийлерін белгілеу қажет. Осы міндетті шешу тәсілдері әдіске және басқа да факторларға қарай әртүрлі болуы мүмкін, бұл тиісінше негіздеуді талап етеді. Бастапқы параметрлерді белгілеу иммунологиялық әдістерді орындау кезінде нәтижені оң нәтиже деп қабылдау шегін айқындаудың жалпы тәсілі болып табылады. Осындай шектің мәнін айқындау үшін статистикалық әдістерді пайдалану ұсынылады. Екінші жағынан, ең төмен оң мән ретінде нақты деректерді (мысалы, бастапқы параметрлерді зерделеу кезінде белгіленген қосарланған мәндер) пайдалануға жол беріледі. Еуразиялық экономикалық одақтың
жүктеу/скачать 0.89 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|