Методы биологических исследований
жүктеу/скачать 1.06 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Другие методы
- Метод ДНК-комет
- Применимость
- Метод доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster
- Характеристика метода
ПринципМетод основан на реакции красителя кумасси с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе. Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл, менее "капризный" по сравнению с методом Лоури. Другие методы
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Метод ДНК-кометэто метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен детектировать разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным . ИсторияПервым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson. Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК. ПрименимостьМетод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу:
Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца. Внешний вид и ранжирование ДНК-комет: 
Пять условных типов ДНК-комет, которые учитываются при анализе степени поврежденности ДНК ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Метод доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogasterгенетический тест, который позволяет установить мутагенен ли фактор в отношении половых клеток, за счет учета не развившихся эмбрионов. Простой, экономичный и высокочувствительный метод генотоксикологии для выявления мутагенного эффекта самых различных факторов . ИсторияМетод учета частоты доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster получил широкую известность в 50-70-х годах, когда он активно и повсеместно использовался при выяснении мутагенности химических соединений и особенно гамма-лучей. Важную роль в становлении метода сыграли работы Мэри Л. Александер . Метод не потерял своей актуальности и используется до сих пор . Характеристика методаПрименимостьДанный метод используется в при тестировании мутагенности:
Кроме того, рекомендован в качестве теста на канцерогены . ДостоинстваDrosophila melanogaster выбрана объектом метода поскольку это один из наиболее хорошо изученных модельных объектов генетики высших организмов. Около 2/3 генов ответственных за болезни у человека, обнаруживают гомологию в геноме дрозофилы. Основные биохимические процессы в клетках Drosophila melanogaster и млекопитающих идентичны. К достоинствам можно так же отнести тот факт, что у Drosophila melanogaster в процессе метаболизма происходит микросомальная активация веществ. В результате этого промутагены превращаются в мутагены. Это позволяет выявлять скрытые мутагены, которые приобретают генотоксичность в процессе метаболизма . Тесты с использованием Drosophila melanogaster рекомендованы ВОЗ для исследования мутагенной и токсической активности антропогенных ксенобиотиков ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Для постановки опыта используются линии дрозофилы, которые отличаются очень низкой спонтанной мутагенностью в отношении мутаций некоторых типов, что делает их очень удобными для опытов, имеющих целью выяснение различий эффектов индуцированного мутагененза. Воздействию фактора подвергаются самцы. При изучении воздействия электромагнитных излучений требуется подобрать емкость из материала с наименьшими отражающими свойствами. Если изучается мутагенное действие химического соединения, то его примешивают в питательную среду в требуемой концентрации. При изучении мутагенной активности воды или почвы, в качестве емкости используют стаканчики, на дно которых наливают 5 мл исследуемой воды. На дно стаканчика помещается металлическая сеточка таким образом, чтобы вода касалась нижней ее поверхности. На сеточку помещают самцов, которые предварительно были посажены на 3-х часовое голодание. Параллельно ставится интактный контроль. По окончании экспозиции самцов их скрещиваются с самками. Скрещивание проводят в чашках Петри на дно которых была залита агаризованная среда. В чашках мухи содержатся трое суток, через сутки отсаживают самцов, через двое суток — самок. Чашки Петри с отложенными яйцами помещают в термостат на пять суток для выхода личинки из яйца. По истечении этого времени проводится подсчет яиц под микроскопом . Доминантные летальные мутации, которые индуцируются факторами в сперматозоидах, приводят к гибели зиготы или за счёт возникновения в эмбриогенезе, в результате хромосомных аберраций дефицита в геноме, или за счёт различных повреждений, приводящих к блоку редупликации. ПЭЛ и РЭЛ — это два класса ДЛМ, которые хорошо определяются визуально. Яйца с ПЭЛ коричневого, палевого или жёлтого цвета, а с РЭЛ — белого цвета, и внутри них видны остановившиеся этапы сегрегации эмбриона — белые непрозрачные уплотнения. Подсчёт ведётся на стадии яйца, то есть считается количество развившихся из яйца личинок и количество неразвившихся яиц. Также при воздействии на мух мутагенами имеется определённая вероятность откладки неоплодотворённых яиц. Существуют два варианта определения частоты ДЛМ:
ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ жүктеу/скачать 1.06 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
