ДЕПОНИРОВАННЫЙ ФОНД ЖЕЛЕЗА - МЕТОДЫ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Среднее содержание трансферрина в сыворотке крови здоровых взрослых людей варьирует в достаточно узком диапазоне 3.0-3.3 г/л, при этом концентрация этого белка в сыворотке крови варьирует в зависимости от возраста, так наименьшая концентрация трансферрина характерна в неонатальном периоде, в детском возрасте концентрация этого белка превышает таковую у взрослых ( А.А.Бугланов и др., 1988, 1989) . В свою очередь, у взрослых содержание трансферрина также подвержено колебаниям в зависимости от физиологического состояния, например, при беременности количество этого белка в крови возрастает (Ю.К. Джаббарова и др., 1986). Для железодефицитной анемии характерно значительное увеличение содержания тарнсферрина в сыворотке крови, повышение концентрации сывороточного трансферрина при этом носит компенсаторный характер и направлено на более полное и быстрое поступление железа в костный мозг, увеличение скорости обмена железа.

Анализ трансферрина сыворотки крови осуществляют иммунохимическим методом, например, в варианте радиальной иммунодиффузии. Для этого приготовляют 1% раствор агара, для чего 1 г очищенного агара расплавляют в 100 мл физиологического раствора на водяной бане. Полученный агаровый гель затем охлаждают до температуры 50⁰С, затем смешивают 2.5 мл агара с 0.1мл антисыворотки против трансферрина подогретой до той же температуры и разливают на чистое обезжиренное предметное стекло, расположенное строго горизонтально. После того как агар застынет, в нем вырезают лунки, рассчитанные на 2мкл каждая. В лунки вносят дозатором аликвоты по 2 мкл растворов исследуемых сывороток и аликвоты стандартного раствора трансферрина в различной концентрации. Затем пластинки с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают в течение 20 часов при +4⁰ С. После окончания имунодиффузии и образования колец преципитации пластинки с агаровым гелем накрывают влажной фильтровальной бумагой и высушивают в термостате при 37⁰ С, после чего окрашивают амидочерным 10 В (1.5г краски растворяют в 250мл 2% уксусной кислоты) в течение нескольких минут. Несвязавшуюся краску отмывают водопроводной водой. Содержание трансферрина в пробах определяют по калибровочной кривой, которую строят, откладывая по оси ординат квадрат диаметра кольца преципитации стандартных проб трансферрина, а по оси абсцисс концентрацию трансферрина, для построения калибровочной кривой, используют белок в концентрации 10мг/мл, 8мг/мл, 4мг/мл, 2мг/мл, 1мг/мл. Как правило, определяемое содержание трансферрина при железодефицитных состояниях (латентный и манифестный дефициты железа) хорошо укладывается в диапазон указанных стандартных концентраций белка.

Не менее важным диагностическим показателем запасного фонда железа является производный показатель-коэффициент насыщения трансферрина железом (КНТ). При нормальном эритропоэзе у взрослого человека этот показатель составляет 30-40%. Как и содержание трансферрина, коэффициент насыщения этого белка железом неодинаков в разные периоды жизни. Так, в неонатальный период коэффициент насыщения трансферрина железом в 2 раза выше, чем у взрослых (А.А.Бугланов и др., 1989). Для железодефицитного эритропоэза характерно снижение коэффициента насыщения трансферрина железом, этот показатель, как правило, ниже 16%. Коэффициент насыщения трансферрина железом может быть рассчитан по формуле:

Б х 1,37х0,18

где А-содержание сывороточного железа в мкмоль/л, Б-содержание сывороточного трансферрина в мг/100мл.

Коэффициент насыщения трансферрина железом подвергается значительным биологическим вариациям, т.к. его установление прямо связано с определением содержания железа сыворотки, последнее же в свою очередь, подвержено суточным, возрастным и другим колебаниям, поэтому коэффициент насыщения трансферрина может рассматриваться в качестве диагностического показателя при диагностике дефицита железа только в том случае, если его снижение сопровождается одновременным повышением концентрации трансферрина в сыворотке крови (С.М.Бахрамов и др., 1995). Параллельное определение трансферрина сыворотки при этом позволяет дифференцировать диагноз в тех случаях, когда коэффициент насыщения трансферрина железом снижен, как это имеет место, например, при дефиците железа, сочетанного с инфекционно-воспалительными заболеваниями. Тем не менее, коэффициент насыщения трансферрина железом самостоятельно может быть весьма информативным критерием дифференциальной диагностики, например, железодефицитной анемии, талассемии и сидеробластной анемии. Для этих патологий характерны гипохромия и микроцитоз, однако талассемия и сидеробластная анемия сопровождаются увеличением коэффициента насыщения трансферрина.железом, в то время как при железодефицитной анемии этот показатель наоборот снижен (А.А.Бугланов.1987).

Самым информативным и чувствительным показателем запасного депонированного фонда железа в организме и тем самым показателем дефицита железа, особенно, латентного и прелатентного дефицита в организме является показатель ферритина сыворотки крови. С появлением в экспериментальной практике высокочувствительных радиоиммунологичес-ких методов исследования на рубеже 70-х годов, было установлено, что в определенных количествах ферритин циркулирует в кровотоке. Более того, были выявлены определённые количественные корреляции между содержанием ферритина в сыворотке крови и общими запасами железа, в организме, выражающиеся в том, что концентрации ферритина в сыворотке крови, составляющей 1 мкг/л или 1 нг/мл, соответствует примерно 8-10мг запасного железа (В.Н.Петров,1982). Следовательно, концентрация ферритина в сыворотке крови является надежным показателем депонированного в организме железа, а количественное определенное этого белка важным тестом при диагностике железодефицитных состояний, особенно, латентного дефицита железа. В лабораторной практике ферритин сыворотки обычно определяют либо конкурентными методами, иммунорадиопробами с использованием меченых изотопной меткой антигенов, либо - неконкурентными методами, иммунорадиометрическими или иммуноферментными пробами с применением меченых изотопной или ферментной меткой антител. Среднее содержание ферритина в сыворотке крови здоровых людей варьирует в пределах 20-280 мкг/л (Н.Г. Шевченко, 1997), хотя возможны значительные индивидуальные колебания в содержании этого белка. В то же время при манифестном дефиците железа, железодефицитной анемии содержание ферритина в сыворотке крови всегда ниже 12 мкг/л, а при латентном дефиците железа - ниже 20 мкг/л, что отражает уменьшение запасного фонда железа в организме. Сравнение между концентрацией ферритина в сыворотке крови и количеством железа в костном мозге, выявляемым гистохимическим методом, показывает полное отсутствие железа в биопсийных образцах костного мозга при концентрации ферритина в сыворотке крови ниже 20мкг/л.

На протяжении жизни человека имеют место физиологические колебания в содержании ферритина в сыворотке крови, отражающие изменения в запасах железа, в организме. У новорожденных уровень сывороточного ферритина, как правило, высокий и отражает достаточные запасы депонированного железа (А.А.Бугланов и др., 1989). При этом максимальная концентрация этого белка отмечается в возрасте 1 месяца, в дальнейшем уровень сывороточного ферритина прогрессивно снижается. Различий в содержании ферритина сыворотки, связанных с полом, в период раннего детства, как правило, не существует, в то же время в репродуктивный период, такие различия существуют и объясняются специфическими физиологическими нагрузками на депо железа в организме женщин (менструальные кровопотери, беременность, роды, лактация).

Как указано выше, для определения ферритина в сыворотке крови используют радиоиммунологические, иммунорадиометр-ические, а в последнее время, в основном, иммуноферментные методы анализа.

Иммуноферментный анализ ферритина в сыворотке крови проводят по принципу "сэндвич" на твердой фазе, используя сенсибилизированные антиферритиновыми антителами, растворен-ными в 0.05 М карбонат – бикарбонатном буфере рН 9.6 полистироловые планшеты. Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет используют антитела в концентрации 30 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере. В каждую лунку вносят 0.1 мл раствора антител и инкубируют в течение 1 часа при 37⁰ С и 18 часов при +4⁰С, после чего растворы из лунок удаляют дозатором и трижды отмывают дистиллированной водой, затем физиологическим раствором рН 7,2 с добавлением неионного детергента тритона Х-1ОО в конечной концентрации 0.05%. После этого в лунки вносят равные аликвоты 0.2% раствора бычьего сывороточного альбумина в физиологическом растворе и инкубируют 5 часов при +4⁰С для блокирования свободных сайтов связывания. После инкубации лунки освобождают и вносят в них исследуемые сыворотки и растворы стандартных концентраций ферритина в объеме 100 мкл, инкубируют 2 часа при 37⁰С, растворы удаляют, лунки промывают, как указано выше. Затем в лунки вносят рабочий раствор конъюгата, инкубируют, промывают и вносят по 100 мкл свежеприготовленного субстрата 0-фенилендиамина в концентрации 1мг/мл. Количество ферритина в исследуемых сыворотках определяют по калибровочной кривой построенной для стандартных растворов этого белка (А.А.Бутланов и др., 1988).

Функциональный костномозговой фонд железа в организме это то железо, которое аккумулировано в развивающихся клетках костного мозга, которое поступает сюда из плазменного лабильного фонда и мобилизуется из запасного депонированного фонда железа при необходимости, например, при интенсификации гемопоэза, эритропоэза, обусловленной кровопотерей или другими причинами. Надежным критерием состояния функционального костномозгового фонда железа и, следовательно, состояния эритропоэза является показатель концентрации свободных циркулирующих в кровотоке трансферриновых рецепторов. Недостаточность железа в его функциональном костномозговом фонде вследствие нарушения нормального его снабжения трансферрином из плазменного фонда обусловит эффект неэффективного железодефицитного эритропоэза, т.е. разрушение нежизнеспособных предшественников эритроцитов, а также части поступивших в периферическую кровь эритроцитов. Вымывание током крови стромы разрушенных клеток костного мозга, а также протеолитическая деградация мембран разрушенных эритроцитов в периферической крови объясняет феномен присутствия свободных трансферриновых рецепторов в сыворотке крови, увеличивающееся количество которых в кровотоке является весьма чувствительным маркером железодефицитного эритропоэза, дефицита железа в функциональном костномозговом фонде железа, в частности, и дефицита железа в организме вообще.

Среднее содержание трансферриновых рецепторов в сыворотке крови здоровых взрослых людей составляет 4,86±0,39мг/л.

Концентрацию трансферриновых рецепторов в сыворотке крови определяют иммуноферментным методом на твердой фазе по принципу "сэндвич" с использованием пула аффинноочищенных поликлональных антител кролика против трансферринового рецептора человека. Для сенсибилизации поверхности лунок полистиролового планшета используют раствор поликлональных антител с концентрацией последних 20мкг/мл в 0,02 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6. Раствор антител пипетируют по 100 мкл в лунки и инкубируют при +4⁰С в течение 12 часов. После инкубации раствор антител удаляют, лунки планшета промывают 3 раза по 200 мкл на лунку забуференным физиологическим раствором-0.01 М двузамещенного фосфор-нокислого калия, 0.1 М хлорида натрия, рН – 7,2-7,4. Для построения калибровочной кривой готовят 6 стандартных растворов трансферриновых рецепторов из маточного раствора этих рецепторов с концентрацией 20мг/л. Исследуемые сыворотки крови разбавляют в 10 раз забуференным физиологическим раствором с бычьим сывороточным альбумином. Последний готовится путем добавления в забуференный физиологический раствор бычьего сывороточного альбумина в концентрации 10мг/мл. По 100 мкл разбавленных в 10 раз сывороток вносят в лунки в трех повторах и стандартных образцов в двух повторах и инкубируют в течение 1 часа при 37⁰С. После инкубации лунки опорожняют и промывают их 5 раз забуференным физиологическим раствором. Приготовляют раствор фермент-меченных антител (конъюгата) с использованием забуференного физиологического раствора с бычьим сывороточным альбумином из расчета на 10 мл буфера 0.1 мл концентрированного раствора конъюгата и вносят по 100 мкл в лунку, инкубируют в течение 1 часа при 37⁰С. После инкубации лунки опорожняют и промывают 5 раз забуференным физиологическим раствором. Приготовляют раствор субстрата, исходя из расчета 4 мг 0-фенилендиамина и 40 мкл 3% перекиси водорода на 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,6. Вносят по 100 мкл в лунку раствора субстрата и инкубируют в течение 30 минут при перемешивании на шейкере при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 4 М серной кислоты. Оптическую плотность растворов в лунках измеряют на спектрофотометре при длине волны 492 нм, концентрацию трансферриновых рецепторов определяют по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам рецепторов.

В таблице 14 приведены маркерные признаки характерные для разных стадий развития железодефицитного состояния.

Таким образом, определение концентрации железа в сыворотке крови, количественный анализ общего пула трансферрина в сыворотке крови с расчетом его насыщенности железом, определение концентрации ферритина в сыворотке крови, а также количественный анализ циркулирующих трансферриновых рецепторов в кровотоке, отражающих соответственно плазменный лабильный, запасный депонированный и функциональный костномозговой фонды железа в организме рассматриваются как важные скрининг подтверждающие тесты в системе дифференциального диагноза патологий обмена железа в организме, а сами эти тесты сегодня составляют основу современной лабораторной диагностики железодефицитных состояний.

Таблица 14

Стадии железодефицитного состояния и его характерные признаки

Стадии	Показатели
Прелатентный дефицит железа	Пониженное содержание железа в костном мозге, манифестирующее увеличением концентрации трансферриновых рецепторов в кровотоке. Увеличенная абсорбция железа в кишечнике. Сдвиг изотрансферринового спектра влево.
Латентный дефицит железа	Снижающийся уровень железа в сыворотке крови. Увеличение железосвязывающей способности сыворотки и трансферрина в сыворотке крови. Смещение изотранс-ферринового спектра сыворотки крови влево, увеличение пула ненасыщенного железом - апотрансферрина. Снижение уровня ферритина в сыворотке крови. Повышение уровня циркули-рующих сывороточных трансферриновых рецепторов. Тканевой железодефицит
Манифестный дефицит железа – железодефи-цитная анемия	Микроцитарная, гиповолемическая анемия. Увеличенный уровень свободного эритро-цитарного протопорфирина. Выраженная гипосидеремия, гипер-трансферринемия, гипо-ферритинемия. Выраженное изменение изо-трансферринового спектра – превалирование апотрансферрина. Патологическое увеличение концентрации трансферриновых рецепторов в крови. Клинические симптомы анемии.

Глава 5. ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ И ПРИЧИНЫ ДЕФИЦИТА ЖЕЛЕЗА У ДЕТЕЙ

______________________________________________________
5.1. Частота встречаемости железодефицитных состояний у детей
Нами проведен ретроспективный анализ клинического материала за 1995-1999 гг. для уточнения удельного веса железодефицитных анемий (ЖДА) в структуре заболеваний системы крови, определения характера распределения их в зависимости от возраста, пола, места проживания и национальной принадлежности больных детей. Обследовано 2247 детей, больных различными гемопатиями, пролеченных в гематологическом отделении многопрофильной детской больницы Самаркандского вилоята. При этом установлено, что из вышеуказанного общего числа проанализированных детей у 542 пациентов верифицирована железодефицитная анемия, из них дети школьного возраста составляли –196 (36,1%). Мальчиков было–325 (60%), девочек–217 (40%). Среди этих больных ЖДА горожан – 146, сельчан – 396. По национальной принадлежности – коренного населения (узбеков, таджиков, иранцев) - 509 чел., русских – 6, метисов - 5 и по одному - татары, армяне, корейцы, 19 человек других национальностей.

Для выявления возможного значения в происхождении ЖДА отдельных факторов, связанных с возрастом родителей больных был изучен их возрастной состав, так, среди них в возрасте от 21 до 30 лет отцов было 118 (29%), матерей – 150 (37%); 31-40 лет – 158 (39%) и 133 (33%) соответственно.

За период с 2001 по 2002 год в 9 (№1, 7, 28, 33, 42, 43, 44, 49, 51) школах г.Самарканда, 2-х специализированных интернатах (для детей с пониженным зрением и юных футболистов), 4-х туманах (Ургутский, Джамбайский, Нурабадский, Самаркандский сельский) Самаркандского вилоята и 2-х школах Бухарского вилоята у 4017 детей,в возрасте от 7 до 17 лет, изучены показатели красной крови (число эритроцитов, уровень гемоглобина, цветовой показатель, гематокрит и ретикулоциты) (табл.15).

Из них у 2000 городских и сельских школьников заполнены специально разработанные анкеты на предмет выявления железодефицитных анемий.

По первичному скринингу карты опроса заполнены в Ургутском, Джамбайском, Нурабадском туманах Самаркандского вилоята и 2-х интернатах г. Самарканда у 1960 учащихся 1-9 классов (7-17 лет). Результаты анкетирования школьников приведены в табл.16.

Из анамнестических данных стало известно, что из общего числа обследованных детей указывали- 13,3% на перенесенную ранее или имеющуюся в данный момент анемию, 15,7% - на кровотечения, 14% - на хронические заболевания органов пищеварения, 24,7% - на вирусный гепатит, 32,5% - на частые простуды и 16,2% - на глистные инвазии. У городских детей в анамнезе, по сравнению с сельскими школьниками, превалировали кровотечения (20,3%) и хронические заболевания органов пищеварения (25,2%). На вопрос о характере питания был получен ответ, что дети из села чаще употребляют молочные (84,2%) продукты, хлебопродукты (84,5%) и меньше мясных (76%) продуктов и овощей (76%).

Дети-горожане употребляют больше мясных (90,2%) продуктов и овощей (85,3%), а также они соблюдают режим питания 90,2% случаев, 23,5% из всех опрошенных в семье имели больных с анемией, этот показатель в городских семьях составил - 35,7%. Понятие об анемии у городских детей было больше, чем у сельских детей (69,9 и 43,8%, соответственно).

Таким образом, по анализу причин, приводящих, к анемии следует указать, что у обследованных школьников в анамнезе перенесенные заболевания имелись у каждого третьего и главным источником развития дефицита железа, особенно в условиях сельской местности, представляется алиментарный фактор.

При анкетировании общеанемические симптомы выявлены у детей от 16 до 47%, считавших себя здоровыми школьников и при этом большой разницы между сельскими и городскими детьми не было.

Сидеропенические признаки выявлялись от 4 до 28,3%, и среди них превалировали выпадение и ломкость волос, трещины в области пяток, а также сухость кожи. Изменение вкуса наблюдалось у 10,5% сельских и 8,94% городских обследованных детей, и оно выражалось наличием извращенного вкуса, характеризующегося поеданием глины (гильваты), мела, чайного отхода, соли, бумаги, мыла и других, обычно несъедобных, веществ.

Таблица 16