Монография государственное научное издательство «Ўзбекистон миллий энциклопедияси» Ташкент 2010 б 49

Головные боли

Примечание: знак ответа «-» - нет; знак «+» - да. Если Вы ответили «Да» на 10 вопросов (у девочек 15 вопросов), имеется предрасположенность к анемии; если на 20 вопросов(у девочек 25 вопросов) имеется анемия и надо обратиться к врачу.

Всеобщее признание получил цианметгемоглобиновый метод, как наиболее точный и объективный, который принят в качестве стандартного Международным комитетом по стандартизации в гематологии. Международный комитет располагает длительно хранящимся эталонным раствором гемиглобинцианида, который рассылается в ряд стран для проверки изготовляемых стандартов. Единственным серьезным недостатком этого метода является применение в работе калия цианида, сильнейшего яда. В случаях взятия пробы у кровати больного или новорожденного необходимо соблюдение самых строгих мер предосторожности.

В качестве приборной базы используют различные фотоколориметры - КФК-2, КФК-3, МФ-1020, КФО, Гемокон-5, ФЭК-56, ГФ-3, ГФ-Ц-4 и др. Для этих способов ошибка составляет от 4,48 до 12,6%.

Подавляющее большинство используют в своей работе гемиглобинцианидный метод и наборы для его проведения следующих предприятий - НПО «Биолар» (Екатеринбург), «Рем-икс» (Уфа), «Синтакон» (Санкт-Петербург) и НПМН «Узфос-фосорб» (Ташкент).

Особо надо отметить, сравнительно небольшую группу лабораторий, которые имеют приборы «Stat-LAB» (Япония), «Contraves Digicall-500» (Швеция), «Serona-159» (Serona), Т-840 «Культер» (Культроник, Франция), Для научного и практического здравоохранения определение гемоглобина (Нb) в крови является одним из самых распространенных методов исследования. Наряду с числом эритроцитов концентрация гемоглобина- важный лабораторный показатель и отражает преклиническое состояние недостаточности железа в крови.

KSMA и гемоглобинометр «BMS-IO-IOIR» (США). Для этой группы общая ошибка составляет 3,64%, ошибка лаборанта – 1,30%. Следует отметить, что в Узбекистане выпускается прибор «QA-100» предназначенный для измерения концентрации гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом, которое широко внедряется в практику.

В настоящее время в ряде лабораторий применяется гемометр Сали. Погрешность этого метода составляет 7-10%, максимальная – 20% (С.К.Расулов и др.,2002). При долговременном использо-вании ошибка возрастает до 30%).

Используемые в настоящее время методы, такие, как анализ циангемоглобина и алкалингематина являются наиболее точными, однако эти методы требуют более высокого уровня оборудования, запасных частей и электроэнергии, что не всегда доступно.

Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом с применением ацетонциангидрина основано на принципе – окисления гемоглобина при взаимодействии с железосинеродистым калием (красной кровяной солью) в метгемоглобин, образования с ацетонциангидрином окрашенного цианметгемоглобина (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорционально содержанию в нем гемоглобина.

Наиболее практичным считается гемоглобинометр «BMS 10-101R» – удобный портативный диагностический фотометр для определения содержания гемоглобина в крови с использованием оксигемоглобинового метода. Гемоглобинометр сравнивает поглощение света через определенный слой гемолизированной крови (оксигемоглобина) со стандартным стеклянным клином.

Свет, обеспечиваемый двумя «С» типовыми батареями и стандартной 2,5 В 5А лампой, диффузно проходит через стеклянное окно (соответственно через образец гемолизированной крови) и одновременно через стандартный стеклянный клин. Призма направляет свет к щелевому полю окуляра, который содержит фильтр для регулирования передачи длины волны примерно на 150 нм. Стандартный стеклянный клин продвигается индикаторной кнопкой до тех пор, пока интенсивность света не будет совпадать с таковой образца крови. Концентрация гемоглобина затем считается по шкале либо в граммах на 100 мл, либо в процентах 13,8 г, 14,5 г, или 15,6 г Hb , на 100 мл.

С целью оценки и сопоставимости результатов трех используемых в клинической практике способов определения гемоглобина и выявления наиболее реальных показателей его у детей, нами проведено определение гемоглобина у практически здоровых учащихся 11-14 лет. Гематологическому обследованию подлежало 99 здоровых детей 5,6,7 и 8 «а,б» классов лицея-интерната (13 лет-20 лет; 12 лет-20; 14 лет-39 детей) г.Самарканда. В исследуемую группу вошли здоровые дети не болевшие за последние 2 месяца, не состоявшие на диспансерном учете по поводу хронической патологии, не имевшие отклонения в физическом развитии. Помимо специальных методов исследования проводились общеклинические лабораторные исследования крови и кала, измерение артериального давления, антропометрических параметров, показатели которых соответствовали возрастным нормам.

Определение гемоглобина произведено приборами одномоментно в утренние часы до завтрака и тренировок. Для чего из мякоти пальца бралось всего 60 мкл крови.

Результаты сравнительных показателей содержания гемоглобина в крови у здоровых детей школьного возраста приведены в таблице 12.

В общей практике у детей 6-14 лет основным критерием анемии и степени ее тяжести является показатель уровня гемоглобина (Hb)-легкая степень анемии – уровень Hb от 120 до 90 г/л, средняя степень тяжести анемии-уровень Hb 90-70 г/л, тяжелая степень анемии – уровень Hb ниже 70г/л (ВОЗ, 1994).

Анализируя колебания содержания гемоглобина у здоровых детей старшего возраста (табл.13) установленные с помощью прибора Сали необходимо указать на наличие анемии у всех (100%) обследованных детей, в основном средней (II) степени тяжести. Частота легкой степени анемии при применении двух современных гемоглобинометров составила соответственно 11 и 19% среди охваченных проверкой детей школьного возраста.
Таблица 13

Содержание гемоглобина у здоровых детей школьного возраста по разным способам его определения (в г/л).

Способ Определения	Hb ниже 70		Hb 70-90		Hb 92-120		Hb 122-150		152 и выше
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
По Сали	4	4,4	87	87,8	8	8,08	-	-	-	-
Гемоглобинометр BMS 10-101R	-	-	-	-	11	11,1	80	80,8	8	8,08
Гемоглобинометр «QA-100»	-	-	-	-	19	19,2	71	71,7	9	9,09

Следовательно, данные исследования еще раз подтверждают о преимуществах современных методов исследования содержания гемоглобина крови, по сравнению с методом Сали. Первые два метода обеспечивают достижение наиболее точных результатов, а также отличаются по технической простоте выполнения анализов.

Указывая на довольно высокий процент неточности уровня гемоглобина при определении гемометром Сали, можно отметить нижеследующее – на результаты этого геминхлоридного метода могут оказать отрицательное влияние полиглобулия, время реакции между Hb и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин, в зависимости от содержания белков в плазме крови. Кроме того, оттенок цвета раствора геминхлорида зависит от концентрации билирубина плазмы и характера освещения Hb, чаще всего бывает связано с неточностью пипетирования (из-за невысокого качества пипетки от гемометра Сали) и неверной калибровкой прибора. Исходя из вышеуказанного метод Сали должен быть исключен из клинической практики.

Показатели гемоглобина, определяемые двумя новыми методами, могут варьировать в течении дня в зависимости от принятия жидкости, питания, физической нагрузки и общего состояния. Эти вариации обычно колеблются в пределах 4% от среднего показателя гемоглобина.

На наш взгляд, для применения на практике можно рекомендовать гемоглобинометры производства США (BMS 10-101R) и отечественный «QA-100». Первый портативный прибор, позволяет получить результат за считанные секунды, без реактивов, его можно использовать для массовых обследований. За последний период появились и другие современные гемоглобинометры, которые становятся достояниями медиков нашей Республики (С.М.Бахрамов и др., 2008)
4.3. Способ диагностики патологий обмена железа
В данной книге освещается способ диагностики отдельных форм микроэлементозов у детей, обусловленных дефицитом гемопоэтических микроэлементов. В частности, представлен и предложенный нами (Бугланов А.А., С.К.Расулов, 2001) способ диагностики недостаточности и перегрузки железом, который значительно упрощает и ускоряет драспознование патологий в обмене железа. Безусловно, большие перспективы в комплексной диагностике железодефицитных состояний приобретают методы, основанные на количественном определении железосвязывающих белков сыворотки крови, непосредственно участвующих в обмене железа и в первую очередь, трансферрина. В то же время современная феррокинетика предусматривает, что общий пул трансферрина в организме человека представлен функционально полиморфным семейством белков, циркулирующих в кровотоке различными молекулярными формами трансферрина – моноферри-, диферри- и апотрансферрином, при этом моноферритрансферрин представлен трансферрином с локализацией железа в А-центре (С-концевом домене белка) и трансферрином с локализацией железа в В-центре (N-концевом домене белка) (J.J.M.Marx, 1996). Данные молекулярные формы трансферрина регулируют гомеостаз железа в организме, осуществляя перераспределение железа между клетками-акцепторами железа (эритробластами, ретикулоцитами), клетками донорами железа (макрофагами РЭС) и клетками – депо (гепатоцитами).

В настоящее время диагностика патологий обмена железа,в частности, железодефицитных состояний во многом строится на количественной оценке сывороточного ферритина каким-либо высокочувствительным методом анализа, либо радиоиммунным или иммунорадиометрическим с использованием в качестве радиоактивной метки-изотопа I¹³¹, либо иммуноферментным с использованием в качестве ферментной метки- пероксидазы (А.А.Бугланов и др., 1988). Как правило радиоиммуноло-гические, иммунорадиометрические и иммуноферментные методы количественного определения ферритина в сыворотке крови достаточно хорошо отражают состояние запасов железа в организме как в норме, так и при патологиях обмена железа. И при низком содержании ферритина в сыворотке крови (менее 20 нг/мл) диагностируют дефицит железа в организме, а при высоком содержании ферритина в сыворотке крови (более 500 нг/мл) диагностируют перегрузку организма железом. (В.Н. Петров, 1989). Все указанные выше методы используют в качестве твердофазного носителя для сорбции антител или антигена какой-либо полимер, как правило, полистирол. Однако, существенным недостатком всех указанных способов является длительность и сложность всех технологических операций, как предварительных, так и операций, непосредственно связанных с проведением самого анализа.

Предложенный нами способ диагностики недостаточности и перегрузки железом значительно упрощает и ускоряет диагностику патологий в обмене железа. Данная задача решается следующим образом: проводится ракетный иммунный электрофорез сыворотки крови больного с антителами к двум изоформам трансферрина-апотрансферрину и диферритрансферрину, определяются площади образующихся ракет апотрансферрина и диферритрансферрина, соотносятся площади ракет и при отношении диферрит-рансферрин/апотрансферрин больше 3 диагностируется перегрузка организма железом, а при отношении апотрансферрин/ диферритрансферрин больше 3 диагностируется дефицит железа в организме.

В отличие от традиционных методов анализа концентрации ферритина в сыворотке крови для диагностики патологий в обмене железа, нами предложено в диагностических целях определять не ферритин, а другой железосвязывающий металлопротеид сыворотки крови – трансферрин и определять не общее количество трансферрина, а содержание его различных молекулярных форм, различающихся степенью насыщения их железом. А как мы отметили выше, разные молекулярные формы трансферрина, а именно диферритрансферрин и апотрансферрин являются чувствительными и надежными маркерами нарушений гомеостаза железа в организме.

Итак, трансферрин являющийся основным переносчиком железа в организме в кровотоке, как указывалось выше, существует в виде полиморфных молекулярных форм полностью насыщенных железом форм трансферрина-диферритрансферрина, частично насыщенного железом трансферрина-монофер-ритрансферрина и ненасыщенного железом апотрансферрина. При недостаточности железа в организме, например, при железо-дефицитной анемии в кровотоке преобладает пул ненасыщенного железом трансферрина (апотрансферрина) и, наоборот, при перегрузке организма железом, например, при гемохроматозе, в кровотоке преобладает пул полностью насыщенного железом трансферрина-диферритрансферрина. Поэтому для диагностики недостаточности и перегрузки организма железом мы использовали отношение разных молекулярных форм транс-феррина, а именно полностью насыщенного железом трансферрина и ненасыщенного железом трансферрина.

Для практической реализации оригинального способа диагностики патологий обмена железа приготовляли различные молекулярные формы трансферрина, для чего электрофоретически гомогенный трансферрин, полученный методами ионообменной и гельпроникающей хроматографии подвергали интенсивному диализу против 1 М раствора лимонной кислоты, а затем против дистиллированной воды, переводя таким образом, трансферрин в апоформу, в силу того, что в кислой среде связь между железом и белком становится лабильной и оно легко отщепляется от белка. После этого раствор белка лиофильно высушивали. Диферритрансферрин получали путем насыщения 1% раствора апотрансферрина раствором хлорного железа до экстинкции раствора при 465 нм (длине волны максимального поглощения в видимой области спектра окрашенного раствора трансферрина) в 0,567, свидетельствующей о полном насыщении трансферрина железом.

Технически данную операцию осуществляли следующим образом – приготовляли ряд 1% растворов апотрансферрина, которые затем насыщали стандартным раствором хлорного железа. После часовой инкубации этих растворов, измеряли оптическую плотность в этих растворах при 465 нм, затем строили график зависимости оптической плотности раствора трансферрина при 465 нм от объема стандартного раствора железа (см. рис.1). Представлен график зависимости оптической плотности раствора трансферрина при 465 нм от объема стандартного раствора железа

О.Д. при 465 нм 1,0 0,8 0,6 0,5 0,4 0,2 V мл

Сам ракетный иммуноэлектрофорез проводили следующим образом – приготовляли 1% раствор агарозы в 0,05 М мединал-вероналовом буфере pH 8,6, для чего 1 г агарозы расплавляли в 100 мл приготовленного буферного раствора на водяной бане. Полученный агарозный гель охлаждали до 50 ⁰ С, затем 5 мл охлажденного геля смешивали с 0,2 мл подогретой до той же температуры той или иной моноспецифической антисыворотки и немедленно разливали на расположенное строго горизонтально чистое обезжиренное подогретое предметное стекло. Следует отметить, что подогретыми должны быть не только предметное стекло, но и пипетка, которой разливают смесь, соблюдение этого условия чрезвычайно важно, т.к. в случае, если смесь набирается холодной пипеткой и разливается на холодное предметное стекло, агарозная смесь каогулирует с образованием хлопьев, которые смещают при визуальном наблюдении, образующиеся после иммуноэлектрофореза характерных шлейфов (ракет). После того, как агарозная смесь затвердевала, в геле стандартным ножом вырезали лунки диаметром 4 мм, затем рамку с предметными стеклами помещали в камеру для электрофореза. Расплавленной агарозой делали перемычки между агарозными блоками в электрофоретических камерах и агарозной смесью на предметных стеклах. В электрофоретические камеры заливали холодный мединал-вероналовый буфер pH 8,6, после чего в лунки вносили дозированной микропипеткой по 10 мкл растворов анализируемых сывороток и проводили иммуноэлектрофорез в течение 1,5 часов при напряжении 100 в по прибору. По окончании иммуноэлектрофореза результат можно наблюдать визуально в виде вытянутых в сторону анода шлейфов (ракет). В тех случаях, когда ракеты видны недостаточно четко, агарозный гель отмывали от непреципитировавших белков в физиологическом растворе в покачивающихся чашках Петри в течение 2-3 часов. После этого агарозные пластинки высушивали в термостате при 37⁰С, предварительно накрыв их влажной фильтровальной бумагой, затем окрашивали амидо-черным 10,0 (1,5 г краски на 250 мл 2% уксусной кислоты) в течение 2-3 минут. Несвязавшуюся краску отмывали водопроводной водой. Длину шлейфа для расчета площади образующегося шлейфа (ракеты) измеряли от середины лунки до вершины преципитата.

Ниже мы приводим характерные примеры использования данного способа диагностики патологий обмена железа в клинико-диагностической практике.

Разработанный нами способ диагностики недостаточности и перегрузки организма железом, не уступая по точности диагностике анализа сывороточного ферритина, превосходит его по быстроте, т.к. иммунный ракетный электрофорез трансферрина длится от 1,5 до 2 часов, в то время как, например, радиоиммунный анализ сывороточного ферритина длится 2 суток. Кроме того, этот способ превосходит радиоиммунный анализ ферритина по простоте технологических операций, т.к. в предлагаемом способе осуществляется практически только одна технологическая операция – иммунный ракетный электрофорез с моноспециф-ической антисывороткой против апо- и диферритрансферрина, в то время как в радиоиммунном анализе требуется несколько технологических операций - сорбция ферритина на твердой фазе, инкубация, отмывка твердой фазы от несвязавшегося белка, инкубация твердой фазы с сорбированным ферритином с коньюгатом, содержащим изотопную метку, отмывка от избытка коньюгата и измерение радиоактивности в гамма-счетчике.

Разработанный нами способ диагностики дефицита железа защищенный соответствующими патентом Республики Узбекистан повышает качество оказываемой медицинской помощи, способствует правильной постановке диагноза и проведению адекватного лечения при патологии обмена железа, например, при недостаточности в организме железа (скрытый, латентный дефицит железа, железодефицитная анемия) или при перегрузке им организма (гемохроматоз).