Определение содержания абсцизовой и индолилуксусной кислот методом тфифа фиксация материала
жүктеу/скачать 92.82 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 3.4. Цветная реакция
| 3.3. Посадка пероксидазы
3.3.1. Содержимое флакона с антивидовым пероксидазным конъюгатом растворить в бидистиллированной воде в указанном объеме. Приготовить рабочее разведение пероксидазного конъюгата на растворе «ФТБ» согласно рекомендации производителя. В наборе иммунореагентов пероксидазный конъюгат может быть в отдельном флаконе для определения каждого гормона либо общий для всех фитогормонов в одном флаконе, но рабочее разведение для каждого из них разное, которое указывается на этикетке набора. Так же как и другие иммунореагенты, раствор антивидового пероксидазного конъюгата на «ФТБ» готовят в необходимом объеме в соответствии с числом рабочих лунок на планшете из расчета 200 мкл на 1 лунку. 3.3.2. Во все рабочие лунки планшета внести по 200 мкл раствора антивидового пероксидазного конъюгата на «ФТБ». Планшет закрыть крышкой и выдержать в термостате при +37 °С в течение 1—1,5 ч. 3.3.3. После термостатирования жидкость из лунок удалить и промыть лунки трижды раствором «ФТ», аккуратно освободив их от остатков промывного раствора (см. п. 3.1.4 и 3.2.6). 3.4. Цветная реакция 3.4.1. Приготовить раствор субстрата непосредственно перед проведением цветной реакции. Он включает 0,04 % ортофенилендиамина и 0,01 % перекиси водорода в 0,6 М цитратно-фосфатном буфере рН = 5,1 ± 0,1. Для этого к 25 мл указанного буфера добавить 10 мг ортофенилендиамина и 10 мкл 30%-й перекиси водорода. Исходя из этого соотношения компонентов, приготовить необходимый объем субстратного буферного раствора с учетом количества рабочих лунок на планшете (200 мкл на 1 лунку). Взять необходимую навеску ортофенилендиамина на кальке и вместе с калькой поместить в стакан, обернутый темной бумагой. Прилить соответствующее количество фосфатноцитратного буфера и 30%-й перекиси водорода, тщательно перемешать. 3.4.2. Быстро внести в рабочие лунки по 200 мкл субстратного буферного раствора и, закрыв планшет крышкой и темной бумагой, выдержать при комнатной температуре 20—25 °С в течение 10—15 мин (иногда до 20 мин в зависимости от скорости протекания ферментативной реакции). 3.4.3. Реакцию остановить в момент достижения наиболее ярких различий окраски в лунках калибровочного ряда с разным содержанием стандартного гормона, добавив по 50 мкл в каждую лунку разбавленной 1:1 серной кислоты. Внимание! На всех этапах иммуноанализа не следует держать лунки планшета без жидкости долгое время. 3.4.4. Измерить оптическую плотность раствора в лунках после фиксации серной кислотой на спектрофотометре при длине волны 492 нм против бидистиллированной воды в той последовательности, в какой вносили в лунки все иммунореагенты при проведении ТФИФА. Использовать микрокюветы. жүктеу/скачать 92.82 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|