Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии

32 
Тиохром извлекается из реакционной смеси изобутиловым (или бу-
тиловым) спиртом. При облучении ультрафиолетовыми лучами тиохром 
дает голубую флуоресценцию. 
N
N
NH
2
C
H
3
CH
2
N
+
S
CH
3
CH
2
CH
2
OH
Cl
N
S
CH
3
CH
2
CH
2
OH
N
N
C
H
3
N
+ 2K
4
Fe(CN)
6
+ KCl + 3H
2
O
+ 2K
3
Fe(CN)
6
+ 3KOH
тиаминхлорид
фeррицианид
калия
фeрроцианид
калия
тиохром
Ход исследования 
В пробирку наливают 5 капель 5 %-ного раствора тиамина, прилива-
ют 5 капель 10 %-ного раствора NaOH и 5 капель 5 %-ного раствора желе-
зосинеродистого калия до появления зеленовато-желтого окрашивания. 
Раствор энергично встряхивают, приливают 15 капель изобутилового 
спирта, снова встряхивают и дают отстояться до разделения слоев. Верх-
ний слой облучают ультрафиолетовыми лучами и наблюдают голубую 
флуоресценцию. 
2. Р е а к ц и я в о с с т а н о в л е н и я р и б о ф л а в и н а . Производные ри-
бофлавина (витамина В
2
) – ФАД и ФМН – являются простетическими 
группами окислительно-восстановительных ферментов, называемых фла-
виновыми ферментами. Участие рибофлавина в переносе электронов обу-
словлено его способностью легко восстанавливаться.
N
N
N
N
C
H
3
C
H
3
O
O
H
CH
2
(CHOH)
3
CH
2
OH
Zn + 2HCl
ZnCl
2
N
N
N
N
C
H
3
C
H
3
O
O
H
CH
2
(CHOH)
3
CH
2
OH
H
H
рибофлавин лeйкофлавин
При этом характерное желто-зеленое окрашивание раствора исчеза-
ет. Образующийся продукт реакции бесцветен. Окисленная и восстанов-
ленная формы рибофлавина различаются также по способности к флуорес-
ценции.
Ход исследования 
В пробирку наливают 10 капель 0,025 %-ного раствора рибофлавина 
и наблюдают флуоресценцию. Затем в пробирку добавляют 5 капель кон-

33 
центрированной HCl и опускают крупинку металлического цинка. Выде-
ляются пузырьки водорода, раствор постепенно теряет желто-зеленую 
окраску. Также исчезает флуоресценция раствора. Кусочек цинка осто-
рожно удаляют из пробирки стеклянной палочкой. Через 20–30 мин снова 
появляется желто-зеленая окраска, а затем и флуоресценция. 
3. К а ч е с т в е н н а я р е а к ц и я н а в и т а м и н РР. Витамин РР (ниацин, 
никотиновая кислота и никотинамид) является производным пиридинового 
кольца. В организме человека витамин РР находится в основном в связан-
ном с белками состоянии. Никотинамид входит в состав коферментов НАД 
(никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинук-
леотидфосфат), входящих в состав ферментов дегидрогеназ и участвую-
щих во многих окислительно-восстановительных реакциях. Недостаток 
витамина РР проявляется в виде дерматитов (пеллагра), расстройствах 
деятельности желудочно-кишечного тракта и нервной системы.
Каче-
ственное определение витамина РР основано на образовании плохо рас-
творимого синего осадка медной соли никотиновой кислоты при нагрева-
нии с раствором ацетата меди. 
Ход исследования 
В пробирку набирают 5 – 7 капель 3 %-ного раствора витамина РР, 
затем приливают 7–10 капель 5 %-ного раствора ацетата меди. Выдержи-
вают, не перемешивая, 2–3 мин, наблюдают выпадение осадка медной соли 
никотиновой кислоты. 
4 . 
Обнар ужение
никотинамидад ениндин уклеотида 
(НАД) в дрожжах . НАД, одним из компонентов которого является ни-
котинамид (витамин РР), встречается во многих органах и тканях человека, 
животных и растений, много его в микроорганизмах и грибах. Этот кофер-
мент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и 
может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с 
ацетоном. 
Ход исследования 
В пробирку помещают небольшой кусочек дрожжей (~0,5 г), измель-
чают, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20–30 с, затем фильтруют.
К 5–10 каплям полученного экстракта добавляют 3–5 капель ацетона и 1–2 
N
COOH
2
+
(CH
3
COO)
2
Cu
N
N
C
O
O
Cu O
C
O
+
2CH
3
COOH
никотиновая 
кислота
ацeтат мeди
никотинат мeди
N
COOH
2
+
(CH
3
COO)
2
Cu
N
N
C
O
O
Cu O
C
O
+
2CH
3
COOH
никотиновая 
кислота
ацeтат мeди
никотинат мeди

34 
капли 30 %-ного раствора едкого натра. Оставляют пробирку стоять 2 мин, 
затем добавляют 1 каплю фенолфталеина и по каплям концентрированную 
соляную кислоту до обесцвечивания раствора. Пробирку помещают на 
2 мин в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и про-
сматривают во флуориметре. Ацетоновый комплекс НАД флуоресцирует 
синим цветом. 
По каждому из проведенных экспериментов дать объяснение резуль-
татов и сделать соответствующие выводы. 
5. К а ч е с т в е н н а я р е а к ц и я на в и т а м и н В
6
. Группа витамина В
6
: 
пиридоксол, пиридоксаль и пиридоксамин, являющиеся производными пи-
ридина, носят общее название пиридоксин. 
N
C
H
3
O
H
CH
2
OH
CH
2
OH
N
C
H
3
O
H
C
CH
2
OH
O
H
N
C
H
3
O
H
CH
2
NH
2
CH
2
OH
пиридоксол пиридоксаль пиридоксамин
В организме каждое соединение может подвергнуться фосфорилиро-
ванию при участии АТФ с образованием коферментов фосфопиридоксаля 
и фосфопиридоксамина. Эти коферменты входят в состав ферментов, 
участвующих в белковом обмене (в реакциях трансаминирования, декар-
боксилирования, десульфирования, дегидратирования аминокислот), в об-
разовании витамина РР из триптофана и в некоторых других реакциях. Не-
достаток витамина В
6
в питании животных приводит к нарушению белко-
вого обмена, у человека авитаминоз В
6
встречается редко. 
Качественное определение основано на реакции взаимодействия пи-
ридоксина с хлорным железом, в результате которой образуется комплекс-
ная соль красного цвета (фенолят железа). 
Ход исследования 
На предметное стекло нанести стеклянной палочкой 1 каплю 1%-
ного раствора витамина В
6
и 1 каплю 1%-ного раствора хлорного железа и 
перемешивают. Развивается красное окрашивание. 
По каждому из проведенных экспериментов дать объяснение резуль-
татов и сделать соответствующие выводы. 
6 . Коли чес твенное опр еде ление вита мина С с 2,6-дихлор-
фенолиндофенолом (2,6-ДФИ) по методу Тильманса. Количественное 
определение аскорбиновой кислоты основано на ее способности окислять-
ся 2,6-ДФИ в дегидроаскорбиновую кислоту.

35 
O
O
O
H
OH
CH
2
OH
O
аскорбиновая 
кислота
O
OH
O
H
H
OH
CH
2
OH
O
дeгидроаскорбиновая 
кислота
окислeниe
восстановлeниe
Определение производят путем титрования исследуемой жидкости 
0,001 Н раствором 2,6-ДФИ в условиях, предохраняющих аскорбиновую 
кислоту от разрушения (кислая среда). 2,6-ДФИ в щелочной и нейтральной 
средах имеет синюю окраску, в кислой – красную, а при восстановлении 
обесцвечивается. 
Ход исследования 

жүктеу/скачать 1.21 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: