Тема: Основы рационального питания

56 
1:4 + 3 мл экстрагента органический слой 
удаляют; 
н-гексан 
- 
этилацетат (5:1); 
водный 
слой 
замораживают 
Э – 5 
ЦФ – 
10 
Э – продолжительность экстракции; ЦФ – продолжительность 
центрифугирования.
Ферментативный гидролиз осуществляется с использованием β-
глюкуронидазы из разных источников: Escherichia coli, Helix pomatia, Helix 
asperta 
и др. Сложноэфирная связь ТГК-кислота-глюкуронид хорошо 
подвергается ферментативному гидролизу, гидролизуются также и простые 
эфирные связи ТГК и гидроксилированных метаболитов с глюкуроновой 
кислотой, не разрушающиеся под воздействием щелочи. Эффективность 
ферментативного гидролиза зависит от активности фермента, рН среды, 
источника фермента.
Для изолирования каннабиноидов и их метаболитов из мочи методом 
ЖЖЭ наиболее часто используется смесь н-гексан - этилацетат (7:1), иногда 
используются смеси н-гексана с диэтиловым эфиром, изоамиловым спиртом, 
изооктаном. 
Описание методик, представляющих наибольший интерес представлено в 
таблице 14. 
Для изолирования нейтральных и слабоосновных компонентов 
экстракция из образца, подвергнутого гидролизу, осуществляется при значении 
рН 12-13, в органической фазе при этом обнаруживаются ТГК, КБ, КБД и 
гидроксилированные метаболиты. Водная фаза подкисляется до значения рН 4-
5 (в некоторых методиках до 2-3), экстрагируется тем же органическим 
экстрагентом для изолирования кислых каннабиноидов, прежде всего ТГК-
кислоты. 
Наиболее простая очистка в ходе ЖЖЭ включает экстракцию 
органическим растворителем, экстракцию в щелочную водную фазу, 
подкисление и последующую экстракцию органическим растворителем. 

57 
Однако, при этом возможно загрязнение экстрактов эндогенными 
соединениями. Важное значение имеет тщательное разделение водной и 
органической фаз в ходе ЖЖЭ, необходимо не допускать попадания даже 
крайне малых количеств воды в конечный органический экстракт. Для более 
эффективного разделения фаз в некоторых методиках рекомендуется 
использовать замораживание водного слоя – после экстракции и 
центрифугирования пробирки помещают в баню со смесью сухого льда и 
изопропанола, при этом органический слой легко отделяется.
Типовая методика изолирования ТГК-кислоты из мочи включает 
следующие стадии: 
1) Щелочной гидролиз; 
2) Экстракция н-гексаном на стадии гидролиза (очистка от основных и 
нейтральных веществ мочи); 
3) Подкисление до рН 2,0 (при ЖЖЭ) или 4,0-5,0 (при ТФЭ); 
4) Экстракция анализируемого вещества в двух вариантах:
А. С использованием ЖЖЭ. Экстракция смесью н-гексан (изооктан) - 
этилацетат (7:1); 
Б. С использованием ТФЭ. Проводится в патронах для ТФЭ – С
18
, Bond 
Elut 
и их аналогах. Элюирование ТГК-кислоты проводится смесью н-гексан - 
этилацетат (4:1); 
5) Упаривание при температуре не более 40
0
С. 
5) Дериватизация.
Одним из необходимых условий для проведения последующего ГЖХ-
анализа является дериватизация ТГК и ТГК-кислоты.
Основным способом дериватизации ТГК является ацилирование 
уксусным или пропионовым ангидридом. 
Для ТГК-кислоты возможны следующие варианты дериватизации: 
1) алкилирование алкилгалогенидами – метил-, этил- и пропилиодидами в 
сильнощелочной среде; 
2) алкилирование смесью тетраметиламмония хлорида и иодметана; 
3) силилирование – с применением N, O-бис (триметилсилил)-
трифторацетамида 
(БСТФА), 
N-
метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)-
трифторацетамида (МТБСТФА); 

58 
4) 
ацилирование 
перфторированными 
аналогами 
ангидридов 
алифатических кислот – с применением смеси пентафторпропионового 
ангидрида и гескафторизопропанола. 

жүктеу/скачать 1.35 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: