Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс 03. 00. 13 физиология

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование шкалы Комбса-Д`Алеси позволило выявить динамику неврологических способностей у крыс после ГИМ: значительные неврологические нарушения через 2 дня (резкое, на 80%, падение балла неврологического статуса) и восстановление исходного уровня способностей через 7 дней; полученные данные хорошо согласуются с литературными (Combs, D'Alecy, 1987; Mackensen et al., 2001a.). ФИМ продуцировала у крыс уже более стойкие нарушения: шкалы Гарсии и ОТНН выявляли их как через 24 ч (ухудшение неврологического статуса на 17% и 32%, соответственно), так и через 3 и 7 дней, что также хорошо согласуется с литературными данными (Garcia et al., 1995; Chen et al., 2001).

ГИМ замедляла обучение в водном тесте Морриса (ВТМ): крысы с ГИМ демонстрировали увеличенное время поиска, начиная со второго (при сравнении с ложнооперированными) или первого (при сравнении с интакными) дня обучения (p < 0,05 и ниже). В пробную попытку средняя скорость плавания у них была снижена (p < 0,004), что отражает определённое негативное влияние вызванных ишемией неврологических нарушений. Однако то, что крысы с ГИМ при этом ещё и значительно реже пересекали границы бывшего участка локализации платформы (p < 0,026), свидетельствует о нарушении у них механизмов пространственной памяти и ориентации, т.е. о когнитивных нарушениях. Сопоставление полученных данных с литературными (Pazos et al., 1999, Hartman et al., 2005) позволяет с определенностью заключить, что выявленные нарушения обучения в ВТМ, вызванные ГИМ, в наибольшей степени связаны именно с когнитивными нарушениями.

ФИМ также замедляла обучение ВТМ: крысы с ФИМ демонстрировали увеличенное время поиска платформы по сравнению с ложнооперированным и интакными контролями (p < 0,001). В пробную попытку у крыс с ФИМ наблюдалось увеличенное (p < 0,001) время поиска на периферии бассейна (тигмотаксис), сниженные точность локализации платформы (p < 0,02) и предпочтение целевого квадранта (p < 0,01); при этом по скорости плавания данная группа не отличалась от контрольных. Это подтверждает идею, что ФИМ вызывала нарушения когнитивных процессов; полученные данные хорошо согласуются с литературными (Markgraf et al., 1992; Roof et al., 2001).

Таким образом, использование выбранных неврологических тестов и пространственного водного теста Морриса было адекватно задаче исследования.

Влияние вживления и.ц.в. канюли и инфузии физраствора и креатина per se на неврологический статус и когнитивные способности крыс

Операция имплантирования и.ц.в. канюли сама по себе негативно сказывалась на неврологических способностях крыс даже через 72 ч (8,05±0,22 против 8,56±0,10 балла у интактных; p < 0,05). Инфузия р-ров дополнительно снижала неврологический статус: группы с инфузией физраствора (до 7,44±0,40) и 50 мМ р-ра Кр (6,70±0,50) статистически значимо отличались от интактных (p < 0,01 и p < 0,001, соответственно), но при этом не отличались друг от друга. При этом группа с Кр демонстрировала более высокий уровень нарушений, чем контроль с и.ц.в. канюлей без инфузии (p < 0,05). Это свидетельствует о некотором негативном эффекте Кр при его и.ц.в инфузии, факт, по нашим сведениям, ранее не отмеченный в литературе. Некоторый негативный эффект и.ц.в. инфузии физраствора и р-ра Кр, отмеченный через три дня после её начала, значительно уменьшался с течением времени: ослабевал через 7 и практически исчезал через 12 дней. Вместе с тем, продолжительная и.ц.в. инфузия физраствора или 50 мМ Кр не оказывала выраженного влияния на обучение крыс в ВТМ.

Профилактическая и.ц.в. инфузия 50 мМ Кр полностью предохраняла от неврологических нарушений, вызванных ГИМ (рис. 1). В то время, как у контроля с инфузией физраствора через 48 ч после ГИМ наблюдалось резкое ухудшение неврологических способностей (на 68%, с 7,44±0,40 до 2,38±0,88; p < 0,05), способности крыс с инфузией 50 мМ Кр (5,67±0,46 балла) были практически на том же уровне, что и до ишемии, т.е. значительно выше, чем у контроля (p < 0,05). Через семь дней после ГИМ возможный позитивный эффект инфузии 50 мМ Кр был замаскирован естественными процессами функционального восстановления. В то же время, профилактическое введение 100 мМ р-ра Кр, хотя несколько и снижало уровень неврологических нарушений через два дня после ГИМ (33% снижение балла, p > 0,37), но при этом замедляло восстановление на больших (через 7 дней) сроках (отличия между группами значимы, p < 0,02).

При обучении в ВТМ после ГИМ, крысы с предварительной инфузией 50 мМ р-ра Кр тратили статистически значимо меньшее время на поиск платформы, чем крысы с инфузией физраствора (p < 0,029, рис. 2) и демонстрировали большую точность локализации платформы в пробной попытке (p < 0,04). Такой положительный профилактический эффект и.ц.в. инфузии Кр на когнитивные способности после ГИМ был показан впервые. В то же время, профилактическое и.ц.в введение вдвое большей дозы Кр – 100 мМ уже не оказывало такого положительного действия, а напротив, имело тенденцию замедлять процессы пространственного обучения.

Контроль осмотических эффектов креатина

Предварительное и.ц.в. введение раствора глицерина не сказывалось на неврологических способностях крыс до ГИМ (8,33±0,71 балла, т.е. уровень интакных), но резко ухудшало их состояние через 48 ч после ГИМ (0,67±0,41 балла) и приводило к гибели большинства (88%) животных через 7 дней после ГИМ. Глицерин фактически блокировал обучение в ВТМ после ГИМ (рис. 2). Таким образом, и.ц.в. инфузия р-ра глицерина эквиосомолярного 50 мМ Кр оказывала разрушительное действие на неврологические и когнитивные способности крыс после ГИМ. Даже увеличение вдвое концентрации Кр оказывало значительно меньшее негативное влияние на обучение. Можно заключить поэтому, что выраженный позитивный эффект 50 мМ Кр не связан с его осмолярностью и, напротив, проявляется даже вопреки этому свойству. И, возможно, именно осмолярность раствора Кр ограничивает его профилактическую эффективность при ГИМ.

Показанная высокая эффективность Кр при предварительном введении в отношении неврологических и когнитивных способностей после ГИМ, хорошо согласуется с морфологическими данными, свидетельствующими о значительном снижении у этих же животных некротических изменений в зонах СА1, СА2, СА3 гиппокампа, зубчатой извилине, n. caudatus/putamen и неокортексе через 7 дней после ГИМ (Отеллин и др., 2002; Поленов и др., 2004; Balestrino et al., 2003; Lensman et al., 2006). Таким образом, Кр обладает высокой нейропротекторной эффективностью в отношении структур мозга, критических как для сенсомоторной координации, так и обучения и памяти.

Терапевтическая эффективность креатина

И.ц.в. инфузия 50 мМ Кр, инициированная через 30 мин после ГИМ, не оказывала выраженных позитивных эффектов в отношении неврологических нарушений и не облегчала когнитивные процессы. Более того, в группах с терапевтической парадигмой и.ц.в инфузии был отмечен повышенный уровень послеоперационной гибели животных (62% и 78% крыс, соответственно с инфузией физраствора и 50 мМ Кр; через 7 дней после ГИМ), превышающий обычный 30-40% уровень. Представляется вероятным, что отсутствие чётких эффектов Кр связано с негативным эффектом начала и.ц.в. инфузии, совпадающим в данном случае по времени с острой фазой развития ишемического поражения мозга, когда мозговые механизмы регуляции не могут справится с дополнительной нагрузкой объёмом, либо, в случае Кр, ещё и с высокой осмолярностью его раствора.

Рис. 1. Влияние предварительной интрацеребровентрикулярной (и.ц.в.) инфузии 50 мМ креатина на неврологический статус крыс после глобальной ишемии головного мозга (ГИМ). На горизонтальной оси отмечены номера тестирований: 1– за 1 день до ГИМ, 2 – через 2 дня и 3 – через 7 дней после ГИМ. Отличия между группами (ANOVA, тест Фишера) обозначены: ** – p<0,01. Рис. 2. Влияние предварительной (профилактической) интрацеребровентрикулярной (и.ц.в.) инфузии физраствора, 50мМ раствора креатина и эквиосмолярного ему раствора глицерина на обучение крыс в водном тесте Морриса после глобальной ишемии головного мозга. Отмечены статистически значимые отличия (ANOVA, тест Фишера) между группами глицерин и креатин: ** – p < 0,01 и *** – p < 0,001; и между группами физраствор и креатин: # – p < 0,05.

Новые производные Кр – БЭКр и ГЭКр оказались неспособны снизить негативный эффект ГИМ на обучение в ВТМ. Более того, ГЭКр отчасти усугублял последствия ГИМ. С другой стороны, ГЭКр, в отличие от БЭКр, обладал выраженным профилактическим эффектом в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ: более чем на 50% снижал их выраженность (через 2 дня после ГИМ). Однако такое его действие было всё же несколько менее выраженным, чем профилактическое действие 50 мМ Кр, полностью устранявшее негативное влияние глобальной ишемии.

Результаты гистологической оценки степени нейрональных поражений мозга этих же крыс, свидетельствуют о выраженном профилактическом нейропротекторном эффекте БЭКр, но не ГЭКр в отношении ГИМ (Balestrino, 2005). Такая ситуация несоответствия результатов неврологического и морфологического исследования неоднократно отмечалась в литературе (например, Mackensen et al., 2001). Учитывая результаты морфологического исследования и относительную нейтральность БЭКр (в отличие от негативных эффектов ГЭКр) в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ, можно предположить, что, прежде всего, БЭКр может рассматриваться как перспективный фармакологический агент для дальнейших исследований.

Профилактические и лечебные эффекты синтетических производных креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс

Глицериловый эфир креатина

В тестах шкалы ОТНН крысы с предварительным введением ГЭКр демонстрировали меньшую степень нарушений, чем контроль без инъекций в течение всех дней тестирования после индуцирования ФИМ (на 24% и 39% ниже через 1 и 7 дней). Некоторый лечебный эффект ГЭКр наблюдался уже по данным обеих шкал. После индуцирования ФИМ крысы с ГЭКр демонстрировали меньшие нарушения, чем контроль в каждом тестировании по шкале Гарсии (на 30, 60 и 40%) и через 3 и 7 дней (на 30 и 60%) после ФИМ в шкале ОТНН.

Предварительное введение ГЭКр не влияло на обучение в ВТМ при ФИМ. Однако введение ГЭКр после ФИМ благоприятно сказывалось на когнитивных процессах, связанных с обработкой пространственной информации при хронической ФИМ. Так, данные животные демонстрировали большую степень предпочтения целевого квадранта; значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис.3А) и чаще пересекали границы бывшего участка локализации платформы (рис.3Б).

Бензиловый эфир креатина

Предварительное введение БЭКр практически полностью предотвращало развитие неврологических нарушений у крыс при хронической ФИМ (рис. 4); после ФИМ их неврологический статус был на уровне ложнооперированных (p > 0,22) или интактных крыс. Терапевтическое введение БЭКр также обладало выраженным благоприятным действием: хотя хроническая ФИМ и вызывала некоторое ухудшение неврологических способностей у крыс с БЭКр, уровень нарушений у них был значительно меньшим, чем у контроля, а восстановление происходило быстрее. Через 1 и 3 дня крысы с БЭКр демонстрировали на 50% меньшее снижение неврологического статуса в тестах шкалы Гарсии (p > 0,18) и через 7 дней полностью восстановили пред-ишемический уровень способностей, в отличие от контроля (p < 0,05). По шкале ОТНН данные эффекты БЭКр были менее очевидны. В течение всего периода обучения в ВТМ крысы с предварительным введением БЭКр демонстрировали чёткую тенденцию тратить меньшее время на поиск платформы, чем контрольные животные. В пробную попытку они, в сравнении с контролем значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис.3А) и точнее локализовали бывший участок расположения платформы (рис.3Б). Хотя введение БЭКр после ФИМ не оказало заметного влияния на стадии обучения в ВТМ, анализ пробных попыток выявил у крыс данной группы сниженное, по сравнению с контролем, время поиска на периферии бассейна (рис.3А) и увеличенную точность поиска (рис.3Б).

Рис. 3. Влияние внутрибрюшинного (в/б) введения бензилового и глицерилового эфиров креатина (ГЭКр и БЭКр) на показатели поискового поведения крыс в пробной попытке (характеристики эффективности пространственного обучения в водном тесте Морриса) при хронической фокальной ишемии головного мозга (ФИМ). Статистически значимые отличия групп с профилактическим или лечебным введением препаратов от контроля с ФИМ но без введения препаратов (ANOVA, тест Фишера) отмечены: * – p < 0,05; *** – p < 0,001.

Рис. 4. Влияние предварительного внутрибрюшинного (в/б) введения бензилового эфира креатина (БЭКр) на неврологические нарушения, продуцируемые хронической фокальной ишемией головного мозга (ФИМ) у крыс. Неврологический статус крыс определялся в соответствии с: А.) – шкалой Гарсии (чем выше балл – тем лучше состояние); Б.) – шкалой ОТНН (чем ниже балл – тем лучше состояние). На горизонтальной оси отмечены номера тестирований: 1– за 1 день до ГИМ, 2 – через 1 день, 3 – через 3 и 4 – через 7 дней после ГИМ. Обозначения: * – p < 0,05; *** – p < 0,001 для межрупповых отличий (U-тест); ## – p < 0,01; ### – p < 0,001 для внутригрупповых отличий от исходного уровня группы ФИМ (критерий Вилкоксона).

ВЫВОДЫ

1. 
   Разработанные модификации моделей глобальной и фокальной ишемии головного мозга вызывают у крыс значительные и воспроизводимые неврологические и когнитивные нарушения.
   
2. 
   Вживление интрацеребровентрикулярной канюли, а также интрацеребровентрикулярная инфузия растворов per se оказывают неблагоприятное влияние на неврологический статус, хотя и не влияют на когнитивные функции крыс.
   
3. 
   Интрацеребровентрикулярное введение 50 мМ креатина, обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных у крыс глобальной ишемией головного мозга. Данные эффекты креатина не связаны с его высокой осмолярностью.
   
4. 
   Новое синтетическое производное креатина –– глицериловый эфир креатина при внутрибрюшинном введении обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических расстройств, вызванных глобальной ишемией мозга. При хронической фокальной ишемии внутрибрюшинное введение глицерилового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.
   
5. 
   Новое синтетическое производное креатина – бензиловый эфир креатина при внутрибрюшинном введении высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений при хронической фокальной ишемии мозга у крыс. Его профилактическое введение эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений и ослабляет когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией мозга. Терапевтическое введение, снижая выраженность неврологических нарушений, значимо ускоряет восстановление нормального уровня неврологических способностей и улучшает когнитивные способности при хронической фокальной ишемии мозга.
   
6. 
   Результаты данного исследования позволяют рекомендовать бензиловый эфир креатина для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса.
   

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. 
   Муровец В.О. Исследование протективного действия креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс // Тез. докл. Юбилейной конф. посвященной 50-летию со дня основания Института физиологии Национальной академии наук Беларуси. – Минск. – 2003. – С. 112-113.
   
2. 
   Муровец В.О., Ленцман М.В., Артемьева А.И., Золотарев В.А., Поленов С.А. Влияние креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Тез. докл. XIX съезда физиол. общ. им. И.П. Павлова, ч. 1. Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. – СПб. – 2004. Т. 90, № 8, Часть 1. – С. 360-361.
   
3. 
   Муровец В.О. Влияние креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Сборник материалов Всероссийской конф. молодых исследователей «Физиология и медицина 2005». Вестник молодых учёных (серия «Науки о жизни»). Приложение. СПб. – 2005. – С. 79.
   
4. 
   Mourovets V.O., Lensman M.V., Artemieva A.I., Zolotarev V.A., Polenov S.A. Effect of creatine treatment on behavioral consequences of global cerebral ischemia in rats // Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects». Saint-Petersburg. – 2005. P. 63-64.
   
5. 
   Polenov S.A., Lensman M.V., Balestrino M., Burov S.V., Otellin V.A., Yakutseni P.P., Artemieva A.I., Mourovets V.O., Izvarina N.L. Development of novel approach for prophylaxis and treatment of brain ischemia and stroke. Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects». Saint-Petersburg. – 2005. P. 72-73.
   
6. 
   Муровец В.О., Ленцман, М.В., Артемьева, А.И., Балестрино, М., Поленов, С.А. Креатин эффективен для профилактики неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной ишемией головного мозга у крыс. // Нейронауки. – 2006. – №. 1(3). – С. 20-23.
   
7. 
   Lensman M., Korzhevskii D., Mourovets V., Kostkin V., Izvarina N., Perasso L., Gandolfo C., Otellin V., Polenov S., Balestrino M. Intracerebroventricular administration of creatine protects against damage by global cerebral ischemia in rat // Brain Res. – 2006. – Vol. 1114. – P. 187-194.
   
8. 
   Ленцман М.В., Коржевский Д.Э., Муровец В.О., Артемьева А.И., Изварина Н.Л., Отеллин В.А., Якуцени П.П., Буров С.В., Балестрино М., Поленов С.А. Оригинально-разработанные препараты на основе креатина, способные предотвращать истощение запасов высокоэнергетических фосфатов в клетках при нарушениях кровоснабжения: новый патогенетический подход к профилактике и лечению ишемии мозга и инсультов // Тез. докл. Третьей международной научно-практической школы-конференции Медбиотек: «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине». – Москва. – 2006. – С. 56-58.
   
9. 
   Муровец В.О., Ленцман М.В., Артемьева А.И., Похвощева А.В., Буров С.В., Савохин А.А., Изварина Н.Л., Балестрино М., Поленов С.А. Бензиловый эфир креатина эффективен для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений при фокальной ишемии головного мозга у крыс // Тез. докл. Политехнического симпозиума «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона». – Санкт-Петербург. – 2006. – С. 171.
   

жүктеу/скачать 230.5 Kb.

Достарыңызбен бөлісу: